癌变是一个涉及癌细胞和肿瘤微环境之间的相互作用的方法。要解剖的分子事件,一个需要,隔离癌症的发展过程中的不同阶段的不同的细胞群。利用小鼠模型基底细胞癌癌变过程中,我们描述了一个协议,用于细胞分析。
癌症的发展是一个多步骤的过程,涉及到许多类型的细胞,包括肿瘤细胞前体细胞,免疫细胞,成纤维细胞和内皮细胞。每种类型的细胞癌变过程中,经过信令和功能上的变化。许多癌症研究人员目前的挑战是剖析这些变化在多步骤的过程中体内不同的细胞类型。在过去的几年中,作者已经开发了一套程序,来隔离不同的细胞群,在皮肤癌的发展过程中,使用YFP的小鼠K14creER/R26-SmoM2只。的程序被划分成6份:1)生成适当的小鼠为研究对象(+与R26-SmoM2 YFP +老鼠在这个协议中); 2)诱导SmoM2 YFP的表达在小鼠皮肤中; 3 K14creER)制备小鼠皮肤活组织切片检查; 4)隔离从皮肤的表皮; 5)制备单细胞从表皮; 6)标签流式细胞仪分析单细胞群。生成足够数量的合适的基因型的小鼠,在这个协议中的限制步骤,这可能需要长达两个月。其余的步骤需要几个小时到几天。在这个协议中,我们还包括一节进行故障排除。虽然我们侧重于皮肤癌,该协议可以被修改,以适用于其他的人类疾病的动物模型。
基底细胞癌(BCC)作为最常见的类型的人类癌症,影响约200万美国人每年1。越来越多的证据表明,刺猬(Hh)信号异常激活相关:BCC的发展(2,3)的动力。 Hh信号在基底细胞癌的改变包括失活突变的PTCH1 4-6,SMO 7-9增益功能的突变,异常表达Hh信号通路的转录因子GLI1 10 GLI2 11或负调节素(富罕见的灭活突变)12。通过所有这些和其他研究,美国联邦药物管理局(FDA)近日批准使用的Hh信号抑制剂Vismodegib治疗转移性和局部晚期基底细胞癌13-15。
尽管所有这些成就16,我们仍然不明白Hh信号驱动致癌物的分子和细胞机制inogenesis。建立动物模型,利用组织特异性激活Hh信号仍然是重要的,这些研究对于我们理解的耐药性。在小鼠中,野生型小鼠不发展基底细胞癌,即使在大量的致癌物质,紫外线或电离辐射的剂量。 PTCH1 + / –小鼠与此相反,容易受到到BCC开发17,18的影响 。 PTCH1 BCC发展渗透率+ / –小鼠是超过50%,18,19虽然PTCH1 + / -小鼠很少发展为完全成熟的基底细胞癌,如果在正常情况下保持。 PTCH1胚胎致死– / – ,组织特异性的基因敲除PTCH1通常用于研究20。此外,有条件的皮肤特异表达的致癌:YFP SmoM2(KRT14 CREER:中R26-SmoM2 YFP或KRT14-CRE:R26-SmoM2 YFP)导致多个微观基底细胞癌的形成在一个非常早期的年龄,提供一个简单的基因检测Hh信号SMO 21 wnstream。
主要有三个问题,我们的知识BCC生物学。首先,基底细胞癌的细胞起源目前尚不完全清楚。虽然一些研究支持毛囊干细胞网站22-24让步,优素福等 25个本地化的小鼠皮肤HH-驱动肿瘤起源细胞在滤泡间表皮区域,而不是在毛囊通过采用细胞特异性表达Cre重组酶的激活表达的一个驱动ROSA26的转基因突变SMO。二,细胞相互作用BCC发展过程中不能很好地理解。它是已知的,角质形成细胞的激活Hh信号。可以导致基底细胞癌的形成,但不理解其他细胞的变化。此外,治疗的SMO拮抗剂在小鼠可以导致耐药26-28。 BCC因此,新的目标,是非常必要的。了解这三个问题,需要在小鼠的细胞变化分析carcinog香根草。角质细胞培养,流式细胞术及皮肤干细胞分离29-31虽然已经出版的几种方法,目前还没有完备的程序在小鼠基底细胞癌的细胞分析。基底细胞癌的小鼠模型,分离表皮,产生的单细胞组织和细胞分析相结合的方法,我们会为读者提供了一套程序来研究细胞信号传导,细胞和分子间的相互作用,在BCC发展。我们相信,这个协议将使读者看到每个过程是如何完成的。此外,我们还提供了一些数据来说明什么样的结果应该看起来像,故障排除,以帮助读者克服困难,在执行这些程序。
我们已经描述了一种用于在基底细胞癌的细胞群体分析。肿瘤组织中的许多细胞类型相一致的,不同的细胞类型不同的行为的发生在给定时间,这是非常困难的,即使在体外条件下的最夺回。使用此协议,我们发现,基底细胞癌的发展是伴随着扩张的表皮干细胞以及招聘髓细胞。比较,与免疫组织化学或免疫荧光分析,细胞种群分析更定量评估到多种细胞类型特异性抗体的细胞群的变化,因为现在可用。
对于这个协议中,需要完成10周诱导基因的表型变化的研究,因为需要时间。因此,它是重要的规划实验的时间提前。细胞的分离和分析,可能需要整整两天。由于用于活细胞分析产品上课,重要的是,以预定的时间提前一个FACSCALIBUR。我们还列出了常见问题的工作时,这个协议(见下文)。
根据我们的经验,下面是我们遇到的常见问题:
这个协议可以结合骨髓移植或组织移植研究的细胞来源。例如,移植的GFP表达到致死剂量照射小鼠的骨髓细胞,让我们检查骨髓细胞肿瘤相关成纤维细胞和骨髓细胞的贡献。同样,皮肤肿瘤可以移植到一个新的鼠标主机检查肿瘤 – 宿主相互作用。
除了检测细胞癌变过程中的人口变化,该协议也将允许研究人员,研究药物治疗的效果,肿瘤环境中的细胞。虽然这个协议被设计为使用在皮肤的细胞群体分析癌变,稍加修改就可以对其他类型的癌症。
综上所述,皮肤癌小鼠模型中的细胞群体分析可以给我们的动态细胞癌变过程的变化,从而更好地了解细胞生物学,肿瘤转化,在转化过程中不同的细胞活动。
The authors have nothing to disclose.
这项研究是由美国国立癌症研究所(R01-94160 R01-155086),IU西蒙癌症中心和富国儿科研究中心支持。
Reagents | Company | Cat# | Comments |
directPCR lysis reagent (tail) | Viagen Biotech | 102-T | store @ 4 °C |
proteinase K | Sigma | P2308 | store @ -20 °C |
ApliTag 360 taq polymerase | Applied biosystems | N8080155 | store @ -20 °C |
Tamoxifen | Sigma | T5648 | store @ 4 °C |
Feeding needle (20 gauge) | Fisher scientific | 01-290-9B | |
Dispase | Roche Diagnostic | 04942078001 | store @ 4 °C |
Collagenase IV | Worthington | LS004189 | store @ -20 °C |
Cell strainer | Fisher scientific | 08-771-2 | |
Anti-CD11b-PE | eBioscience | 12-0112-81 | store @ 4 °C |
Anti-Gr1-APC | eBioscience | 17-5931-81 | store @ 4 °C |
Anti-vimentin-FITC | eBioscience | 11-9897-80 | store @ 4 °C |