खाली पेट के गैर मोटे मधुमेह का उपयोग कर एक चूहे में मूल्यांकन [ Published: March 23, 2013 doi: 10.3791/50301

DOI

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Christopher T. Creedon¹, Pieter-Jan Verhulst¹, Kyoung M. Choi¹, Jessica E. Mason¹, David R. Linden¹, Joseph H. Szurszewski¹, Simon J. Gibbons¹, Gianrico Farrugia¹

¹Enteric Neuroscience Program, Department of Physiology and Biomedical Engineering, Mayo Clinic

Summary

खाली पेट के साथ एक गैर इनवेसिव निर्धारण [

Abstract

चूहों में गैस्ट्रिक खाली अध्ययन करने के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया तकनीकों जानवरों और भोजन ^1,2 के शवपरीक्षा वसूली की हत्या की आवश्यकता के बाद एक ही जानवर में गैस्ट्रिक खाली परिवर्तन का पालन करने में असमर्थता द्वारा सीमित किया गया है. इस दृष्टिकोण अनुदैर्ध्य अध्ययन से बचाता है उम्र और रोग की प्रगति के साथ खाली पेट में परिवर्तन का निर्धारण. आमतौर पर इस्तेमाल किया है. ^[13 सी] octanoic ³ मनुष्यों के लिए एसिड सांस परीक्षण ^4-6 चूहों और चूहों ⁷ में उपयोग के लिए संशोधित किया गया है और हम पहले से पता चला है कि इस परीक्षण दवाओं के जवाब में और के दौरान विश्वसनीय और खाली पेट में परिवर्तन करने के लिए उत्तरदायी है मधुमेह रोग प्रगति ^8. इस वीडियो प्रस्तुति में सिद्धांत और इस संशोधित परीक्षा के व्यावहारिक कार्यान्वयन में समझाया गया है. जैसा कि पिछले अध्ययन में, इशारा LtJ चूहों का इस्तेमाल कर रहे हैं, प्रकार 1 मधुमेह ⁹ के एक मॉडल. इन चूहों के एक अनुपात gastroparesis के लक्षण विकसित, Diabet की एक जटिलतातों ¹⁰ पेट के यांत्रिक बाधा के बिना देरी खाली पेट से होती है.

इस पत्र दर्शाता है कि कैसे परीक्षण के लिए चूहों को प्रशिक्षित करने के लिए, कैसे परीक्षण भोजन तैयार करने के लिए और 4 घंटा गैस्ट्रिक खाली डेटा और प्राप्त डेटा का विश्लेषण करने के लिए कैसे प्राप्त. कार्बन आइसोटोप वर्तमान अध्ययन में इस्तेमाल किया विश्लेषक से हवा के नमूनों का स्वत: नमूना लेने के लिए एक ही समय में 12 चूहों के लिए उपयुक्त है. इस तकनीक को खाली पेट के अनुदैर्ध्य पालन मधुमेह या अन्य लंबे समय से चली आ रही बीमारियों के साथ बड़े चूहों के समूह से की अनुमति देता है.

Introduction

इस पांडुलिपि तकनीकी और methodological चूहों में गैस्ट्रिक खाली की गैर इनवेसिव माप में शामिल विचार का वर्णन करता है. प्रोटोकॉल का पालन करके यहाँ वर्णित, जांचकर्ताओं और मज़बूती reproducibly गैस्ट्रिक में परिवर्तन करने के लिए इस रोग के विकास के कारण खाली का पालन कर सकते हैं, खाली पेट पर औषधीय एजेंटों के प्रभाव का अध्ययन करने और खाली पेट के अंतर्निहित रोग या ^6,8 दोष के इलाज के लिए जवाब का पालन ^{करें, 11,12.} पिछले प्रकाशनों में, ¹³ सी के आवेदन octanoic एसिड सांस परीक्षण मनुष्य और जानवरों ^3,8 में खाली पेट को मापने का एक उपयोगी तरीका होना दिखाया गया था इस पत्र में विस्तार से वर्णन है., 6 से 8 से अधिक विश्वसनीय आंकड़े प्राप्त करने के लिए आवश्यक प्रक्रियाओं मधुमेह के साथ चूहों में एक खाली पेट के अनुदैर्ध्य अध्ययन के लिए आवश्यक महीनों. इस प्रोटोकॉल के बाद जब पहले प्रकाशित तरीकों की तुलना में लाभ है कि अन्वेषक डेटा obtaine आश्वासन दिया जा सकता हैविश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हो जाएगा. इसके अलावा, इकट्ठा करने और गैस के नमूनों का विश्लेषण करने के लिए स्वचालित प्रणाली यहाँ वर्णित पशुओं की संख्या बढ़ जाती है कि एक अध्ययन में एक साथ पालन कर सकते हैं. कुल मिलाकर, इस कागज के लक्ष्य के लिए महत्वपूर्ण कारक है कि परीक्षण के लिए चूहों के habituation और कि प्राप्त परिणामों में परिवर्तनशीलता को कम बनाए रखने की पहचान है.

के लिए खाली पेट के vivo माप में, चूहों को रात भर उपवास कर रहे हैं और लगातार airflow के साथ पारदर्शी प्लास्टिक परीक्षण कक्षों में डाल दिया. बाद चूहों ट्यूबों को आदत हो, आधारभूत ¹³ सीओ exhaled _{2 के} स्तर को निर्धारित कर रहे हैं और airflow तदनुसार समायोजित. अगला, हम एक परीक्षण ¹³ सी लेबल octanoic एसिड के साथ मिश्रित अंडे की जर्दी से मिलकर भोजन प्रशासन. क्योंकि चूहों उपवास और प्रशिक्षित किया जाता है, वे आम तौर पर 2 मिनट के भीतर परीक्षण भोजन खाने. प्रशासित octanoic एसिड पेट में अवशोषित नहीं है लेकिन ग्रहणी में लिया जाएगा¹³ ₂ सीओ, जो जारी है और exhaled में जिगर में metabolized हो जाएगी, आसपास की हवा में ¹³ सीओ ₂ के एक संवर्धन में जिसके परिणामस्वरूप. हवा के नमूनों को निर्धारित समय के अंतराल पर एकत्र कर रहे हैं और कार्बन आइसोटोप विश्लेषक से विश्लेषण कर रहे हैं. दर सीमित इस पूरी प्रक्रिया में कदम खाली पेट और ¹³ के फेफड़े उत्सर्जन सीओ ₂ सीधे नामक भोजन के खाली पेट के साथ मेल खाती है.

1 चित्रा गैस्ट्रिक खाली तंत्र के योजनाबद्ध. रात भर उपवास के बाद, चूहों पारदर्शी उन्हें स्थानांतरित करने के लिए और करने के लिए स्वतंत्र रूप से बारी की अनुमति कक्षों में रखा जाता है. एक इनलेट ट्यूब ताजा और लगातार हवा बाढ़ की अनुमति देता है और एक दुकान आइसोटोप विश्लेषक के लिए सुराग के लिए ^{13 C-12} उपायमें सी अनुपात सांस exhaled. चैम्बर भी ^[13 सी] एसिड octanoic युक्त भोजन के वितरण के लिए एक केंद्रीय पोर्ट है.

Protocol

1. प्रशिक्षण और चूहे के habituation

1. विश्लेषण करने के लिए पहले, लगातार airflow के साथ 2-4 घंटे के लिए परीक्षण कक्षों में सभी चूहों के क्रम में उन्हें परीक्षण की स्थिति के लिए अभ्यस्त करना डाल दिया. यह स्पष्ट रूप से तनाव के स्तर को कम कर देता है कि अन्यथा देरी गैस्ट्रिक खाली की न्यायपालिका पता लगाने के कारण हो सकता है. चूहों के रूप में यदि खाली पेट प्रयोग चल रहा था उसी तरह समझो. Octanoic एसिड जोड़ने के बिना अंडे की जर्दी (आगे देखें) तैयार है और प्रत्येक माउस 0.2 जी फ़ीड.
2. इस प्रक्रिया को दोहराएँ जब तक चूहों पर्याप्त रूप से प्रशिक्षित किया जाता है (आम तौर पर 2-3 बार). चूहों आम तौर पर आसानी से लंबे समय के रूप में आदी रहे हैं पर्यावरण की स्थिति के रूप में ही रखा जाता है.

नोट: गैर आदी चूहों चैम्बर के हस्तांतरण के बाद के बारे में 1 घंटे के लिए चारों ओर ले जाने के लिए और ख़ारिज करना और अक्सर पेशाब, जबकि आदी चूहों जल्दी चुपचाप अपने नए वातावरण और बाकी हिस्सों में बस गए.

नहींते: प्रयोग के दौरान अतिरिक्त पेशाब, शौच, अंडा खाने में ब्याज की कमी के रूप में इस तरह के habituation के नुकसान के लक्षण के लिए मॉनिटर जानवरों. यदि यह मामला फिर से 1-2 बार गैस्ट्रिक खाली डेटा प्राप्त करने के लिए पहले एक खाली कक्ष में habituating पर विचार करें. स्थिरता अत्यंत महत्वपूर्ण है, जबकि इस प्रयोग कर रहे हैं. चीजों को ठीक उसी तरह कर हर समय विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त के लिए एक ही रास्ता है. यह हर दिन उपचार देने (जैसे इंसुलिन) एक ही समय में, उनके पिंजरे साथियों से चूहों को अलग नहीं जब तक बिल्कुल आवश्यक, चूहों उपवास और एक ही समय में खाली पेट परीक्षण शुरू, और चूहों से निपटने उसी तरह शामिल है.

2. टेस्ट आइसोटोप युक्त भोजन की तैयारी

1. एक 50 मिलीलीटर बाज़ ट्यूब में अंडे की जर्दी के 5 ग्राम वजन के साथ शुरू करो. इन चरणों का एक ताजा परीक्षण भोजन तैयार करने के लिए एक प्रायोगिक दिन दोहराएँ.
2. एक concentr साथ octanoic एसिड के 10 μl जोड़ें2 μl / 50 मिलीलीटर बाज़ अंडा युक्त ट्यूब जी के व्यावहारिक और बाज़ ट्यूब में एक रंग के साथ 1 मिनट के लिए सख्ती मिश्रण.
3. अंडा तो एक गिलास बीकर के लिए स्थानांतरित कर रहा है और एक लैम्प बर्नर पर गर्म जब तक यह coagulates और इसकी स्थिरता छोटी गेंदों बनाने के लिए उपयुक्त है. यह आमतौर पर के बारे में 30 सेकंड लेता है.

नोट: अंडे की जर्दी की गेंदों माउस प्रति 0.2 जी गौर करना चाहिए. सभी चूहों में संचयी खुराक को स्थिर रखने के लिए यह महत्वपूर्ण है.

3. प्रयोग प्रारंभ

1. एक बार प्रशिक्षित और खाली पेट के लिए तैयार है, तेजी से चूहों जाल नीचे एक धातु "" उपवास coprophagia रोकने के रैक पर रात (12 घंटे). सुनिश्चित करें कि वे पीने के पानी के लिए नि: शुल्क उपयोग कर सकते है. मधुमेह चूहों वर्तमान प्रयोग में किया जाता है, वे अधिक से अधिक 16 घंटे के लिए नहीं उपवास करना चाहिए.
2. गैस्ट्रिक खाली कक्षों की स्थापना के द्वारा शुरू करो. साफ संगठनों को शामिल किया गया और है कि एयर सूखे किया गया है का उपयोग करें. इसके अलावा, किसीविश्लेषक या सीओ ₂ हवा की आपूर्ति करने के लिए कक्षों को जोड़ने ट्यूबों नमी मुक्त किया जाना चाहिए, पानी विश्लेषक द्वारा पढ़ा संकेत के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं
3. इनलेट ट्यूबों कि एक निरंतर हवा का प्रवाह प्रदान करने के लिए कक्षों से कनेक्ट करें. तो कक्षों से आउटलेट ट्यूबों मशीन से कनेक्ट. ट्यूब बंद करो और airflow पर बारी.

नोट: कवर lids के अंत में वेसिलीन की एक बहुत छोटी राशि लागू होते हैं, इसलिए वे आसानी से बंद कर रहे हैं और सुरक्षित सील. इस तंग सील सभी कार्बन डाइऑक्साइड चूहों द्वारा उत्पादित इकट्ठा करने के लिए आवश्यक है.

4. प्रायोगिक प्रक्रिया

1. प्रत्येक माउस वजन करके बाहर शुरू. शरीर का वजन उनके सतत अच्छे स्वास्थ्य के एक उपाय है. फिर उपयुक्त कक्ष में प्रत्येक माउस जगह है. यह निश्चित रूप से महत्वपूर्ण इस समय हवा कक्षों में बह रही है.
2. माप शुरू, चूहों को समायोजित पहले कक्षों के लिए acclimate करने के लिए अनुमति देते हैंहवा के स्तर आईएनजी.
3. एक बार चूहों शांत दिखाई देते हैं, जो एक कुछ मिनट लग, प्रत्येक माउस चैम्बर के लिए हवा का प्रवाह दर को समायोजित हो सकता है. यह एक माउस के लिए अलग अलग हो सकता है. आमतौर पर, वायु प्रवाह प्रयोग की शुरुआत में समायोजित किया जाता है यकीन है कि सीओ ₂ exhaled जो भी उपकरण का इस्तेमाल किया जा रहा है द्वारा detectable स्तर तक पहुँचता है, और लगता है कि का स्तर काफी कम करने के लिए स्वस्थ हवा कारोबार सुनिश्चित रहता है. हम 1,000 और 1,500 मिलियन प्रति भागों के बीच प्रारंभिक सीओ _{2 के} स्तर का उपयोग करें.
4. यदि समायोजन के साथ कठिनाई हो रही है, हवा लीक के लिए जाँच करें. तो कक्षों में से प्रत्येक के लिए इस प्रक्रिया को दोहराने और माप के दूसरे दौर के लिए देखने के लिए अगर airflow को किए गए समायोजन सीओ _{2 के} स्तर पर सही है. यह एक स्थिर आधारभूत चूहों को खिलाने के लिए पहले पढ़ने को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है. हम एक आत्म अंशांकन सुविधा के साथ एक मशीन का उपयोग करें. अगर कोई नहीं है इस मामले अंशांकन जाँच की जानी चाहिए.
5. जब इस हासिल की है, अंडा भोजन प्रशासनपहले माउस और रिकार्ड समय प्रत्येक माउस भोजन प्राप्त करता है.
6. हम 4 घंटा के लिए प्रक्रिया को चलाने के लिए ¹³ सीओ ₂ प्रत्येक माउस के लिए संवर्धन वक्र फिटिंग के लिए पर्याप्त मान प्राप्त है. चूहों पर यकीन है कि सीओ ₂ का स्तर अभी भी चूहों के लिए सुरक्षित कर रहे हैं बनाने के लिए हर 30-60 मिनट की जाँच करें.
7. परीक्षण इतना खाने चूहों शुरू परीक्षण के तत्काल बाद खत्म हो गया है के अंत से पहले नई भोजन युक्त बक्से तैयार.

Representative Results

एक प्रतिनिधि तीन अलग चूहों से डेटा सेट चित्रा 2 में दिखाया गया है. काले ग्राफ सामान्य खाली पेट के साथ एक माउस से डेटा बिंदुओं का प्रतिनिधित्व करता है. यह ¹³ सी कि exhaled प्रति घंटे प्रशासित खुराक समय के एक समारोह के रूप में व्यक्त की एक प्रतिशत के रूप में व्यक्त की हवा में बरामद किया है के अंश से पता चलता है. नीले वक्र एक त्वरित 40 मिनट और लाल वक्र के एक टी आधा मूल्य के साथ खाली गैस्ट्रिक साथ एक माउस से 168 मिनट की एक टी आधा मूल्य के साथ एक देरी खाली पेट के साथ एक माउस से है. के रूप में हमारे ⁷ प्रयोगशाला, सामान्य एक इशारा गैर मधुमेह माउस उम्र के लिए गैस्ट्रिक आधा खाली समय में पिछले एक अध्ययन में स्थापित 62 से 131 मिनट के लिए 9-15 सप्ताह पर्वतमाला के रूप में ग्रे बॉक्स द्वारा प्रतिनिधित्व. डेटा बिंदुओं तो निम्नलिखित ⁸ समीकरण के साथ एक गैर रेखीय प्रतिगमन वक्र द्वारा लगाये गये हैं:

y = ^b ई ^{- सीटी}

जहां वाई का प्रतिशत है (1 टी _{/ 2)}

एक संख्यात्मक एकीकरण प्रक्रिया से एक व्युत्क्रम गामा समारोह का उपयोग कर की गणना की थी. हम के बारे में 10% की एक जैविक अंतर माउस परिवर्तनशीलता साथ कई हजार अध्ययन से परिणाम प्राप्त किया है.

चित्रा 2. सामान्य के साथ तीन अलग चूहों (काले वक्र), देरी (लाल वक्र) और त्वरित (नीले वक्र) खाली पेट से प्रतिनिधि गैस्ट्रिक खाली ग्रे बॉक्स डेटा. सामान्य मूल्यों पर प्रकाश डाला गया है. गैर रेखीय प्रतिगमन घटता के समीकरण बॉक्स में दिखाया गया है.

Discussion

वर्णित तकनीक के साथ साथ दोहराया और चूहों में ठोस खाली पेट के vivo माप में गैर इनवेसिव के लिए अनुमति देता है. इस प्रणाली के लाभ यह है कि जानवरों माप चैम्बर में नहीं रोका जाता है, उन्हें स्थानांतरित करने के लिए और करने के लिए स्वतंत्र रूप से बारी करने की अनुमति देता है. चूंकि यह एक अपरिचित माहौल है, चूहों को अभी भी करने के लिए प्रशिक्षित किया है और परीक्षण कक्ष में आदी खाली पेट पर तनाव के प्रभावों को रोकने की जरूरत है. सामान्य में, हम मान खाली पेट डेटा विश्वसनीय हैं अगर लगातार गैस्ट्रिक खाली परीक्षण के बीच अंतर माउस परिवर्तनशीलता कम से कम 10% है.

इस रिपोर्ट ^8,11,12 चूहों में गैस्ट्रिक खाली माप पर हमारी पिछली रिपोर्टों के एक अधिक विस्तृत वर्णन है और मुसीबत शूटिंग प्रणाली के साथ समस्याओं के बारे में अतिरिक्त जानकारी शामिल है. मुख्य संशोधन LGR आइसोटोप विश्लेषक की गैस के स्तर को मापने के लिए इस्तेमाल होता है. विश्लेषक हम वर्तमान अध्ययन में इस्तेमाल ¹² सीओ के उपाय 13 ₂ सीओ, और एच ₂ हे सांद्रता हर 2. कई निवेश इकाई में कंप्यूटर नियंत्रित वाल्व स्वतः माउस कोठरियों के बीच हर 25 सेकंड डिटेक्टर से प्रवाह स्विच. इसलिए 12 चूहों को एक साथ एक रीडिंग के बीच 5 मिनट के अंतराल के साथ विश्लेषण किया जा सकता है. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि डेटा भी हवा exhaled और बाद के विश्लेषण के मैनुअल नमूना द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. यदि मैन्युअल नमूना या अन्य डिवाइस का उपयोग कर, यकीन है कि रीडिंग के बारे में 10 मिनट के अंतराल पर प्राप्त कर रहे हैं. हमारी प्रणाली और नमूना संग्रह की आवृत्ति की संवेदनशीलता का मतलब है कि खाली पेट घटता और अधिक विश्वसनीय, आसान करने के लिए फिट है और इसलिए हमने पाया है कि हम इस बेहतर विधि के साथ और अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डेटा प्राप्त कर रहे हैं.

इस तकनीक के लिए प्रमुख नुकसान हो जब चूहों के लिए आवंटित समय के भीतर भोजन खाते हैं, जब चूहों कक्ष उनके habituation खो और जब तकनीकी समस्याओं का पता लगाने SYS के साथ उत्पन्न होती विफलमंदिर. आमतौर पर विफलता के लिए भोजन और habituation की हानि खाने के बाद परीक्षण के लिए एक नियमित कार्यक्रम होने के महत्वपूर्ण कदम नहीं की एक परिणाम हैं. लगातार 3 परीक्षण के बाद 7 दिन या उससे कम समय के द्वारा अलग, हमारे चूहों का परीक्षण करने के लिए आदी हो जाते हैं और खाना खाते हैं. एक बार आदी, विश्वसनीय आंकड़े प्राप्त कर रहे हैं अगर चूहों हर 2 सप्ताह में एक बार कम से कम प्रयोग के शेष के लिए परीक्षण कर रहे हैं. यदि किसी कारण के लिए चूहों 3 या उससे अधिक सप्ताह के लिए किया गया परीक्षण नहीं किया है तो एक सप्ताह के भीतर दो प्रशिक्षण सत्र आमतौर पर आदी होना सुनिश्चित करेगा. यदि पशुओं को संभालने कर्मियों तो बदल चूहों के पुन: प्रशिक्षण की सलाह दी है और यह विशेष रूप से चूहों से निपटने के लोगों द्वारा जोरदार सुगंधित साबुन और / या इत्र के उपयोग को हतोत्साहित करने के लिए महत्वपूर्ण है. पता लगाने की प्रणाली के साथ कठिनाइयाँ अक्सर ¹³ ₂ एक चूहे की तरह एक छोटे जानवर द्वारा उत्पन्न सीओ के निम्न स्तर के कारण कर रहे हैं. डिटेक्टर और इन्फ्रा - रेड आधारित प्रणालियों जैसे कुछ डिटेक्टरों के लिए calibrated किया जाना चाहिए, यह बहुत छोटा सा भूत हैortant के लिए एक माप करने से पहले कम से कम करने के लिए नमूने के पानी की मात्रा को कम.

इस तकनीक के लिए कुछ सीमाएं हैं जब तक अन्वेषक के लिए हर बार की तुलना में एक ही माउस में 3 दिन खाली पेट अधिक बार अध्ययन करना चाहता है. यह तेजी से माउस के लिए नहीं तो अक्सर सलाह दी जाती है और एक नियमित आधार पर इस तरह के आहार प्रतिबंध गैस्ट्रिक समारोह को बदल सकते हैं. तकनीक के लिए संशोधन करने के लिए तरल खाली पेट को मापने के लिए बनाया जा सकता है और कहा कि विधि का एक उपयोगी संभावित आवेदन है.

Scintigraphy सहित या मापने खाली पेट, को मापने के लिए अन्य तरीकों सामग्री बनाए रखा के बाद एक निश्चित समय सहित प्रक्रिया के तनाव के साथ मुद्दों या करने के लिए प्रत्येक परीक्षा के अंत में पशु को मारने की जरूरत की वजह से काफी अधिक सीमाएं हैं. तनाव परीक्षण या माप के दौरान पशु के संयम भोजन नलिका - पोषण शामिल हैं. सांस परीक्षण के लाभ कर रहे हैं कि माउस को स्वतंत्र रूप से और बढ़ रहा है anesthetizedया किसी भी तरह से बेहोश है.

सारांश में, ¹³ एसिड सी octanoic सांस परीक्षण उम्र और उपचार और इन आंकड़ों के साथ प्रगति की बीमारी के अध्ययन की अनुमति देता है तो अन्य शारीरिक मापदंड में वही जानवर में और histological मूल्यांकन परिवर्तन के साथ सहसंबद्ध किया जा सकता है. आवेदन पत्र के अलावा अन्य परीक्षण भी कैसे दवाओं सीधे खाली पेट के रूप में जानवरों है कि खाली पेट में परिवर्तन बीमारी या अन्य उपायों के कारण विकास में उपचार के जवाब की जांच के रूप में अच्छी तरह से बदल सकते हैं अध्ययन की अनुमति देता है.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
A source of constant air-supply, flow as well as composition	central air supply in the research facility
130 ml sampling chamber that has air inlet, air outlet, and food administration opening Plastic tubes for air supply	In-house built
Octanoic acid	Cambridge isotope laboratories (Andover, MA)	CLM-293-1
To prepare the egg meal: small beaker 50 ml plastic tube Bunsen burner egg spatula	Any supplier		Try to be consistent with the egg supplier since the nutritional content and palatability of the eggs can affect ingestion and gastric emptying of the meal
Carbon dioxide isotope analyzer	Los Gatos Research Inc. (Mountain View, CA)