In vivo Måling av Mouse Pulmonal endotel Overflatesjikt
Summary
Endothelial glycocalyx / endothelial overflaten er ideelt studert ved hjelp intravital mikroskopi. Intravital mikroskopi er teknisk utfordrende i et bevegelig organ for eksempel lunger. Vi demonstrerer hvordan simultan lysfelt og fluorescerende mikroskopi kan brukes for å estimere endotelisk beleggtykkelse i en fritt bevegelige<em> In vivo</em> Mus lunge.
Abstract
Endothelial glycocalyx er et lag av proteoglykaner og tilknyttede glykosaminoglykaner lining vaskulær lumen. In vivo er glycocalyx svært hydrert og danner en betydelig endotelial overflatelag (ESL) som bidrar til opprettholdelse av endotelfunksjon. Som det endoteliale glycocalyx ofte avvikende in vitro og går tapt under standard vev fiksering teknikker, krever et studium av ESL bruk av intravital mikroskopi. Til beste omtrentlig den komplekse fysiologi av alveolar microvasculature, er pulmonal intravital bildebehandling ideell utført på en fritt bevegelige lunge. Disse preparatene, men vanligvis lider omfattende bevegelsesartefakter. Vi demonstrerer hvordan lukket brystet intravital mikroskopi av en fritt bevegelig mus lunge kan brukes til å måle glycocalyx integritet via ESL uttrekk av fluorescensmerket-merkede høymolekylære dextraner fra endoteliale overflate. Denne ikke-recovery kirurgisk teknikk, som kreversamtidig lysfelt og fluoriserende avbildning av musen lunge, åpner for langsgående observasjon av subpleural microvasculature uten tegn på å indusere confounding lungeskade.
Introduction
Endothelial glycocalyx er en ekstracellulær lag av proteoglykaner og tilknyttede glykosaminoglykaner lining vaskulær intima. In vivo er glycocalyx svært hydrert og danner en betydelig endotelial overflatelag (ESL) som regulerer en rekke av endoteliale funksjoner inkludert fluid permeabilitet 1, nøytrofil-endotelial adhesjon 2, og mechanotransduction av væske skjærspenning 3.
Historisk har glycocalyx vært underappreciated grunnet sin aberrance i dyrkede cellepreparater 4, 5 og dens nedbrytning ved standard vev fiksering og prosessering 6. Den økende bruken 7 av intravital mikroskopi (in vivo mikroskopi, IVM) har falt sammen med økt vitenskapelig interesse i betydningen av ESL til vaskulær funksjon under helse og sykdom. ESL er usynlig for lysmikroskopi og kan ikke være lett merkes ivivo, gitt tilbøyelighet fluorescerende glycocalyx-bindende lektiner å forårsake RBC agglutinasjon 8 og dødelig lungeemboli (upubliserte observasjoner). Flere indirekte tilnærminger har derfor blitt utviklet for å utlede ESL tykkelse (og i forlengelsen, glycocalyx integritet) i ikke-bevegelige vaskulære senger som de cremasteric og mesenteric microcirculations. Disse teknikkene omfatter måling av forskjeller i sirkulerende mikropartikkel hastighet som en funksjon av avstand fra den endoteliske membran (mikropartikkel image velocimetry 9) samt måling av utelukkelsen av voluminøse, fluorescensmerket-merkede vaskulære markører (f.eks dextraner) fra endoteliale overflate (dekstran uttrekk teknikk 10, 11). Av disse teknikkene, er bare dekstran utelukkelse kan estimere ESL tykkelse fra målinger gjort på et enkelt tidspunkt. Ved samtidig å måle vaskulære bredder hjelp lysfelt mikroskopi (en bredde iclusive av "usynlig" ESL) og fluorescerende mikroskopi av en vaskulær sporstoff ekskludert fra ESL kan ESL tykkelse beregnes som en halv forskjellen mellom vaskulære bredder 2.
Bruken av en momentan mål på ESL tykkelse er velegnet for studie av pulmonal glycocalyx. Intravital mikroskopi av lunge er utfordrende, gitt betydelige lunge-og hjerte bevegelsesartefakter. Mens siste fremskritt tillate immobilisering av mus lungene i 12 vivo, 13, eksisterer bekymringer om fysiologiske virkningen av lunge stasis. Lunge immobilitet er assosiert med redusert endothelial nitrogenoksid signalering 14, en signalveien som påvirker både nøytrofile heft 15 og lungeskade 16. Videre, immobilisering av et område av lunge eksponerer omkringliggende mobile alveolene skadelige skjærkrefter (såkalte "atelectrauma"), i samsvar med de klassiske fysiologiske begrepenealveolar avhengighet 17.
I 2008 utviklet Arata Tabuchi, Wolfgang Kuebler og kolleger en kirurgisk teknikk som åpner for intravital mikroskopi av en fritt bevegelig mus lunge 18. Respiratory gjenstand som følger av denne teknikken kan være negated ved bruk av high-speed bildebehandling, inkludert samtidig måling av lysfelt og fluoriserende mikroskopi. I denne rapporten detalj vi hvordan momentant dekstran utelukkelse bildebehandling kan benyttes til å måle ESL tykkelse i subpleural mikrosirkulasjonen av en fritt-bevegelse, in vivo mus lunge. Denne teknikken kan enkelt endres for å avgjøre glycocalyx funksjon-spesifikt, muligheten for en intakt ESL å utelukke sirkulerende elementer fra endothelial overflaten. Vi har nylig brukt disse teknikker for å bestemme betydningen av pulmonal ESL integritet til utvikling av akutt lungeskade under systemiske inflammatoriske sykdommer som sepsis 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sammenfallende med den ekspanderende bruken av in vivo mikroskopi, er det en økende forståelse for både betydelig størrelse av ESL samt sine tallrike bidrag til vaskulær funksjon. Disse nye data, men er først og fremst avledet fra studier av den systemiske vaskulatur. Faktisk bruk av in vivo mikroskopi i lungene er teknisk utfordrende, gitt betydelige lunge-og hjerte bevegelsesartefakter.
Flere siste tekniske fremskritt har tillatt for stabilisering av den be…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker legene. Arata Tabuchi og Wolfgang Kuebler (University of Toronto) for instruksjon om intravital mikroskopi. Vi takker Andrew Cahill (Nikon Instruments) for å få hjelp i mikroskopi design og implementering. Dette arbeidet ble finansiert av NIH / NHLBI tilskudd P30 HL101295 og K08 HL105538 (til EPS).
Materials
| Name of Reagent | |||
| FITC-dextran (150 kDa) | Sigma | FD150S | |
| TRITC-dextran (150 kDa) | Sigma | T1287 | |
| Streptavidin-coated fluorescent microspheres | Bangs Laboratories | CP01F/10428 | Dragon Green fluorescence (similar to FITC) |
| Ketamine | Moore Medical | ||
| Xylazine | Moore Medical | ||
| Anti-ICAM-1 biotinylated antibody | eBioscience | Clone YN1/1.7.4 | 1:50 dilution |
| Isotype biotinylated antibody | eBioscience | IgG2b eB149/10H5 | 1:50 dilution |
| EQUIPMENT | |||
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | Inspira | |
| Tracheostomy catheter | Harvard Apparatus | 730028 | |
| Electrocautery apparatus | DRE Medical | Valleylab SSE-2L | |
| Bipolar cautery forceps | Olsen Medical | 10-1200I | 9.9cm McPherson |
| Temperature control system | World Precision Instruments | ATC1000 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | Pump 11 Elite | |
| Microscope (widefield) | Nikon | LV-150 | |
| Microscope (confocal) | Nikon | A1R | |
| Image splitter | Photometrics | DV2 | |
| CCD camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 | |
| Image processing software | Nikon | NIS Elements | |
| Polyvinylidene membrane | Kure Wrap | ||
| Circular cover slip | Bellco | 5CIR-1-BEL | 5 mm, #1 thickness |
| Glue (cover slip to membrane) | Pattex | Flussig (liquid) | For affixing cover slip to membrane |
| Glue (cover slip to mouse) | Pattex | Gel | For attaching membrane to mouse |
| Surgical tubing | Intramedic | PE50, PE10 | |
| Suture | Fisher | 4:0 silk | |
| Electric razor | Oster | 78997 | |
| Curved surgical forceps | Roboz | ||
| Straight surgical forceps | Roboz | ||
| Surgical scissors | Roboz | ||
| Surgical microscissors | Roboz | ||
| Surgical needle driver | Roboz | ||
| Surgical tape | Fisher | ||
| Kitchen sponges (cut into wedges) | various |
References
- Negrini, D., Tenstad, O., Passi, A., Wiig, H. Differential degradation of matrix proteoglycans and edema development in rabbit lung. AJP – Lung Cellular and Molecular Physiology. 290, L470-L477 (2006).
- Schmidt, E. P., et al. The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis. Nat. Med. 18, 1217-1223 (2012).
- Florian, J. A., et al. Heparan sulfate proteoglycan is a mechanosensor on endothelial cells. Circ. Res. 93, e136-e142 (2003).
- Chappell, D., et al. The Glycocalyx of the Human Umbilical Vein Endothelial Cell: An Impressive Structure Ex Vivo but Not in Culture. Circulation Research. 104, 1313-1317 (2009).
- Potter, D. R., Damiano, E. R. The hydrodynamically relevant endothelial cell glycocalyx observed in vivo is absent in vitro. Circ. Res. 102, 770-776 (2008).
- Weinbaum, S., Tarbell, J. M., Damiano, E. R. The Structure and Function of the Endothelial Glycocalyx Layer. Annual Review of Biomedical Engineering. 9, 121-167 (2007).
- Pittet, M., Weissleder, R. Intravital Imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
- Kilpatrick, D. C., Graham, C., Urbaniak, S. J., Jeffree, C. E., Allen, A. K. A comparison of tomato (Lycopersicon esculentum) lectin with its deglycosylated derivative. Biochem. J. 220, 843-847 (1984).
- Smith, M. L., Long, D. S., Damiano, E. R., Ley, K. Near-wall micro-PIV reveals a hydrodynamically relevant endothelial surface layer in venules in vivo. Biophys. J. 85, 637-645 (2003).
- Vink, H., Duling, B. R. Identification of Distinct Luminal Domains for Macromolecules, Erythrocytes, and Leukocytes Within Mammalian Capillaries. Circ. Res. 79, 581-589 (1996).
- Marechal, X., et al. Endothelial glycocalyx damage during endotoxemia coincides with microcirculatory dysfunction and vascular oxidative stress. Shock. 29, 572-576 (2008).
- Presson, R. G., et al. Two-Photon Imaging within the Murine Thorax without Respiratory and Cardiac Motion Artifact. The American Journal of Pathology. 179, 75-82 (2011).
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat. Meth. 8, 91-96 (2011).
- Pearse, D. B., Wagner, E. M., Permutt, S. Effect of ventilation on vascular permeability and cyclic nucleotide concentrations in ischemic sheep lungs. J. Appl. Physiol. 86, 123-132 (1999).
- Hossain, M., Qadri, S., Liu, L. Inhibition of nitric oxide synthesis enhances leukocyte rolling and adhesion in human microvasculature. Journal of Inflammation. 9, 28 (2012).
- Schmidt, E. P., et al. Soluble guanylyl cyclase contributes to ventilator-induced lung injury in mice. AJP – Lung Cellular and Molecular Physiology. 295, L1056-L1065 (2008).
- Mead, J., Takishima, T., Leith, D. Stress distribution in lungs: a model of pulmonary elasticity. J. Appl. Physiol. 28, 596-608 (1970).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. J. Appl. Physiol. 104, 338-346 (2008).
- Gattinoni, L., Protti, A., Caironi, P., Carlesso, E. Ventilator-induced lung injury: the anatomical and physiological framework. Crit. Care Med. 38, 539-548 (2010).
- Tabuchi, A., Kim, M., Semple, J. W., Kuebler, W. M. Acute Lung Injury Causes Pendelluft Between Adjacent Alveoli In Vivo. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 183, A2490 (2011).
- Roebuck, K. A., Finnegan, A. Regulation of intercellular adhesion molecule-1 (CD54) gene expression. J. Leukoc. Biol. 66, 876-888 (1999).
