In vivo Måling af Mouse Pulmonal endoteloverfladen Layer
Summary
Den endotel glycocalyx / endoteloverflade lag er ideelt undersøgt ved hjælp intravital mikroskopi. Intravital mikroskopi er teknisk udfordrende i en bevægelig organ, såsom lungen. Vi viser, hvordan samtidig lysfelt-og fluorescensmikroskopi kan anvendes til at estimere endoteloverflade lagtykkelse i en frit bevæge<em> In vivo</em> Muselunge.
Abstract
Den endotheliale glycocalyx er et lag af proteoglycaner og tilhørende glycosaminoglycaner foring det vaskulære lumen. In vivo er glycocalyx kraftigt hydratiserede, danner en væsentlig endotel overfladelag (ESL), der bidrager til opretholdelsen af endotelfunktion. Da den endotele glycocalyx er ofte afvigende in vitro og forsvinder under standard vævsfiksering teknikker, undersøgelse af ESL kræver anvendelse af intravital mikroskopi. For bedst at tilnærme den komplekse fysiologi alveolar mikrovaskulatur, er pulmonal intravital billeddannelse ideelt udført på en frit bevægelig lunge. Disse præparater er imidlertid typisk lider omfattende bevægelsesartefakter. Vi viser, hvordan lukkede brystet intravital mikroskopi af en frit bevægelig muselunge kan anvendes til at måle glycocalyx integritet via ESL udelukkelse af fluorescens-mærkede højmolekylære dextraner fra den endoteloverfladen. Denne manglende inddrivelse kirurgisk teknik, som kræversamtidig lysfelt og fluorescerende billeddannelse af muselunge, tillader langsgående observation af subpleural mikrovaskulatur uden tegn på at inducere confounding lungeskade.
Introduction
Den endotheliale glycocalyx er et ekstracellulært lag af proteoglycaner og tilhørende glycosaminoglycaner foring vaskulære intima. In vivo er glycocalyx kraftigt hydratiserede, danner en væsentlig endotel overfladelag (ESL), der regulerer en række forskellige endotheliale funktioner, herunder fluidpermeabilitet 1, neutrofil-endothelial adhæsion 2 og mechanotransduction af fluid forskydningsspænding 3.
Historisk set har glycocalyx været undervurderet på grund af sin aberrance i dyrkede cellepræparater 4, 5 og dens nedbrydning under standard tissue fiksering og bearbejdning 6. Den stigende brug 7 i intravital mikroskopi (in vivo mikroskopi, IVM) falder sammen med øget videnskabelig interesse i betydningen af ESL til vaskulær funktion under sundhed og sygdom. ESL er usynlig for lysmikroskopi og ikke nemt kan mærkes ivivo, i betragtning af den tilbøjelighed fluorescerende glycocalyx-bindende lectiner at forårsage RBC agglutination 8 og fatal lungeemboli (upublicerede observationer). Adskillige indirekte metoder er derfor blevet udviklet til at udlede ESL tykkelse (og i forlængelse heraf, glycocalyx integritet) i ikke-bevægelige kar såsom cremasteric og mesenteriallymfeknuderne microcirculations. Disse teknikker indbefatter måling af forskelle i cirkulerende mikropartikel hastighed som en funktion af afstanden fra den endotele membran (mikropartikel billede Velocimetry 9) samt måling af udelukkelsen af voluminøse, fluorescens-mærkede vaskulære markører (fx dextraner) fra endoteloverfladen (dextran udelukkelse teknikken 10, 11). Af disse teknikker, er kun dextran udelukkelse stand til at anslå ESL tykkelse fra målinger foretaget på et enkelt tidspunkt. Ved samtidig måling vaskulære bredder ved hjælp brightfield mikroskopi (en bredde iclusive af "usynlig" ESL) og fluorescensmikroskopi af en vaskulær sporstof udelukket fra ESL, kan ESL tykkelsen beregnes som halvdelen af forskellen mellem vaskulære bredder 2.
Anvendelsen af en øjeblikkelig foranstaltning ESL tykkelse er velegnet til undersøgelse af lunge-glycocalyx. Intravital mikroskopi af lungen er udfordrende, da signifikant pulmonal og hjerte bevægelsesartefakter. Mens nylige fremskridt muliggør immobilisering af muselunger in vivo 12, 13, eksisterer bekymringer med hensyn til fysiologiske virkninger af lunge stasis. Lung immobilitet er forbundet med nedsat endotel nitrogenoxid signalering 14, en signalvej, der påvirker både neutrofiladhæsion 15 og lungebeskadigelse 16. Endvidere immobilisering af et område af lungen udsætter omgivende mobile alveoli til skadelige forskydningskræfter (såkaldt "atelectrauma"), i overensstemmelse med de klassiske fysiologiske begrebernealveolær afhængighed 17.
I 2008 udviklede Arata Tabuchi, Wolfgang Kuebler og kolleger en kirurgisk teknik giver mulighed for intravital mikroskopi af et frit bevægelse muselunge 18. Respiratory artefakt som følge af denne teknik kan neutraliseres ved hjælp af high-speed billedbehandling, herunder samtidig måling af lysfelt og fluorescensmikroskopi. I denne rapport detalje vi hvorledes øjeblikkelig dextran udelukkelse billeddannelse kan anvendes til at måle ESL tykkelse i subpleural mikrocirkulation af et frit-bevægelse, in vivo muse lunge. Denne teknik kan let modificeres til bestemmelse glycocalyx funktion-specifikt evnen hos et intakt ESL at udelukke cirkulerende elementer fra endoteloverfladen. Vi har for nylig anvendt disse teknikker til at bestemme betydningen af pulmonal ESL integritet til udviklingen af akut lungeskade ved systemiske inflammatoriske sygdomme, såsom sepsis 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sammenfaldende med den stigende anvendelse af in vivo mikroskopi, er der stigende forståelse for både den betydelige størrelse af ESL samt dens mange bidrag til vaskulær funktion. Disse nye data er imidlertid først og fremmest stammer fra studier af den systemiske kar. Faktisk brug af in vivo mikroskopi i lungen er teknisk udfordrende, da signifikant pulmonal og hjerte bevægelsesartefakter.
Adskillige seneste tekniske fremskridt har tilladt til stabilisering …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Drs. Arata Tabuchi og Wolfgang Kuebler (University of Toronto) for instruktion vedrørende intravital mikroskopi. Vi takker Andrew Cahill (Nikon Instruments) for at få hjælp i mikroskopi design og implementering. Dette arbejde blev finansieret af NIH / NHLBI tilskud P30 HL101295 og K08 HL105538 (til EPS).
Materials
| Name of Reagent | |||
| FITC-dextran (150 kDa) | Sigma | FD150S | |
| TRITC-dextran (150 kDa) | Sigma | T1287 | |
| Streptavidin-coated fluorescent microspheres | Bangs Laboratories | CP01F/10428 | Dragon Green fluorescence (similar to FITC) |
| Ketamine | Moore Medical | ||
| Xylazine | Moore Medical | ||
| Anti-ICAM-1 biotinylated antibody | eBioscience | Clone YN1/1.7.4 | 1:50 dilution |
| Isotype biotinylated antibody | eBioscience | IgG2b eB149/10H5 | 1:50 dilution |
| EQUIPMENT | |||
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | Inspira | |
| Tracheostomy catheter | Harvard Apparatus | 730028 | |
| Electrocautery apparatus | DRE Medical | Valleylab SSE-2L | |
| Bipolar cautery forceps | Olsen Medical | 10-1200I | 9.9cm McPherson |
| Temperature control system | World Precision Instruments | ATC1000 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | Pump 11 Elite | |
| Microscope (widefield) | Nikon | LV-150 | |
| Microscope (confocal) | Nikon | A1R | |
| Image splitter | Photometrics | DV2 | |
| CCD camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 | |
| Image processing software | Nikon | NIS Elements | |
| Polyvinylidene membrane | Kure Wrap | ||
| Circular cover slip | Bellco | 5CIR-1-BEL | 5 mm, #1 thickness |
| Glue (cover slip to membrane) | Pattex | Flussig (liquid) | For affixing cover slip to membrane |
| Glue (cover slip to mouse) | Pattex | Gel | For attaching membrane to mouse |
| Surgical tubing | Intramedic | PE50, PE10 | |
| Suture | Fisher | 4:0 silk | |
| Electric razor | Oster | 78997 | |
| Curved surgical forceps | Roboz | ||
| Straight surgical forceps | Roboz | ||
| Surgical scissors | Roboz | ||
| Surgical microscissors | Roboz | ||
| Surgical needle driver | Roboz | ||
| Surgical tape | Fisher | ||
| Kitchen sponges (cut into wedges) | various |
References
- Negrini, D., Tenstad, O., Passi, A., Wiig, H. Differential degradation of matrix proteoglycans and edema development in rabbit lung. AJP – Lung Cellular and Molecular Physiology. 290, L470-L477 (2006).
- Schmidt, E. P., et al. The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis. Nat. Med. 18, 1217-1223 (2012).
- Florian, J. A., et al. Heparan sulfate proteoglycan is a mechanosensor on endothelial cells. Circ. Res. 93, e136-e142 (2003).
- Chappell, D., et al. The Glycocalyx of the Human Umbilical Vein Endothelial Cell: An Impressive Structure Ex Vivo but Not in Culture. Circulation Research. 104, 1313-1317 (2009).
- Potter, D. R., Damiano, E. R. The hydrodynamically relevant endothelial cell glycocalyx observed in vivo is absent in vitro. Circ. Res. 102, 770-776 (2008).
- Weinbaum, S., Tarbell, J. M., Damiano, E. R. The Structure and Function of the Endothelial Glycocalyx Layer. Annual Review of Biomedical Engineering. 9, 121-167 (2007).
- Pittet, M., Weissleder, R. Intravital Imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
- Kilpatrick, D. C., Graham, C., Urbaniak, S. J., Jeffree, C. E., Allen, A. K. A comparison of tomato (Lycopersicon esculentum) lectin with its deglycosylated derivative. Biochem. J. 220, 843-847 (1984).
- Smith, M. L., Long, D. S., Damiano, E. R., Ley, K. Near-wall micro-PIV reveals a hydrodynamically relevant endothelial surface layer in venules in vivo. Biophys. J. 85, 637-645 (2003).
- Vink, H., Duling, B. R. Identification of Distinct Luminal Domains for Macromolecules, Erythrocytes, and Leukocytes Within Mammalian Capillaries. Circ. Res. 79, 581-589 (1996).
- Marechal, X., et al. Endothelial glycocalyx damage during endotoxemia coincides with microcirculatory dysfunction and vascular oxidative stress. Shock. 29, 572-576 (2008).
- Presson, R. G., et al. Two-Photon Imaging within the Murine Thorax without Respiratory and Cardiac Motion Artifact. The American Journal of Pathology. 179, 75-82 (2011).
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat. Meth. 8, 91-96 (2011).
- Pearse, D. B., Wagner, E. M., Permutt, S. Effect of ventilation on vascular permeability and cyclic nucleotide concentrations in ischemic sheep lungs. J. Appl. Physiol. 86, 123-132 (1999).
- Hossain, M., Qadri, S., Liu, L. Inhibition of nitric oxide synthesis enhances leukocyte rolling and adhesion in human microvasculature. Journal of Inflammation. 9, 28 (2012).
- Schmidt, E. P., et al. Soluble guanylyl cyclase contributes to ventilator-induced lung injury in mice. AJP – Lung Cellular and Molecular Physiology. 295, L1056-L1065 (2008).
- Mead, J., Takishima, T., Leith, D. Stress distribution in lungs: a model of pulmonary elasticity. J. Appl. Physiol. 28, 596-608 (1970).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. J. Appl. Physiol. 104, 338-346 (2008).
- Gattinoni, L., Protti, A., Caironi, P., Carlesso, E. Ventilator-induced lung injury: the anatomical and physiological framework. Crit. Care Med. 38, 539-548 (2010).
- Tabuchi, A., Kim, M., Semple, J. W., Kuebler, W. M. Acute Lung Injury Causes Pendelluft Between Adjacent Alveoli In Vivo. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 183, A2490 (2011).
- Roebuck, K. A., Finnegan, A. Regulation of intercellular adhesion molecule-1 (CD54) gene expression. J. Leukoc. Biol. 66, 876-888 (1999).
