Carcinogenesis är en process som involverar interaktioner mellan cancerceller och cancer mikromiljö. Att dissekera de molekylära händelser, måste man isolera olika cellpopulationer vid olika stadier under utvecklingen av cancer. Med hjälp av en musmodell för basaliom, beskriver vi ett protokoll för cell analyser under cancer.
Cancerutveckling är en multipel-steg process med många celltyper inklusive cancerceller föregångare, immunceller, fibroblaster och endotelceller. Varje typ av celler genomgår signalering och funktionella förändringar under cancer. Den stora utmaningen för många cancerforskare är att dissekera dessa förändringar i varje celltyp under flera steg in vivo. Under de senaste åren har författarna utvecklat en rad förfaranden för att isolera olika cellpopulationer under hudcancer utveckling med K14creER/R26-SmoM2 YFP möss. Förfarandet är uppdelat i 6 delar: 1) skapa lämpliga möss för studien (K14creER + och R26-SmoM2 YFP + möss i detta protokoll), 2) inducerande SmoM2 YFP uttryck i mushud, 3) förbereder biopsier mushud, 4) isolering epidermis från huden, 5) framställning enstaka celler från överhuden, 6) märkning encelliga populationer för flödescytometri analys.Generering av tillräckligt antal möss med rätt genotyp är den begränsande steget i detta protokoll, vilket kan ta upp till två månader. Resten av stegen ta några timmar till några dagar. Inom detta protokoll, har vi också ett avsnitt för felsökning. Även om vi fokuserar på hudcancer, kan detta protokoll ändras för att ansöka om andra djurmodeller för mänskliga sjukdomar.
Eftersom den vanligaste typen av cancer hos människor, drabbar basalcellscancer (BCC) omkring 2 miljoner amerikaner per år 1. Ackumulerande bevis tyder på att onormal aktivering av hedgehog (HH)-signalering är den drivande kraften bakom BCC utveckling (Betygsatt under 2,3). Förändringar av Hh-signalering i BCC inkluderar inaktiverande mutationer av Ptch1 4-6, vinst-of-funktion mutationer av SMO 7-9, och onormalt uttryck av Hh faktorer pathway transkription Gli1 10 och Gli2 11 eller sällsynta inaktiverade mutationer av negativ regulator Su (Fu ) 12. Genom alla dessa och andra studier, har Federal Drug Administration (FDA) godkände nyligen användningen av Hh-signalering inhibitor vismodegib att behandla metastaserande och lokalt avancerad BCC 13-15.
Trots alla dessa framgångar 16, vi förstår fortfarande inte de molekylära och cellulära mekanismer genom vilka Hh-signalering driver carcinogenesis. Etablera djurmodeller med vävnads-specifik aktivering av Hh-signalering är fortfarande viktigt för dessa studier och för vår förståelse av resistens. Hos möss framkallar vildtypsmöss inte BCC, även under tunga doser av cancerframkallande ämnen, UV eller joniserande strålning. Däremot Ptch1 + / – möss är känsliga för BCC utveckling 17,18. Den penetrans av BCC utveckling i Ptch1 + / – möss är över 50% 18,19 trots Ptch1 + / – möss sällan utvecklar fullvuxna BCCs om de förvaras under normala förhållanden. På grund av den embryonal dödlighet av Ptch1 – / -, är vävnadsspecifik knockout av Ptch1 allmänhet användes för studien 20. Dessutom villkorlig hud-uttryck av onkogen SmoM2 YFP (Krt14-creer: R26-SmoM2 YFP: R26-SmoM2 YFP eller Krt14-cre) leder till bildandet av flera mikroskopiska BCCs vid en mycket tidig ålder, vilket ger en enkel genetisk analys för Hh-signalering görawnstream av SMO 21.
Det finns tre viktiga frågor i vår kunskap om BCC biologi. Det första är den cellulära ursprung BCCs inte helt klar. Medan vissa studier stöder vika av hårsäcken som stamceller plats 22-24, Youssef et al. 25 lokaliserade murina cellen varifrån kutana Hh-drivna tumörer vara i inter-follikulära epidermis regionen, inte i hårsäcken , med hjälp av cell-specifik Cre att aktivera uttrycket av en ROSA26-driven transgen mutant SMO. Det andra cellulära interaktioner under BCC utveckling är inte väl förstådd. Det är känt att keratinocyter med aktiverad Hh-signalering kan leda till bildandet av BCC, men andra cellulära förändringar är inte väl förstådd. Dessutom kan behandling av SMO-antagonister hos möss leder till resistens 26-28. Således nya mål för BCC är stort. Att förstå dessa tre frågor kräver analyser av cellförändringar i möss under Carcinogenesis. Medan flera metoder har publicerats för keratinocyte kultur, flödescytometri och hudens stamceller isolering 29-31, finns det för närvarande ingen heltäckande förfaranden för cell analyser i mus BCCs. Genom att kombinera metoder för musmodell av BCC, separation av epidermis, generering av enstaka celler från vävnad och analyser cell, kommer vi att ge läsarna en rad förfaranden för att studera cell signalering, cellulära och molekylära interaktioner under BCC utveckling. Vi tror att detta protokoll kommer att ge läsarna att se hur varje förfarande åstadkoms. Dessutom gav vi några uppgifter att illustrera vad resultatet ska se ut, och felsökning för att hjälpa läsarna att övervinna svårigheter under genomförandet av dessa förfaranden.
Vi har beskrivit en metod för cell population analys BCCs. Tumör vävnader överensstämmer av många celltyper, och varje cell typ uppför sig annorlunda vid en given tidpunkt på karcinogenes, vilket är mycket svårt att återta även under de bästa betingelser in vitro. Med hjälp av detta protokoll, visade vi att utveckla basalcellscancer åtföljs av expansionen av epidermal stamceller samt rekrytering av myeloida celler. I jämförelse med immunohistokemi eller immunofluorescens analyser, cellpopulation analyser ger en mer kvantitativ bedömning av cellförändringar befolkningen sedan specifika antikroppar mot ett antal olika celltyper finns nu tillgängliga.
För detta protokoll är 10 veckor krävs för att genomföra studien eftersom fenotypisk förändring från geninduktion kräver tid. Det är därför viktigt att planera experimentet i förväg. För cellisolering och analyser, får två hela dagar att behövas. Eftersom levande celler används för analyses, är det viktigt att reservera en FACSCalibur förväg. Vi har också noterat vanliga problem när man arbetar med detta protokoll (se nedan).
I vår erfarenhet, nedan är vanliga problem som vi stött på:
Detta protokoll kan kombineras med benmärgstransplantation eller vävnadstransplantation att undersöka cellursprung. Till exempel, transplantation av GFP-uttryckande benmärgsceller i letalt bestrålade möss kommer att tillåta oss att undersöka bidraget av benmärgsceller till tumörassocierade fibroblaster och myeloidceller. På liknande sätt kan hudtumörer kan transplanteras in i en ny mus värd att undersöka tumör-värd interaktioner.
Förutom att undersöka cellförändringar befolkning under karcinogenes, kommer detta protokoll också tillåta forskare att undersökaeffekter av läkemedelsbehandling till cellerna i tumören miljön. Även detta protokoll är avsedd att användas för analyser cellpopulation under huden carcinogenes, smärre ändringar kan göras för andra cancertyper.
Sammanfattningsvis kan cellpopulation analyser i musmodeller av hudcancer ger oss de dynamiska cellförändringar under cancer, vilket leder till en bättre förståelse av cellbiologi i neoplastisk transformation och olika cellulära händelser i omvandlingsprocessen.
The authors have nothing to disclose.
Denna studie stöddes av NCI (R01-94160 och R01-155.086), IU Simon Cancer Center och Wells Centrum för pediatrisk forskning.
Reagents | Company | Cat# | Comments |
directPCR lysis reagent (tail) | Viagen Biotech | 102-T | store @ 4 °C |
proteinase K | Sigma | P2308 | store @ -20 °C |
ApliTag 360 taq polymerase | Applied biosystems | N8080155 | store @ -20 °C |
Tamoxifen | Sigma | T5648 | store @ 4 °C |
Feeding needle (20 gauge) | Fisher scientific | 01-290-9B | |
Dispase | Roche Diagnostic | 04942078001 | store @ 4 °C |
Collagenase IV | Worthington | LS004189 | store @ -20 °C |
Cell strainer | Fisher scientific | 08-771-2 | |
Anti-CD11b-PE | eBioscience | 12-0112-81 | store @ 4 °C |
Anti-Gr1-APC | eBioscience | 17-5931-81 | store @ 4 °C |
Anti-vimentin-FITC | eBioscience | 11-9897-80 | store @ 4 °C |