Kreftutvikling er en prosess som involverer samspillet mellom kreftceller og kreft mikromiljøet. Å dissekere de molekylære hendelser, må man isolere ulike celle populasjoner på forskjellige stadier i kreftutvikling. Bruke en mus modell for basal cell carcinoma, beskriver vi en protokoll for celle analyser under kreftutvikling.
Kreftutvikling er en flere-trinns prosess som involverer mange celletyper, inkludert kreft forløper celler, immunceller, fibroblaster og endotelceller. Hver type celler gjennomgår signalering og funksjonelle endringer i kreftutvikling. Utfordringen for mange kreftforskere er å dissekere disse endringene i hver celletype i flere trinn in vivo. I de siste årene har forfatterne utviklet et sett av prosedyrer for å isolere ulike celle populasjoner under hudkreft utvikling ved hjelp K14creER/R26-SmoM2 YFP mus. Prosedyren er delt inn i seks deler: 1) generere passende mus for studien (K14creER + og R26-SmoM2 YFP + mus i denne protokollen), 2) inducing SmoM2 YFP uttrykk i mus hud, 3) forbereder mus hud biopsier, 4) isolering Epidermis fra huden, 5) fremstilling av enkeltceller fra epidermis, 6) merking av enkelt-celle populasjoner for strømningscytometri-analyse.Generasjon av tilstrekkelig antall mus med riktig genotype er den begrensende trinn i denne protokollen, noe som kan ta opptil to måneder. Resten av trinnene ta noen timer til noen dager. Innenfor denne protokollen, vi har også en seksjon for feilsøking. Selv om vi fokuserer på hudkreft, kan denne protokollen endres til å gjelde for andre dyremodeller av menneskelige sykdommer.
Som den vanligste typen av menneskelig kreft, påvirker basalcellekarsinom (BCC) om lag 2 millioner amerikanere hvert år en. Innsamling av bevismateriale tyder på at unormal aktivering av pinnsvin (tt) signal er drivkraften underliggende BCC utvikling (Anmeldt i 2,3). Endringer av Hh signalering i BCC inkluderer inaktivere mutasjoner av PTCH1 4-6, gain-of-funksjon mutasjoner av SMO 7-9, og avvikende uttrykk for Hh sti transkripsjonsfaktorer GLI1 10 og GLI2 11 eller sjeldne inaktivert mutasjoner av negativ regulator Su (Fu ) 12. Gjennom alle disse og andre studier, har Federal Drug Administration (FDA) har nylig godkjent bruk av Hh signalering inhibitor Vismodegib å behandle metastatisk og lokalavansert BCC 13-15.
Til tross for alle disse prestasjonene 16, har vi fortsatt ikke forstår de molekylære og cellulære mekanismer som Hh signalering driver carcinogenesis. Etablering av dyremodeller med vev-spesifikk aktivering av Hh signalering er fortsatt viktig for disse studiene, og for vår forståelse av resistens. Hos mus, gjør villtype mus ikke utvikler BCC, selv under store doser av kreftfremkallende stoffer, UV eller ioniserende stråling. I kontrast, Ptch1 + / – mus er utsatt for BCC utvikling 17,18. Den penetrans av BCC utvikling i Ptch1 + / – mus er over 50% 18,19 selv om Ptch1 + / – mus sjelden utvikle fullvoksne BCC hvis de holdes under normale forhold. På grunn av den embryoniske letalitet Ptch1 – / -, er vev-spesifikke knockout av PTCH1 vanligvis brukt for undersøkelsen 20.. I tillegg betinget hud-spesifikke uttrykk for oncogenic SmoM2 YFP (Krt14-creer: R26-SmoM2 YFP: R26-SmoM2 YFP eller Krt14-cre) fører til dannelsen av flere mikroskopiske BCC på et svært tidlig alder, noe som gir en enkel genetisk analyse for hh signalering gjørewnstream av SMO 21.
Det er tre store spørsmålene i vår kunnskap om BCC biologi. Først er den cellulære opprinnelsen til BCC ikke helt klart. Mens noen studier støtter rikke av hårsekken som stamcelleforskningen området 22-24, Youssef et al. 25. lokalisert murine celle opprinnelsesland kutane Hh-drevet svulster å være i inter-follikulær epidermis regionen, ikke i hårsekken , ved å bruke celle-spesifikk Cre for å aktivere ekspresjon av et transgent ROSA26-drevet mutant SMO. Sekund, cellulære interaksjoner BCC utvikling er ikke godt forstått. Det er kjent at keratinocytter med aktivert Hh signalering kan føre til dannelse av BCC, men andre cellulære endringer ikke er godt forstått. Videre kan behandling av Smo antagonister i mus føre til resistens 26-28. Dermed nye mål for BCC er stort behov. Forstå disse tre spørsmålene krever analyser av celleforandringer i mus under carcinogenesis. Mens flere metoder har blitt publisert for keratinocyte kultur, flowcytometri og hud stamceller isolert 29-31, er det i dag ingen omfattende prosedyrer for celle analyser i mus BCC. Ved å kombinere metoder for mus modell av BCC, separasjon av epidermis, generering av enkeltceller fra vev og celle analyser, vil vi gi leserne et sett av prosedyrer for å studere cellesignalisering, cellulære og molekylære interaksjoner under BCC utvikling. Vi tror at denne protokollen vil tillate leserne å se hvordan hver prosedyre er skjedd. I tillegg gav vi noen data for å illustrere hva resultatet skal se ut, og feilsøking for å hjelpe leserne til å overvinne vanskelighetene ved å utføre disse prosedyrene.
Vi har beskrevet en fremgangsmåte for cellepopulasjon analyse i BCC. Tumorvev er konsistente av mange celletyper, og hver celle type oppfører seg annerledes på et gitt tidspunkt av kreftutvikling, noe som er svært vanskelig å gjenskape selv under de beste in vitro forhold. Ved hjelp av denne protokollen, viste vi at utvikling av basalcellekreft er ledsaget av utvidelse av epidermal stamceller samt rekruttering av myeloide celler. I sammenligning med immunhistokjemi eller immunofluorescent analyser, cellepopulasjon analyser gir en mer kvantitativ vurdering av cellepopulasjon endringer siden spesifikke antistoffer til en rekke celletyper, er nå tilgjengelig.
For denne protokollen, er 10 uker for å fullføre studiet fordi fenotypisk endring fra genet induksjon krever tid. Det er derfor viktig å planlegge forsøket på forhånd. For celleisolasjon og analyser, kan to hele dager være nødvendig. Fordi levende celler brukes for analyses, er det viktig å reservere en FACSCalibur forhånd. Vi har også listet opp vanlige problemer når du arbeider med denne protokollen (se nedenfor).
I vår erfaring, nedenfor er vanlige problemene vi:
Denne protokollen kan kombineres med benmargstransplantasjon eller vevstransplantasjon å undersøke celle opprinnelse. For eksempel transplantasjon av GFP-uttrykke celler fra beinmargen til livsfarlige bestrålte mus vil gi oss mulighet til å undersøke bidraget fra benmargceller til tumor-assosierte fibroblaster og myeloide celler. Likeledes kan hud tumorer bli transplantert inn en ny vert mus for å undersøke tumor-vert interaksjoner.
I tillegg til å undersøke celle befolkningsendringer i løpet av kreft, vil denne protokollen også tillate forskere å undersøkeeffekter av medikamentell behandling til cellene i tumor miljø. Selv om denne protokollen er designet for å bruke for cellepopulasjonen analyser under huden av kreft, små endringer kan gjøres for andre krefttyper.
Oppsummert kan cellepopulasjonen analyser i musemodeller av hudkreft gi oss de dynamiske celleforandringer under kreftutvikling, som fører til en bedre forståelse av cellebiologi i neoplastisk transformasjon og ulike cellulære hendelser i transformasjonsprosessen.
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble støttet av NCI (R01-94160 og R01-155086), IU Simon Cancer Center og Wells Center for Pediatric Research.
Reagents | Company | Cat# | Comments |
directPCR lysis reagent (tail) | Viagen Biotech | 102-T | store @ 4 °C |
proteinase K | Sigma | P2308 | store @ -20 °C |
ApliTag 360 taq polymerase | Applied biosystems | N8080155 | store @ -20 °C |
Tamoxifen | Sigma | T5648 | store @ 4 °C |
Feeding needle (20 gauge) | Fisher scientific | 01-290-9B | |
Dispase | Roche Diagnostic | 04942078001 | store @ 4 °C |
Collagenase IV | Worthington | LS004189 | store @ -20 °C |
Cell strainer | Fisher scientific | 08-771-2 | |
Anti-CD11b-PE | eBioscience | 12-0112-81 | store @ 4 °C |
Anti-Gr1-APC | eBioscience | 17-5931-81 | store @ 4 °C |
Anti-vimentin-FITC | eBioscience | 11-9897-80 | store @ 4 °C |