Vurderingen av magetømmingen i ikke-overvektige diabetikere mus Bruke en [ Published: March 23, 2013 doi: 10.3791/50301

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Christopher T. Creedon¹, Pieter-Jan Verhulst¹, Kyoung M. Choi¹, Jessica E. Mason¹, David R. Linden¹, Joseph H. Szurszewski¹, Simon J. Gibbons¹, Gianrico Farrugia¹

¹Enteric Neuroscience Program, Department of Physiology and Biomedical Engineering, Mayo Clinic

Summary

Bestemmelse av gastrisk tømming med en ikke-invasiv [

Abstract

Magetømmingen studier på mus har vært begrenset av den manglende evne til å følge magetømmingen endringer i samme dyr siden de mest brukte teknikker krever dreping av dyrene og postmortem utvinning av måltidet ^1,2. Denne tilnærmingen forhindrer longitudinelle studier for å oppfatte endringer i ventrikkeltømming med alder og progresjon av sykdommen. De brukte ^[13 C]-oktansyre pusteprøve for mennesker ³ har blitt modifisert for bruk i mus ^4-6 og rotter ⁷ og vi tidligere viste at denne testen er pålitelig og reagerer på endringer i magetømmingen i narkotikatiltakene og under diabetessykdommen progresjon ^8. I denne videoen presentasjon prinsippet og praktisk gjennomføring av dette modifiserte testen er forklart. Som i forrige undersøkelse, er NOD LTJ mus brukt, en modell av type 1 diabetes ^9. En andel av disse mus utvikler symptomer på gastroparese, en komplikasjon av Diabetes karakterisert ved forsinket ventrikkeltømming uten mekanisk hindring av magen ^10.

Denne avhandlingen viser hvordan du kan trene musene for testing, hvordan å forberede testen måltid og få fire timers ventrikkeltømming data og hvordan å analysere datamaterialet. Den karbonisotopforholdet analysator brukt i denne undersøkelsen er egnet for automatiske prøvetaking av luftprøver fra opptil 12 mus samtidig. Denne teknikken gjør at langsgående oppfølging av magetømmingen fra større grupper av mus med diabetes eller andre langvarige sykdommer.

Introduction

Dette manuskriptet beskriver de tekniske og metodiske hensyn som er involvert i ikke-invasiv måling av magetømmingen i mus. Ved å følge protokollen beskrevet her, kan etterforskere pålitelig og reproduserbart følge endringer i ventrikkeltømming grunn for utvikling av sykdom, studere virkningen av farmakologiske midler på gastrisk tømming og følge responsen av magetømmingen til behandling av underliggende sykdommer eller defekter ^{6,8, 11,12.} I tidligere publikasjoner, anvendelsen av ¹³ C oktansyre pusten tester ble vist å være en nyttig måte å måle magetømmingen hos mennesker og dyr ^3,8. Dette dokumentet beskriver i detalj, de prosedyrer som er nødvendige for å oppnå pålitelige data over 6-8 måneder som er nødvendige for en longitudinell studie av magetømmingen i mus med diabetes. Fordelene med å følge denne protokollen i forhold til tidligere publiserte metoder er at de etterforsker kan være trygg på data obtained vil være pålitelig og reproduserbar. I tillegg, den automatiserte system for innsamling og analyse av gassprøver beskrevet her øker antall dyr som kan følges samtidig i en studie. Totalt sett er målet med denne artikkelen å identifisere de viktigste faktorene som opprettholder tilvenning av musene til test og som reduserer variasjon i oppnådde resultater.

For in vivo måling av magetømmingen, er mus fastet over natten og satt til transparente plast testkamre med konstant luftstrøm. Etter musene får habituated til rørene, utåndet baseline ¹³ CO ₂ nivåer bestemmes og luftstrøm justert tilsvarende. Neste, administrere vi et testmåltid bestående av eggeplomme blandet med ¹³ C-merket oktansyre. Fordi mus fastet og trent, de vanligvis spiser testen måltid innen 2 min. Den administrerte oktansyre ikke absorberes i magen, men vil bli tatt opp i tolvfingertarmen end vil bli metaboliseres i leveren til ¹³ CO _2, som er utgitt og pustet, noe som resulterer i en berikelse av ¹³ CO ₂ i luften. Luftprøver samles inn ved bestemmes tidsintervaller og analyseres av karbonisotopforholdet analysator. Det hastighetsbegrensende trinn i hele denne prosessen er magetømmingen og lunge utskillelse av ¹³ CO ₂ direkte korresponderer med magetømmingen av den merkede måltidet.

Figur 1. Skjematisk av magetømmingen apparat. Etter overnatting fasting, er mus plassert i gjennomsiktige kamre som tillater dem å bevege seg og slå seg fritt. Et innløpsrør tillater frisk og konstant luft innstrømning og et utløp fører til isotopen analysator for å måle ^13C-til-12C forholdet i utåndet pust. Kammeret har også en sentral port for levering av mat som inneholder ^{[13C]-oktansyre.}

Protocol

1. Opplæring og Tilvenning av mus

1. Før analyse sette alle mus i testkamre for 2-4 timers med konstant luftstrøm for å tilvenne dem til testing forhold. Dette reduserer markant stressnivå som ellers forårsaker avvikende påvisning av forsinket ventrikkeltømming. Behandle mus på samme måte som om den magetømming eksperimentet utføres. Forbered eggeplomme (se videre) uten å legge oktansyre og mate 0,2 g til hver mus.
2. Gjenta denne prosessen til musene er tilstrekkelig trent (vanligvis 2-3 ganger). Musene typisk lett habituated så lenge miljøforholdene holdes det samme.

Merk: Ikke-tilvente mus fortsette å flytte rundt i ca 1 time etter overføring til kammeret, og defekt og urinere ofte, mens habituated mus raskt bosette seg i sitt nye miljø og hvile rolig.

Ingente: Under eksperimentet: Monitor dyr for tegn på tap av tilvenning som overflødig vannlating, avføring, mangel på interesse for å spise egg. Hvis dette er tilfelle Vurder re tilvenne i et tomt kammer 1-2 ganger før innhenting magetømmingen data. Konsistens er svært viktig mens du gjør dette eksperimentet. Gjøre ting på akkurat samme måte hver gang er den eneste måten å få pålitelige og reproduserbare resultater. Dette inkluderer å gi behandling (f.eks insulin) hver dag på samme tid, ikke skille musene fra sine bur-mates med mindre absolutt nødvendig, fasting musene og starte magetømmingen test på samme tid, og håndtering musene på samme måte.

2. Forberedelse av isotopen som inneholder Test Meal

1. Start med veier ut 5 g eggeplomme i en 50 ml falk rør. Gjenta disse trinnene hver eksperimentell dag til å forberede en ny test måltid.
2. Tilsett 10 pl av oktansyre med konsentrasjonerasjon av 2 ul / g til 50 ml falk røret som inneholder egg og bland kraftig i 1 min med en slikkepott i falk røret.
3. Egget blir så overført til et begerglass og varmet opp over en Bunsen-brenner inntil den koagulerer og dens konsistens er egnet for å gjøre små kuler. Dette tar vanligvis 30 sek.

Merk: baller av eggeplomme bør veie 0,2 g per mus. Dette er viktig for å holde den kumulative dosen konstant i alle musene.

3. Starte Experiment

1. Når trent og klar for ventrikkeltømming, rask musene natten (12 timer) på en metall "mesh-bunn" faste stativ for å hindre Coprophagia. Sørge for at de har fri tilgang til drikkevann. Siden diabetiske mus brukes i nåværende eksperimentet, bør de ikke fastet i mer enn 16 timer.
2. Start med å sette opp magetømmingen kamre. Bruk rene kamre og deksler som er stemt lufttørket. Også noenrør forbinder kamrene til analysatoren eller CO ₂ lufttilførselen bør være fuktighetsfri, vann kan forstyrre signalet leses av analysatoren
3. Koble kamrene rørene som gir en konstant luftstrøm. Deretter kobler uttaket rør fra kamrene til maskinen. Lukk rørene og slå på luftstrømmen.

Merk: Påfør en liten mengde av vaselin på slutten av Dekklokk slik at de lukker enkelt og sikkert forseglet. Denne tette forsegling er nødvendig for å samle alle karbondioksid produsert av musene.

4. Eksperimentelle prosedyrer

1. Start ut ved å veie hver mus. Kroppsvekt er et mål på deres vedvarende god helse. Legg deretter hver mus i den aktuelle kammeret. Det er selvfølgelig viktig å ha luft strømmer inn i kamrene på dette tidspunktet.
2. For å starte målingen, la musene å akklimatisere seg til kamrene før justereing luften nivåer.
3. Når musene vises rolig, noe som kan ta noen minutter, justere luftmengden for hver mus kammer. Dette kan være forskjellig for hver mus. Vanligvis er luftstrømmen justeres ved begynnelsen av eksperimentet å sørge for at utåndet CO ₂ når nivåene registreres av det utstyret som blir brukt, og å sørge for at nivået holder seg lav nok til å sikre sunn luft omsetning. Vi bruker første CO ₂ nivåer mellom 1000 og 1500 deler per million.
4. Hvis det å ha problemer med justeringer, se etter luftlekkasjer. Deretter gjenta prosessen for hver av kamrene og se etter en ny runde av målinger for å se om justeringer er gjort i luftstrømmen har korrigert CO ₂ nivå. Det er viktig å oppnå en jevn baseline lesing før mate musene. Vi bruker en maskin med en selvkalibrering funksjonen. Hvis dette ikke er tilfelle kalibrering bør kontrolleres.
5. Når dette er oppnådd, administrere egget måltidettil den første musen og ta tiden hver mus får maten.
6. Vi kjører prosedyren for 4 hr å skaffe nok verdier for å feste ¹³ CO ₂ berikelse kurve for hver mus. Sjekk på musene hver 30-60 min å sørge for at CO ₂ nivåer er fortsatt trygt for mus.
7. Forbered nye bokser inneholdende mat før slutten av testen slik at musene kan begynne å spise umiddelbart etter testen er over.

Representative Results

En representant datasett fra tre forskjellige mus er vist i figur 2. Den svarte grafen representerer datapunktene fra en mus med normal ventrikkeltømming. Det viser den brøkdel av ¹³ C som er gjenfunnet i utåndet luft uttrykt som en prosentandel av den administrerte dosen per time uttrykt som en funksjon av tiden. Den blå kurven er fra en mus med en akselerert ventrikkeltømming med en T halv verdi på 40 min og den røde kurven er fra en mus med en forsinket gastrisk tømming med en T halv verdi av 168 min. Som etablert i en tidligere studie i vår ⁷ lab, normal mage halvdel tømming tid for en ikke-diabetiker NOD mus alder 9-15 uker spenner 62-131 min representert ved den grå boksen. Datapunktene blir deretter monteres av en ikke-lineær regresjon kurve med følgende ligning ^8:

y = ved ^{b e-ct}

Hvor y er andelen av 1/2)

beregnes ut fra et numerisk integrasjon prosedyren med en invers gammafunksjonen. Vi har resultater fra flere tusen studier med en biologisk intra-mus variasjon av ca 10%.

Figur 2. Representative ventrikkeltømming data fra tre forskjellige mus med normal (svart kurve), forsinket (rød kurve) og akselerert (blå kurve) ventrikkeltømming. Den grå boksen fremhever normale verdier. Ligningen av de ikke-lineære regresjon kurvene er vist i boksen.

Discussion

Den beskrevne teknikk gjør heri for gjentatt og ikke-invasiv in vivo måling av faststoff gastrisk tømming hos mus. Dette systemet har den fordel at dyrene ikke er sikret i målekammeret, som tillater dem å bevege seg og rotere fritt. Siden dette er et ukjent miljø, musene fortsatt trenger å bli trent og tilvent de testkamre å hindre effekten av stress på mage tømming. Generelt, antar vi er de magetømming data pålitelig dersom intra-mus variasjon mellom påfølgende ventrikkeltømming tester er mindre enn 10%.

Denne rapporten er en mer detaljert beskrivelse av våre tidligere rapporter om ventrikkeltømming målinger i mus ^8,11,12 og inkluderer ytterligere informasjon om å løse problemer med systemet. Den viktigste endringen er bruken av LGR isotopen analysator for måling gass nivåer. Analysatoren vi brukte i denne studien måler ¹² CO 13 ₂ CO og H ₂ O konsentrasjoner hvert sekund. De datastyrte ventiler i multiple-input enhet automatisk strømme til detektoren mellom mus kamre hver 25 sek. Derfor 12 mus kan samtidig analyseres med en 5 min intervall mellom målingene. Det må bemerkes at dataene kan også oppnås ved manuell prøvetaking av utåndet luft og etterfølgende analyse. Hvis manuelt prøvetaking eller ved hjelp av en annen enhet, må du passe målinger oppnås ved ca 10 minutters mellomrom. Sensitiviteten av vårt system og hyppigheten av prøvetaking betyr at magetømming kurvene er mer pålitelige, lettere å montere og så har vi funnet at vi får mer reproduserbare data med dette forbedret fremgangsmåte.

De største fallgruvene i denne teknikken skje når musene ikke klarer å spise måltid innen den avsatte tiden, da musene mister sin tilvenning til kammeret og når det oppstår tekniske problemer med påvisning system. Unnlatelse av å spise måltidet og tap av tilvenning er vanligvis en konsekvens av ikke å følge den kritiske trinnet av å ha en vanlig tidsplan for testing. Etter 3 påfølgende tester atskilt med 7 dager eller mindre, blir våre mus habituated på prøve og spise måltidet. Når venne seg til, er pålitelige data oppnås dersom musene er testet minst en gang hver 2 uker for resten av forsøket. Hvis noen grunn musene ikke har blitt testet for 3 eller flere uker deretter to treningsøkter innen en uke vil vanligvis sikre tilvenning. Dersom personellet som håndterer dyrene endrer deretter re-opplæring av musene anbefales, og det er spesielt viktig å hindre bruk av sterkt parfymerte såper og / eller parfyme av folket som håndterer mus. Vanskeligheter med deteksjonssystem er ofte på grunn av lave nivåer av ¹³ CO ₂ som genereres av et lite dyr som en mus. Detektoren må kalibreres og for noen detektorer som infrarøde baserte systemer, er det svært important å redusere vann-innholdet i prøven til et minimum før målinger.

Det er få begrensninger til denne teknikken med mindre etterforsker ønsker å studere magetømming oftere enn en gang hver 3 dager i samme mus. Det er ikke tilrådelig å spole musen så ofte og så kosttilskudd begrensning på regelmessig basis kan endre mage funksjon. Modifikasjoner til teknikken kan bli gjort for å måle væske magetømmingen og det er et nyttig potensiell anvendelse av metoden.

Andre metoder for måling av magetømmingen, herunder scintigrafi eller måling beholdt innhold etter en fast tid har betydelig flere begrensninger inkludert problemer med stress av prosessen eller på grunn av behovet for å avlive dyret ved slutten av hver test. Stressors inkluderer gavage av testmåltid eller tvang av dyret under målingen. Fordelene av pustetest er at musen er fritt bevegelige og ikke bedøveteller bedøvet på noen måte.

Oppsummert tillater ¹³ C-oktansyre pustetest studiet av sykdomsprogresjon med alder og behandling og disse dataene kan deretter korreleres med endringer i andre fysiologiske parametere og histologisk evaluering i samme dyr. Blant andre bruk tillater testen også studiet av hvordan medikamenter kan direkte endre magetømming samt undersøke responsen på behandlingen i dyr som utvikler endringer i gastrisk tømming skyldes sykdom eller andre inngrep.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
A source of constant air-supply, flow as well as composition	central air supply in the research facility
130 ml sampling chamber that has air inlet, air outlet, and food administration opening Plastic tubes for air supply	In-house built
Octanoic acid	Cambridge isotope laboratories (Andover, MA)	CLM-293-1
To prepare the egg meal: small beaker 50 ml plastic tube Bunsen burner egg spatula	Any supplier		Try to be consistent with the egg supplier since the nutritional content and palatability of the eggs can affect ingestion and gastric emptying of the meal
Carbon dioxide isotope analyzer	Los Gatos Research Inc. (Mountain View, CA)