Summary
Deze procedure levert telencephalic neuronen door door checkpoints die vergelijkbaar zijn met die waargenomen in menselijke ontwikkeling. De cellen mogen spontaan differentiëren blootgesteld aan risicofactoren te duwen naar de neurale stam, geïsoleerd en uitgeplaat op dekglaasjes om voor terminale differentiatie en maturatie.
Abstract
Hier is een stapsgewijze procedure voor het efficiënt genereren telencephalic glutamaat neuronen van menselijke pluripotente stamcellen (PSC) beschreven. Het differentiatieproces wordt geïnitieerd door het breken van de menselijke loketten tot klonten die afgerond naar aggregaten wanneer de cellen worden geplaatst in een suspensiekweek. De aggregaten worden vervolgens gekweekt in medium hESC van dag 1-4 om voor spontane differentiatie. Gedurende deze tijd de cellen hebben het vermogen te worden elk van de drie kiembladen. Vanaf dag 5-8, werden de cellen in een neurale inductie medium te duwen in de neurale lineage. Rond dag 8 worden de cellen mag hechten op 6 well platen en gedurende welke tijd de cellen neuro vorm differentiëren. Deze neuro cellen kunnen worden geïsoleerd op dag 17. De cellen worden gehouden als neurosferen tot ze gereed zijn uitgeplaat op dekglaasjes. Met behulp van een basisch milieu, zonder enige caudalizing factoren, neuro-epitheliale cellen zijn specified in telencephalic voorlopers, die vervolgens verder kunnen worden onderscheiden in dorsale telencephalic voorouders en glutamaat neuronen efficiënt. Algemeen ons systeem een hulpmiddel om menselijke glutamaat neuronen voor onderzoekers genereren om de ontwikkeling van deze neuronen en de ziekten die hen beïnvloeden bestuderen.
Introduction
Menselijke pluripotente stamcellen (PSC), zowel menselijke embryonale stamcellen (hESC ') en geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs), de capaciteit om elk celtype in het lichaam, waaronder neuronen 1-3 genereren. Gerichte differentiatie van verschillende neuronale subtypes van menselijke PSC heeft de sleutel voor de toepassing van deze cellen in de regeneratieve geneeskunde. De productie van functionele neuronale subtypes tijdens ontwikkeling een complex proces, waarbij de inductie van neurale stam, de specificatie van regionale progenitors langs de rostro-caudale as en de differentiatie van post-mitotische neuronen types van de regionale progenitoren 4,5. Vanaf 2001 zijn er verschillende systemen opgezet om neurale afstamming genereren uit hESC 's, die een platform hebben voor de volgende generatie van neuronale subtypes 6,7. Op basis ontwikkelingsprincipes verschillende types neuron zoals spinale motorische neuronen 8-12, midbrain dopaminerge neuronen 13-15, en neurale retinale cellen 16,17 zijn efficiënt opgegeven vanaf het menselijk PSC's. Dit werd gedaan door kritische morfogenen die belangrijk zijn voor de specificatie van deze types neuron tijdens in vivo ontwikkeling. Andere protocollen zijn ook ontwikkeld om de differentiatie van hESC 'via in neuronen met behulp van aanvullende factoren 18-20 zoals kleine moleculen of co-kweken met andere celtypen om differentiatie 21 bevorderen.
De menselijke neocortex is sterk ontwikkeld en bevat vele soorten cellen, met inbegrip van glutamaat neuronen die een belangrijke rol bij het leren, het geheugen en cognitieve functies 22,23 af te spelen. De eerste stap in het genereren glutamaterge neuronen in cultuur te geven telencephalic progenitorcellen. Yoshiki Sasai groep voor het eerst gemeld de gerichte differentiatie van telencephalic voorlopers van muis SER (mESCs) met behulp van een serum-vrij suspension kweken in aanwezigheid van Dkk1 (die remt Wnt signalering) en LeftyA (die remt nodale signalering) 24. Vervolgens hebben verschillende groepen waaronder ons rapporteerden ook de specificatie van telencephalic precursors uit humaan PSC in serumvrij medium 25-27. De generatie van telencephalic precursors van menselijke PSC vereist niet het gebruik van exogene morfogenen en de efficiëntie in het genereren van deze precursors is veel hoger dan van mESCs 26,27. Hier is een chemisch welbepaalde systeem voor neurale inductie die goed werd opgericht door de groep Zhang's 7 is beschreven. Zonder de toevoeging van exogene caudalizing factoren, dit protocol genereert efficiënt telencephalic voorlopers van menselijke PSC's 27. Deze voorlopers kunnen dan worden onderscheiden in dorsale of ventrale voorouders door het reguleren van de signalering van Wnt en sonic hedgehog (SHH). De dorsale voorouders kan verder differentiëren in glutamaat neuronen efficiently 27. Daarnaast heeft dit protocol werkt ook goed voor het genereren van glutamaat neuronen van menselijke iPSCs 28, waardoor het genereren van patiëntspecifieke neuronen die kunnen worden gebruikt om het werkingsmechanisme en potentiële therapieën voor een groot scala aan ziekten verkennen . Bovendien ons systeem biedt ook een platform voor de ontwikkeling en specificatie van diverse types neuronale in het telencephalon verkennen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generatie van menselijke pluripotente stamcellen Aggregaten (D1-D4)
- Menselijke pluripotente stamcellen zijn gekweekt op muis embryonale fibroblasten (MEF) feeders in aanwezigheid van hESC medium aangevuld met basic fibroblast growth factor (bFGF, 4 ng / ml). Na 5-7 dagen kweken bij de kolonies groot, maar nog niet gedifferentieerd zijn ze klaar voor de volgende stap.
- De enzymoplossing moet eerst worden bereid. In een 50 ml buis ontbinden dispase (of collagenase) bij 1 mg / ml concentratie in DMEM/F12 medium. Omdat deze oplossingen te mengen best wanneer verwarmd, zet de buis met het medium en enzym in een 37 ° C waterbad gedurende 10-15 minuten en vervolgens gesteriliseerd met behulp van een Steriflip filter.
- Zuig uit het medium van de cellen, spoel ze met DMEM/F12, en zuig dit dan ook uit. Voeg 1 ml dispase in elk putje en in de incubator gedurende 3-5 min voor hESC '(tot 10 min voor iPSCs). Kijken naar de cellen onder een microscoop, wanneerde randen iets opkrullen / zien er een beetje donkerder, de cellen zijn klaar voor de volgende stap. Het beste is om de cellen te controleren na 3 min en leg ze terug in indien nodig. Bij gebruik van dit protocol voor de eerste keer, het beste met slechts een plaat van cellen beginnen tegelijk, is het belangrijk om de cellen uit de dispase zo snel mogelijk.
- Zuigen van de dispase uit de cellen. Zachtjes (de cellen zijn erg kwetsbaar in dit stadium en weg van de plaat relatief gemakkelijk komen) voeg 1,5 ml DMEM/F12 medium aan elk putje om te spoelen de dispase. Zuigen van de DMEM/F12 en voeg 1,5 ml van hESC medium aan elk putje.
- Om los te maken en breken de cellen, plaats de punt van een 10 ml glazen pipet naar de rechterbenedenhoek van een goed (het aanraken van de cellen) en beweeg de pipet op en neer (verticaal) - de opwaartse stoke moet in de nabijheid om de procedure neerwaartse slag. Nadat de andere zijde van de put bereikt is, herhalen de horizontale directie.
- Zodra alle cellen in suspensie zijn, ze in 15 ml en centrifugeer bij 200 xg ze gedurende 2 minuten. Er moet een pellet van cellen op de bodem van de buis. Zuig uit het medium van boven de pellet.
- De grootte van de celkweek kolf die moeten worden gebruikt om de aggregaten in afhankelijk van de oorspronkelijke hoeveelheid cellen. Voor 6 putten (1 plaat) van hESC 's, een niet-weefselkweek behandeld T75 fles met 50 ml van hESC medium moet worden gebruikt. Breng de cellen van stap 1.6 de kolf en incubeer bij 37 ° C.
- Om te ontdoen van de celresten, moet het celmedium en kolf ongeveer 12 uur later vervangen. Om dit te doen, plaatst al het medium / cellen in een 50 ml buis naar beneden draaien van de cellen (200 xg gedurende 2 min), en zuig de oude medium. Voeg vervolgens 50 ml verse hESC medium aan de cellen, en plaats in een nieuwe T75 kolf. De cellen kunnen vervolgens dagelijks gevoerd volgens dezelfde procedure (tot dag 5).
- Breng de cellen / medium in een 50 ml buis en centrifugeer de cellen gedurende 2 min bij 200 x g. Vervolgens aspireren het supernatant en breng de cellen naar een nieuwe (niet behandeld weefselkweek) T75 kolf met 50 ml van neurale inductie medium (NIM).
- Zodra de cellen in NIM, moet de helft van het medium vervangen om de dag. De aggregaten moet groot genoeg om waar ze naar de bodem van een 50 ml conische buis op zichzelf na enkele minuten (geen centrifugatie vereist). Na 2-3 dagen in NIM (D7 D8-totaal) moeten de cellen klaar voor plaat. Laminine of foetaal runderserum (FBS) kan worden gebruikt om de cellen hechten aan de platen.
- Het aantal weefselkweek behandeld 6 well platen die nodig zijn afhankelijk van de dichtheid van de cellen elk aggregaat moet kunnen op de plaat groeien enkele dagen zonder aan een van de anderen. Gemiddeld de cellen van eenT75 fles levert ongeveer 4-6 6 goed platen ter waarde van cellen.
- Bij gebruik laminine, verdund in NIM tot 10-20 ug / ml het bekleden van de plaat met 6 putjes (~ 0,5 ml / putje). Na coating voor 2-3 uur, celaggregaten plaat op platen met 6 putjes (~ 20-30 aggregaten per well). Na de aggregaten hebben gehecht, voeg 1,5 ml van NIM.
- Bij gebruik FBS, een mengsel van 90% NIM en 10% FBS (1,5 ml / putje). Voeg 1,5 ml medium met de cellen in elk putje, schud de plaat heen en weer te spreiden de aggregaten, en laat de cellen om O / N hechten in een incubator. Zorg ervoor dat u het medium (2 ml / putje van NIM) veranderen de volgende ochtend aan de FBS te verwijderen.
- Na een dag of twee van zijn verguld, zal ieder aggregaat verspreid naar een monolaag vormen. Binnen een paar dagen, zal de centra van de meeste van deze cellen morfologisch lijken op zuilvormige cellen (langwerpig). Tijdens deze periode, wijzigt u de NIM om de andere dag. Sommige PSC lijnen (especially IPSC), kunnen vormen zuilvormige cellen minder efficiënt. Als dit gebeurt, kan de toevoeging van BMP en TGF remmers (Dorsomorphin 29, SB431542 19 bij 2 uM) gedurende fase 2 nuttig zijn.
- Rond dag 14-17, zal de zuilvormige cellen blijken compacter. Soms zijn deze cellen vormen ruggen of ringen met zichtbare lumen binnen. Naast de kolomvormige morfologie, cellen in dit stadium neuro markers zoals PAX6 en SOX1 12,26.
- Voor de isolatie kan beginnen moet men eerst onderzoeken cellen om te bepalen of er niet neuro cellen aanwezig. Een objectieve marker kan worden gebruikt om de niet-neuro kolonies geven. Deze kunnen vervolgens worden geëlimineerd door schrapen ze af met een pipet tip.
3. Generatie van Telencephalic voorouders (D17-D24)
- De middens van de kolonies bevatten de neuro cellen en worden geïsoleerd van de rest van de kolonie. Dit kan meteen micropipet en een steriele 1 ml gefilterd pipetpunt. Wanneer een kleine hoeveelheid druk wordt uitgeoefend op het centrale deel van de kolonie, tilt algemeen af heel gemakkelijk. Wees voorzichtig niet te laten het buitenste gedeelte van de kolonie los ook. Als de centra koppig en niet loskomen als zodanig kunnen ze worden verwijderd door uitsnijden met behulp van een naald onder een microscoop in een steriele kap. Breng de centrale delen van de kolonies naar een 15 ml buis en draaien bij 200 xg gedurende 2 minuten.
- Het medium moet worden afgezogen van de cellen. Twee platen waarde van cellen kan vervolgens worden overgedragen aan een niet-weefselkweek behandeld T25 kolf met 10 ml van NIM met de toevoeging van B27 (zonder vitamine A, 1:50). Gebruik 5-10 ml medium per een plaat van cellen.
- Wanneer de cellen gezien de volgende dag worden ze als een bol uiterlijk. Het is noodzakelijk deze cellen over in een nieuwe kolf (in aanwezigheid van NIM en B27, 1:50) zoals vaak het perifere cellensluipen en die hechten aan de bodem van de kolf.
- De neurosferen moet dan in suspensie gekweekt gedurende een week met NIM aangevuld met B27 (1:50). Om celduurzaamheid bevorderen en proliferatie, cyclische AMP (cAMP, 1 uM) en insuline-groeifactor (IGF1, 10 ng / ml) worden toegevoegd aan het medium tijdens suspensiekweek. Op dit punt, de neurosferen bevatten telencephalic voorlopercellen (FOXG1 +) en zijn klaar om te worden uitgeplaat op dekglaasjes voor terminale differentiatie.
4. Verdere differentiatie in de Telencephalic Neuronen (D25 +)
- Bereid de poly-ornithine/laminin beklede dekglaasjes (in 24-well platen) voor het uitplaten van de cellen. Dekglaasjes worden eerst gereinigd en worden vervolgens bekleed met truc-ornithine (bij 0,1 mg / ml, 37 ° C, O / N, en opgeslagen in de vriezer).
Poly-ornithine coating:- Steriliseer de dekglaasjes: Plaats de dekglaasjes in eenbeker die salpeterzuur en voorzichtig in de zuurkast schud gedurende een uur. Giet het salpeterzuur, meerdere malen afspoelen met DI-water, en laat de dekglaasjes onder stromend DI water gedurende tenminste 15 minuten. Plaats de dekglaasjes in 95% ethanol en schud gedurende 30 minuten (bij gebruik direct) of opslag in ethanol bij kamertemperatuur.
- In een steriele kap, giet de inhoud van de buis met 50 ml gesteriliseerd dekglaasjes in de deksel van een 6-well plaat. Gebruik een steriele tang, pick-up een dekglaasje op een moment en zet rechtop in een putje van een 24-wells plaat. Herhalen zodat elk putje een dekglaasje heeft.
- Nadat ze volledig droog, tikt u op de platen tot dekglaasjes zijn gevallen flat in elk putje. Voeg vervolgens 100 pl poly-ornithine (0,1 mg / ml in steriele dH 2 O) aan elk dekglaasje en incubeer de platen O / N bij 37 ° C.
- De volgende dag verwijderd platen uit de incubator en laat ze afkoelen tot kamertemperatuur. Verstuif poly-ornithine af van elkaar dekglaasje (vanaf de rand van thij dekglaasje) en zorg ervoor niet aan te raken of de dekglaasjes krassen in het proces. Laat de coverslips drogen gedurende ongeveer 30 minuten voor het wassen.
- Voeg 1 ml steriel dH 2 O goed aan elk laten staan gedurende 10 min, en zuig het water uit elk putje. Herhaal deze wasstap nog twee keer. Nadat de platen drogen, (verlof dekt af in de kap) plaats de deksels op, dek af met aluminiumfolie en bewaar bij -20 ° C.
- Het bekleden van de dekglaasjes met laminine, voeg 50 ul van een mengsel van neurale differentiatiemedium en laminine (uiteindelijke concentratie van 20 ug / ml) aan elk poly-ornithine behandeld dekglaasje zorg dat alleen de vloeistof raken dekglaasje zelf (en niet morsen uit). Incubeer ze bij 37 ° C gedurende 1-2 uur voor het bereiden van de cellen voor bevestiging.
- Bereid de poly-ornithine/laminin beklede dekglaasjes (in 24-well platen) voor het uitplaten van de cellen. Dekglaasjes worden eerst gereinigd en worden vervolgens bekleed met truc-ornithine (bij 0,1 mg / ml, 37 ° C, O / N, en opgeslagen in de vriezer).
- Verzamel en centrifugeer de neurosferen bij 200 xg gedurende 2 minuten in een 15 ml buis. Zuig het supernatant. <li>
- Spoel de cellen met DMEM-F12 en opnieuw gecentrifugeerd cellen. Als de neurosferen te groot om goed hechten, kunnen ze gescheiden in Accutase ten deze stap.
- Bij gebruik Accutase: Na wassen van de cellen met DMEM-F12, de neurosferen worden gescheiden van kleine clusters door toevoeging Accutase (~ 2 ml) en de cellen te incuberen bij 37 ° C gedurende 3 minuten. Voeg vervolgens dezelfde hoeveelheid trypsine inhibitor (~ 2 ml) en gecentrifugeerd bij 200 xg cellen gedurende 3 minuten. De cellen moeten vervolgens geresuspendeerd in NDM en gebroken met een P200 pipet. De kleine clusters kan vervolgens worden uitgeplaat op vooraf beklede dekglaasjes.
- Zuigen van de meerderheid van het medium en zet de cellen op een 6 cm Petrischaal in een paar druppels medium zodat ze gemakkelijker te selecteren. Voeg ongeveer 4-5 neurosferen aan elke pre-coated dekglaasje aan. Er is geen behoefte om te zuigen uit de laminine eerste.
- Laat de neurosferen hechten ten minste 2-4 uur. Zodra ze eengoed ttached, moet meer medium (0,5 ml / dekglaasje) worden toegevoegd. Het moet bestaan uit neurale differentiatie medium aangevuld met B27 (1:50), cAMP (1 uM), en neurotrofe factoren (BDNF, GDNF en IGF, alle bij 10 ng / ml). Op dit punt helft van het medium kan worden om de andere dag en deze cellen kunnen gedurende meerdere maanden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier een protocol differentiëren menselijke loketten in telencephalic glutamaat neuronen via verschillende belangrijke stappen: de vorming van aggregaten PSC, de inductie van neuroepitheliale cellen, de productie van telencephalic voorlopercellen, en de terminale differentiatie van deze stamcellen in telencephalic neuronen (Figuur 1) beschreven. Dit systeem is robuust en doeltreffend bij het genereren van telencephalic voorlopers en glutamaat neuronen. Als voorbeeld (figuur 2), zonder toevoeging van caudalizing factoren werden de hESC 'gedifferentieerd in de neurale lijn 27. Op 24 dagen na differentiatie, de meeste neurale precursors positief voor FOXG1 (a transcriptiefactor uitgedrukt telencephalon) maar negatief voor HOXB4 (een merker voor achterhersenen en ruggenmerg cellen) suggereert dat de telencephalic voorlopers succesvol gegenereerd (Figuur 2D). Deze telencephalic voorouders p ossess een dorsale fenotype, zoals aangegeven door de expressie van PAX6 (a marker uitgedrukt dorsale voorlopers) (figuur 2E), maar niet NKX2.1 (een merker voor ventrale voorlopers) (figuur 2F). Na verdere differentiatie, deze telencephalic dorsale voorlopercellen gedifferentieerd in glutamaat neuronen, die positief waren voor de glutamaat marker TBR1 (ongeveer 80%) 27. Neuronen die positief gekleurd TBR1 waren ook positief voor neuronale markers βIII-tubuline (figuur 2G) of microtubule-geassocieerde eiwit 2 (MAP2, figuur 2H). Deze cellen ook tot uiting vesiculaire glutamaat transporter 1 (vGLUT1), een marker voor volwassen glutamaat neuronen, wat suggereert dat de efficiënte generatie van telencephalic glutamaat neuronen in de cultuur (figuur 2I).
highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50321/50321fig1.jpg "/>
Figuur 1. Een schematische tijdslijn voor de neuronale differentiatie proces.
Figuur 2. Beelden markeren cellen tijdens een aantal kritische stadia tijdens neuronale differentiatie. (A) Human SER's werden gekweekt voor 4 dagen. Fasebeelden die de vorming van aggregaten ESC (B) en neuro-epitheliale cellen (C). Op 24 dagen na differentiatie van hESC 'de meeste NE + cellen FOXG1 maar HOXB4 - (D). De telencephalic voorlopers (FOXG1 +) waren PAX6 + (E) maar NKX2.1 - (F) na 1 maand differentiatie. Na twee additioneleweken (6 weken totaal) van differentiatie van de cellen op de dekglaasjes, de meeste kleurden positief voor glutamaat marker TBR1 (G, H) en de neuronale markers βIII-tubuline (G) en MAP2 (H). Na acht weken differentiatie, de cellen waren positief voor de rijpe glutamaat marker, vGLUT1 (I). Schaal van de balk: 100 urn (A), 50 pm (BI). (DI zijn op basis van onze eerdere publicatie 27 met toestemming).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er zijn verschillende kritische stappen tijdens het neurale differentiatieproces. Het is belangrijk dat de menselijke loketten pluripotent zijn omdat anders de cellen al voorgespannen richting van een niet-neuronale oorsprong. Dit wordt bevestigd door het kleuren van de menselijke loketten met antilichamen tegen pluripotentie markers zoals Oct4, SOX2, NANOG en Tra-1-60 1-3. Als de menselijke PSC's niet goed hechten na passage hen kan ROCK inhibitor (Y27632) worden toegevoegd om te helpen. Voor diegenen die moeite behouden hun cellen pluripotent, sommige potentiële problemen zijn / densiteit van MEF cellen, evenals de veel KOSR wordt gebruikt als er variatie van partij tot partij. Hoewel MEF voedingscellen zijn gebruikt om PSC in de bovenstaande protocol te handhaven, werkt deze methode ook voor PSC die gekweekt met feeder-vrije systemen.
Als de cellen worden opengebroken om de PSC aggregaten, is het belangrijk limhet hun dispase blootstelling aan slechts een paar minuten (de randen afgerond). De tijd die het duurt voordat de randen van de iPSCs (tot 10 min) doorgaans langer is dan die van de SER (3-5 min). Het allerbeste is om de dispase aan slechts een plaat van menselijke PSC tegelijk dat de cellen niet in het enzym te lang dit kan schaden of zelfs doden cellen. Nadat de cellen zijn in de PSC totale fase is het belangrijk om de cellen op een laag dichtheid. De dichtheid is ook heel belangrijk wanneer de PSC aggregaten zijn verguld. Deze cellen zal uitbreiden op de plaat in de komende paar dagen en voorzorgen moeten worden genomen om ervoor te zorgen dat ze niet zal raken nadat ze groter worden. Tijdens de bevestiging stap (2.2), is het noodzakelijk dat de cellen geen langdurige blootstelling aan de FBS hebben omdat dit de genexpressie beïnvloeden. Voor het isoleren van de neuro cellen is ook belangrijk om krassen van de niet-neuronale clusters om een pure opleverencelpopulatie. Als men wilde karakteriseren of hun cellen worden in te gaan op de neuronale oorsprong, kunnen verschillende factoren worden gekeken, zoals Pax6 of SOX1. Pax6 draait op rond dag 10 tijdens de neurale differentiatie en SOX1 bochten door 2 weken na differentiatie 12,26,30.
Dit protocol is in de voorhoede van neurale differentiatie als het recapituleert vele stappen die plaatsvinden tijdens de ontwikkeling van het menselijk zenuwstelsel. Zonder het gebruik van caudalizing factoren (retinoic zure, basische FGF), neuro cellen efficiënt differentiëren in telencephalic voorlopercellen, die samenvalt met neuroectoderm cellen eerst verwerven rostrale fenotype tijdens in vivo ontwikkeling 31. Deze telencephalic voorouders bezitten een dorsale fenotype als gevolg van endogene Wnt signalering die dorsalizes de cellen 27. Dit systeem genereert dorsale voorlopercellen die vervolgens kunnen verder gedifferentieerd worden in glutamaat cels. Hoewel dit celtype is heel belangrijk, het is niet de enige celtype dat dit systeem kan vormen betekent. Zo is de toevoeging van SHH aangetoond dat de cellen ventralize, waardoor ze differentiëren tot cellen GABAergic 27,32. Het is zelfs gebleken dat deze hESC afgeleid GABAergic neuronen kan worden getransplanteerd in muizen en zij kunnen motorische gebreken als gevolg van hersenletsel 32 corrigeren. Omdat het protocol dat wordt aangetoond in dit artikel gaat door de stapsgewijze checkpoints, biedt het een hulpmiddel om een breed scala van cellen te produceren in het menselijk zenuwstelsel die slechts beperkt wordt door ons begrip van ontwikkeling en onze verbeelding.
Het vermogen om menselijke neuronen vormen van PSC opent een groot aantal deuren van zowel een fundamentele wetenschap en een klinisch perspectief. Postmortem weefsel bronnen zijn beperkt en de kwaliteit kan variëren, terwijl de menselijke PSC differentiatie stelt onderzoekers in staat toe te geven eenonbeperkt en constante aanvoer van cellen te werken. Met de komst van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) technologie 1,3,33,34, is het nu mogelijk om hESC-achtige cellen van patiënt fibroblasten waaronder die met verschillende ziekten 35-38 krijgen. Zoals blijkt uit onze groep 28 evenals vele anderen, heeft de succesvolle productie van neuronen van IPSC is en blijft een uniek en nuttig hulpmiddel voor mensen die lang hebben gezocht menselijke modellen voor de ziekte van en ontwikkeling. Bovendien hebben verschillende groepen aangetoond dat PSC afgeleide neuronen kan dus bepaalde aspecten van het ziekteproces 36,37,39-42 model en kan worden gebruikt om te screenen therapeutische verbindingen 43. Dit is zeer bemoedigend want zonder een goed model systeem kandidaatgeneesmiddelen testen het centrale zenuwstelsel met slechts 8% van hen is aangetoond dat klinisch effectieve 44. Dit kan echter methode en anderen zoals het helpen om drastisch te verbeteren eis nummer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
De auteurs willen graag Dr Y. Sasai bedanken voor royaal verstrekken van de FOXG1 antilichaam. Dit werk werd ondersteund door Connecticut Stem Cell Research Grants (08-SCB-UCHC- 022 en 11-SCB24) en spastische paraplegie Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12) | Gibco | 11330-032 | |
| Knockout Serum Replacer | Gibco | 10828-028 | |
| L-glutamine (200 mM) | Gibco | 25030 | |
| Non Essential Amino Acids | Gibco | 1140-050 | |
| 2-Mercapt–thanol (14.3 M) | Sigma | M-7522 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| B27 | Gibco | 12587-010 | |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine) | Sigma | 116K5103 | |
| Laminin (human) | Sigma | L-6274 | |
| Laminin (mouse) | Invitrogen | 23017-015 | |
| FBS | Gemini | 100-106 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A-7906 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Collagenase | Invitrogen | 17104-019 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| ROCK Inhibitor | Stemgent | 04-0012 | |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010 | |
| Dorsomorphin | Stemgent | 04-0024 | |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF) | Invitrogen | 13256-029 | |
| Trypsin inhibitor | Gibco | 17075 | |
| 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | |
| Foxg1 antibody | Dr. Y. Sasai | ||
| Hoxb4 antibody (1:50) | Developmental Studies Hybridoma Bank | I12 | |
| Pax6 antibody (1:5000) | Developmental Studies Hybridoma Bank | PAX6 | |
| Nkx2.1 antibody (1:200) | Chemicon | MAB5460 | |
| Tbr1 antibody (1:2000) | Chemicon | AB9616 | |
| vGLUT1 antibody (1:100) | Synaptic Systems | 135302 | |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) | PrepoTech Inc. | 450-02 | |
| Glial derived neurotrophic factor (GDNF) | PrepoTech Inc. | 450-10 | |
| Insulin growth factor 1 (IGF1) | PrepoTech Inc. | 100-11 | |
| Cyclic AMP (cAMP) | Sigma | D-0260 | |
| Sonic hedgehog (SHH) | R&D | 1845-SH | |
| 50 ml tubes | Becton Dickinson (BD) | 352098 | |
| 15 ml tubes | BD | 352097 | |
| 6 well plates | BD | 353046 | |
| 24 well plates | BD | 353047 | |
| T25 flasks (untreated) | BD | 353009 | |
| T75 flasks (untreated) | BD | 353133 | |
| Coverslips | Chemiglass Life Sciences | 1760-012 | |
| 6 cm Petri dishes | BD | 353004 | |
| 9'' glass pipetes | Fisher | 13-678-20D | |
| Steriflip filters (0.22 μM) | Millipore | SCGP00525 | |
| Stericup filters 1,000 ml (0.22 μM) | Millipore | SCGPU10RE | |
| Phase contrast microscope (Observer A1) | Zeiss | R2625 | |
| Carbon dioxide incubator (Hera Cell 150) | Thermo Electron Corporation | ||
| Biosafety hood (Sterilgard III Advance) | The Baker Company | ||
| Centrifuge (5702 R) | Eppendorf |
References
- Takahashi, K., Tanabe, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Yu, J., Vodyanik, M. A., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Jessell, T. M. Neuronal specification in the spinal cord: inductive signals and transcriptional codes. Nat. Rev. Genet. 1, 20-29 (1038).
- Wilson, S. I., Edlund, T. Neural induction: toward a unifying mechanism. Nat. Neurosci. 4, 1161-1168 (2001).
- Reubinoff, B. E., Itsykson, P., et al. Neural progenitors from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 1134-1140 (2001).
- Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 1129-1133 (2001).
- Hu, B. Y., Weick, J. P., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4335-4340 (2010).
- Singh Roy, N., Nakano, T., et al. Enhancer-specified GFP-based FACS purification of human spinal motor neurons from embryonic stem cells. Exp. Neurol. 196, 224-234 (2005).
- Lee, H., Shamy, G. A., et al. Directed differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived motoneurons. Stem Cells. 25, 1931-1939 (2007).
- Boulting, G. L., Kiskinis, E., et al. A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells. Nat. Biotechnol. 29, 279-286 (2011).
- Li, X. J., Du, Z. W., et al. Specification of motoneurons from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 23, 215-221 (2005).
- Perrier, A. L., Tabar, V., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 12543-12548 (2004).
- Roy, N. S., Cleren, C., et al. Functional engraftment of human ES cell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes. Nat Med. 12, 1259-1268 (2006).
- Yan, Y., Yang, D., et al. Directed differentiation of dopaminergic neuronal subtypes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 23, 781-790 (2005).
- Meyer, J. S., Shearer, R. L., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 16698-16703 (2009).
- Osakada, F., Ikeda, H., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 26, 215-224 (2008).
- Carpenter, M. K., Inokuma, M. S., et al. Enrichment of neurons and neural precursors from human embryonic stem cells. Exp. Neurol. 172, 383-397 (2001).
- Chambers, S. M., Fasano, C. A., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat. Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
- Chambers, S. M., Qi, Y., et al. Combined small-molecule inhibition accelerates developmental timing and converts human pluripotent stem cells into nociceptors. Nat. Biotechnol. 30, 715-720 (2012).
- Kawasaki, H., Mizuseki, K., et al. Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron. 28, 31-40 (2000).
- Rubenstein, J. L., Beachy, P. A. Patterning of the embryonic forebrain. Curr. Opin. Neurobiol. 8, 18-26 (1998).
- Hevner, R. F., Hodge, R. D., Daza, R. A., Englund, C. Transcription factors in glutamatergic neurogenesis: conserved programs in neocortex, cerebellum, and adult hippocampus. Neurosci. Res. 55, 223-233 (2006).
- Watanabe, K., Kamiya, D., et al. Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nat. Neurosci. 8, 288-296 (2005).
- Watanabe, K., Ueno, M., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Pankratz, M. T., Li, X. J., et al. Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage. Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).
- Li, X. J., Zhang, X., et al. Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells. Development. 136, 4055-4063 (2009).
- Zeng, H., Guo, M., et al. Specification of region-specific neurons including forebrain glutamatergic neurons from human induced pluripotent stem cells. PLoS One. 5, e11853 (2010).
- Kim, D. S., Lee, J. S., et al. Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity. Stem Cell Rev. 6, 270-281 (2010).
- Zhang, X., Huang, C. T., et al. Pax6 is a human neuroectoderm cell fate determinant. Cell Stem Cell. 7, 90-100 (2010).
- Stern, C. D. Initial patterning of the central nervous system: how many organizers. Nat. Rev. Neurosci. 2, 92-98 (2001).
- Ma, L., Hu, B., et al. Human embryonic stem cell-derived GABA neurons correct locomotion deficits in quinolinic acid-lesioned mice. Cell Stem Cell. 10, 455-464 (2012).
- Li, W., Wei, W., et al. Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors. Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).
- Lowry, W. E., Richter, L., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).
- Dimos, J. T., Rodolfa, K. T., et al. Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons. Science. 321, 1218-1221 (2008).
- Ebert, A. D., Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
- Lee, G., Papapetrou, E. P., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
- Park, I. H., Arora, N., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134, 877-886 (2008).
- Chamberlain, S. J., Chen, P. F., et al. Induced pluripotent stem cell models of the genomic imprinting disorders Angelman and Prader-Willi syndromes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 17668-17673 (2010).
- Kiskinis, E., Eggan, K. Progress toward the clinical application of patient-specific pluripotent stem cells. J. Clin. Invest. 120, 51-59 (2010).
- Koch, P., Tamboli, I. Y., et al. Presenilin-1 L166P mutant human pluripotent stem cell-derived neurons exhibit partial loss of gamma-secretase activity in endogenous amyloid-beta generation. Am. J. Pathol. 180, 2404-2416 (2012).
- Walsh, R. M., Hochedlinger, K. Modeling Rett syndrome with stem cells. Cell. 143, 499-500 (2010).
- Egawa, N., Kitaoka, S., et al. Drug Screening for ALS Using Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cells. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
- Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates. Nature Reviews Drug Discovery. 3, 711-716 (2004).
