Carcinogenesis कैंसर कोशिकाओं और कैंसर microenvironment के बीच बातचीत से जुड़े एक प्रक्रिया है. आणविक घटनाओं के टुकड़े करने के लिए, एक कैंसर के विकास के दौरान विभिन्न चरणों में अलग सेल आबादी को अलग करने की जरूरत है. बेसल सेल कार्सिनोमा के लिए एक माउस मॉडल का उपयोग करना, हम carcinogenesis के दौरान सेल विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है.
कैंसर के विकास के कैंसर अग्रदूत साबित कोशिकाओं, प्रतिरक्षा कोशिकाओं, fibroblasts और endothelial कोशिकाओं सहित कई प्रकार की कोशिकाओं से जुड़े कई कदम प्रक्रिया है. कोशिकाओं के प्रत्येक प्रकार carcinogenesis के दौरान संकेत और कार्यात्मक परिवर्तन आए. कई कैंसर शोधकर्ताओं के लिए वर्तमान चुनौती vivo में कई कदम प्रक्रिया के दौरान प्रत्येक कोशिका प्रकार में इन परिवर्तनों को काटना है. पिछले कुछ वर्षों में, लेखकों K14creER/R26-SmoM2 YFP चूहों का उपयोग त्वचा कैंसर के विकास के दौरान अलग सेल आबादी को अलग करने के लिए प्रक्रियाओं का एक सेट विकसित किया है. अलग) 4, माउस त्वचा बायोप्सी की तैयारी 3), माउस त्वचा में 2) उत्प्रेरण SmoM2 YFP अभिव्यक्ति, अध्ययन के लिए उपयुक्त चूहों (K14creER + और R26-SmoM2 YFP + इस प्रोटोकॉल में चूहों) सृजन: 1) प्रक्रिया 6 भागों में विभाजित है त्वचा से एपिडर्मिस, 5) एपिडर्मिस से एकल कक्षों की तैयारी, 6) प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए एक सेल आबादी लेबलिंग.सही जीनोटाइप के साथ चूहों के लिए पर्याप्त संख्या की पीढ़ी के दो महीने तक लग सकते हैं जो इस प्रोटोकॉल में सीमित कदम है. कदम के आराम के लिए कुछ दिनों के लिए कुछ घंटे लगेंगे. इस प्रोटोकॉल में, हम भी समस्या निवारण के लिए एक खंड शामिल हैं. हम त्वचा कैंसर पर ध्यान केंद्रित हालांकि, इस प्रोटोकॉल मानव रोगों के अन्य पशु मॉडल के लिए लागू करने के लिए संशोधित किया जा सकता है.
मानव कैंसर का सबसे आम प्रकार के रूप में, बेसल सेल कार्सिनोमा (बीसीसी) वर्ष 1 लाख प्रति 2 के बारे में अमेरिकियों को प्रभावित करता है. सबूत जमते हाथी (एच एच) संकेत है कि असामान्य सक्रियण संकेत मिलता बीसीसी विकास (2,3 में समीक्षित) अंतर्निहित असली ताकत है. BCCs में संकेत दे चुके परिवारों की बदलाव निष्क्रिय PTCH1 4-6 की म्यूटेशन, एसएमओ 7-9 के लाभ के समारोह म्यूटेशनों, और HH मार्ग प्रतिलेखन कारक GLI1 10 और GLI2 11 या नकारात्मक नियामक र की दुर्लभ निष्क्रिय म्यूटेशन (फू की न्यायपालिका अभिव्यक्ति शामिल ) 12. इन सभी और अन्य अध्ययनों के माध्यम से, फेडरल ड्रग एडमिनिस्ट्रेशन (एफडीए) ने हाल ही में BCCs 13-15 metastatic और स्थानीय रूप से उन्नत करने के लिए इलाज Hh संकेत अवरोध Vismodegib के उपयोग को मंजूरी दी है.
इन सब उपलब्धियों के 16 के बावजूद, हम अभी भी Hh संकेत CARC जो ड्राइव से आणविक और सेलुलर तंत्र समझ में नहीं आताinogenesis. Hh संकेत के ऊतक विशेष सक्रियण का उपयोग कर पशु मॉडल की स्थापना इन अध्ययनों के लिए और दवा प्रतिरोध के बारे में हमारी समझ के लिए अब भी महत्वपूर्ण है. चूहों में, जंगली की तरह चूहे भी, कार्सिनोजन यूवी या विकिरण की भारी खुराक के तहत, BCCs विकसित नहीं है. इसके विपरीत, Ptch1 / – चूहों बीसीसी विकास 17,18 लिए अतिसंवेदनशील होते हैं. सामान्य परिस्थितियों में रखा है अगर चूहों शायद ही कभी पूर्ण विकसित BCCs विकसित – Ptch1 में बीसीसी विकास की अंतर्वेधन / – Ptch1 / + हालांकि चूहों 50% से अधिक 18,19 है. Ptch1 की भ्रूण मारक के कारण – / -, PTCH1 के ऊतक विशेष पीटकर आम तौर पर अध्ययन के 20 के लिए प्रयोग किया जाता है. इसके अलावा, oncogenic SmoM2 YFP (Krt14-CreER: R26-SmoM2 YFP या Krt14-रचनात्मक: R26-SmoM2 YFP) की सशर्त त्वचा के विशिष्ट अभिव्यक्ति के लिए एक आसान जेनेटिक परख प्रदान करने, एक बहुत कम उम्र में कई सूक्ष्म BCCs के गठन की ओर hh संकेत करते हैंएसएमओ 21 की wnstream.
बीसीसी जीव विज्ञान के हमारे ज्ञान में तीन प्रमुख मुद्दे हैं. सबसे पहले, BCCs के सेलुलर मूल पूरी तरह स्पष्ट नहीं है. कुछ अध्ययनों से स्टेम सेल साइट 22-24 के रूप में बाल कूप की हिलता का समर्थन करते हैं, युसुफ एट अल. 25 बाल कूप में, अंतर – कूपिक एपिडर्मिस क्षेत्र में होने की त्वचीय Hh संचालित ट्यूमर की मूल के murine सेल नहीं स्थानीयकृत , एक ROSA26 संचालित ट्रांसजेनिक उत्परिवर्ती एसएमओ की अभिव्यक्ति को सक्रिय करने के लिए सेल विशिष्ट Cre का उपयोग करके. बीसीसी के विकास के दौरान दूसरा, सेलुलर बातचीत अच्छी तरह से समझ नहीं रहे हैं. यह सक्रिय Hh संकेत के साथ केरेटिनकोशिकाओं BCCs के गठन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं जाना जाता है, लेकिन अन्य सेलुलर परिवर्तन अच्छी तरह से समझ नहीं रहे हैं. इसके अलावा, चूहों में एसएमओ विरोधी के उपचार दवा प्रतिरोध 26-28 के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. बीसीसी के लिए इस प्रकार उपन्यास लक्ष्य बहुत जरूरत है. इन तीन मुद्दों को समझना carcinog दौरान चूहों में सेलुलर परिवर्तन के विश्लेषण की आवश्यकता हैenesis. कई तरीकों keratinocyte संस्कृति, प्रवाह cytometry और त्वचा स्टेम सेल अलगाव 29-31 के लिए प्रकाशित किया गया है, माउस BCCs में सेल विश्लेषण के लिए कोई व्यापक प्रक्रियाओं वर्तमान में कर रहे हैं. BCCs के माउस मॉडल, एपिडर्मिस की जुदाई, ऊतकों और सेल विश्लेषण से एकल कक्षों की पीढ़ी के लिए विधियों के संयोजन से, हम बीसीसी विकास के दौरान सेल संकेतन, सेलुलर और आणविक बातचीत का अध्ययन करने के लिए प्रक्रियाओं का एक सेट के साथ पाठकों को प्रदान करेगा. हम इस प्रोटोकॉल पाठकों प्रत्येक प्रक्रिया को पूरा किया है देखने के लिए अनुमति देगा. इसके अलावा, हम परिणाम कैसा दिखना चाहिए उदाहरण देकर स्पष्ट करने के लिए कुछ डेटा प्रदान की है, और पाठकों को इन प्रक्रियाओं के प्रदर्शन के दौरान कठिनाइयों को दूर करने के लिए मदद करने के लिए समस्या निवारण.
हम BCCs में सेल आबादी के विश्लेषण के लिए एक विधि का वर्णन किया है. ट्यूमर ऊतकों कई प्रकार की कोशिकाओं की संगत कर रहे हैं, और प्रत्येक कोशिका प्रकार इन विट्रो स्थिति में सबसे अच्छा के तहत भी हटा देना बहुत कठिन है, जो carcinogenesis के एक निश्चित समय पर अलग ढंग से व्यवहार करता है. इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हम बेसल सेल कार्सिनोमा के विकास एपिडर्मल स्टेम कोशिकाओं के विस्तार के साथ ही माइलॉयड कोशिकाओं की भर्ती के साथ है कि पता चला है. Immunohistochemistry या immunofluorescent विश्लेषण के साथ इसकी तुलना में, सेल आबादी विश्लेषण सेल प्रकार की एक किस्म के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के बाद सेल जनसंख्या परिवर्तन का एक और मात्रात्मक आकलन दे अब उपलब्ध हैं.
जीन प्रेरण से प्ररूपी परिवर्तन समय की आवश्यकता है क्योंकि इस प्रोटोकॉल के लिए, 10 हफ्तों के अध्ययन की जरूरत को पूरा कर रहे हैं. यह समय से आगे के प्रयोग की योजना के लिए इस प्रकार महत्वपूर्ण है. सेल अलगाव और विश्लेषण के लिए, पूरे दो दिन की जरूरत हो सकती है. जीवित कोशिकाओं analys के लिए उपयोग किया जाता हैतों, यह समय से आगे एक FACSCalibur आरक्षित करने के लिए महत्वपूर्ण है. इस प्रोटोकॉल (देखें नीचे) के साथ काम कर रहा है, जब हम भी आम समस्याओं को सूचीबद्ध किया है.
हमारे अनुभव में, नीचे हम सामना करना पड़ा आम समस्याएं हैं:
इस प्रोटोकॉल अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण या सेल मूल की जांच करने के लिए ऊतक प्रत्यारोपण के साथ जोड़ा जा सकता है. उदाहरण के लिए, के प्रत्यारोपण GFP-व्यक्त घातक विकिरणित चूहों में अस्थि मज्जा की कोशिकाओं हमें ट्यूमर जुड़े fibroblasts और माइलॉयड कोशिकाओं को अस्थि मज्जा की कोशिकाओं के योगदान की जांच करने की अनुमति देगा. इसी प्रकार, त्वचा ट्यूमर ट्यूमर मेजबान बातचीत की जांच के लिए एक नया माउस मेजबान में प्रत्यारोपित किया जा सकता है.
Carcinogenesis के दौरान सेल जनसंख्या परिवर्तन की जांच करने के अलावा, इस प्रोटोकॉल भी शोधकर्ताओं की जांच करने की अनुमति देगाट्यूमर वातावरण में कोशिकाओं को दवा उपचार के प्रभाव. इस प्रोटोकॉल त्वचा के दौरान सेल की आबादी विश्लेषण के लिए उपयोग करने के लिए डिज़ाइन किया गया है हालांकि कर्कटजनन, मामूली संशोधनों के अन्य प्रकार के कैंसर के लिए बनाया जा सकता है.
संक्षेप में, त्वचा कैंसर के माउस मॉडल में सेल की आबादी का विश्लेषण हमें नवोत्पादित परिवर्तन में कोशिका जीव विज्ञान की एक बेहतर समझ के लिए अग्रणी carcinogenesis के दौरान गतिशील सेलुलर परिवर्तन, और परिवर्तन की प्रक्रिया में विभिन्न सेलुलर घटनाओं दे सकते हैं.
The authors have nothing to disclose.
इस अध्ययन NCI (R01-94160 और R01-155086), आइयू साइमन कैंसर केंद्र और बाल चिकित्सा अनुसंधान के लिए वेल्स केंद्र द्वारा समर्थित किया गया था.
Reagents | Company | Cat# | Comments |
directPCR lysis reagent (tail) | Viagen Biotech | 102-T | store @ 4 °C |
proteinase K | Sigma | P2308 | store @ -20 °C |
ApliTag 360 taq polymerase | Applied biosystems | N8080155 | store @ -20 °C |
Tamoxifen | Sigma | T5648 | store @ 4 °C |
Feeding needle (20 gauge) | Fisher scientific | 01-290-9B | |
Dispase | Roche Diagnostic | 04942078001 | store @ 4 °C |
Collagenase IV | Worthington | LS004189 | store @ -20 °C |
Cell strainer | Fisher scientific | 08-771-2 | |
Anti-CD11b-PE | eBioscience | 12-0112-81 | store @ 4 °C |
Anti-Gr1-APC | eBioscience | 17-5931-81 | store @ 4 °C |
Anti-vimentin-FITC | eBioscience | 11-9897-80 | store @ 4 °C |