Summary

Medición in vivo de la capa de ratón pulmonar superficie endotelial

Published: February 22, 2013
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Summary

El endotelio glicocalix / endotelial capa superficial está muy bien estudiada mediante microscopía intravital. Microscopía intravital es técnicamente difícil en un órgano en movimiento, como el pulmón. Se demuestra cómo simultánea campo claro y microscopía de fluorescencia se puede usar para estimar el espesor de capa de la superficie endotelial en un libremente moviendo<em> In vivo</em> Pulmón de ratón.

Abstract

El glicocálix endotelial es una capa de proteoglicanos y glicosaminoglicanos asociados que recubren el lumen vascular. In vivo, el glicocáliz es altamente hidratada, formando una capa sustancial superficie endotelial (ESL) que contribuye al mantenimiento de la función endotelial. A medida que el glicocalix endotelial es a menudo aberrante in vitro y se pierde durante las técnicas estándar de fijación del tejido, el estudio de la ESL requiere el uso de microscopía intravital. Para mejor se aproximan a la compleja fisiología de la microvasculatura alveolar, formación de imágenes intravital pulmonar se realiza idealmente en un pulmón de libre movimiento. Estas preparaciones, sin embargo, sufren típicamente de un artefacto de movimiento extensa. Se demuestra cómo tórax cerrado microscopía intravital de un pulmón de ratón libremente de movimiento se puede utilizar para medir la integridad del glicocálix a través de la exclusión de ESL fluorescente marcada con dextranos de alto peso molecular a partir de la superficie endotelial. Esta técnica quirúrgica no recuperación, que requierecampo claro y simultánea de imagen fluorescente de la pulmón de ratón, permite la observación longitudinal de la microvasculatura subpleural sin evidencia de la inducción de lesión pulmonar confusión.

Introduction

El glicocálix endotelial es una capa extracelular de proteoglicanos y glicosaminoglicanos asociados que recubren la íntima vascular. In vivo, el glicocáliz es altamente hidratada, formando una capa sustancial superficie endotelial (ESL) que regula una variedad de funciones endoteliales incluyendo permeabilidad del fluido 1, neutrófilos endotelial adhesión 2, y 3 de la mecanotransducción fluido esfuerzo cortante.

Históricamente, el glicocálix ha sido subestimado debido a su aberración en preparaciones de células cultivadas de 4, 5 y su degradación durante la fijación del tejido estándar y de procesamiento 6. El creciente uso de la microscopía intravital 7 (microscopía in vivo, IVM) ha coincidido con mayor interés científico en la importancia de la ESL para la función vascular en la salud y la enfermedad. El ESL es invisible para microscopía de luz y no pueden ser fácilmente etiquetados enin vivo, dada la propensión de fluorescentes glicocálix lectinas de unión a causar aglutinación de RBC 8 y embolia pulmonar no fatal (observaciones no publicadas). Varios enfoques indirectos, se han desarrollado para deducir espesor ESL (y, por extensión, la integridad glicocáliz) que no se mueven en los lechos vasculares tales como los microcirculations cremastéricos y mesentérica. Estas técnicas incluyen la medición de las diferencias en la velocidad de circulación de micropartículas como una función de la distancia de la membrana endotelial (velocimetría de imagen de micropartículas 9), así como la medición de la exclusión de los voluminosos, marcadas con fluorescencia marcadores vasculares (por ejemplo dextranos) de la superficie endotelial (técnica de exclusión de dextrano 10, 11). De estas técnicas, sólo la exclusión de dextrano es capaz de estimar ESL espesor de las mediciones realizadas en un solo punto en el tiempo. Midiendo simultáneamente anchuras vasculares usando microscopía de campo claro (una anchura enconcluyente de la "invisible" ESL) y microscopía de fluorescencia de un trazador vascular excluidos de la ESL, espesor ESL se puede calcular como la mitad de la diferencia entre las anchuras de 2 vasculares.

El uso de una medida instantánea de espesor ESL es muy adecuado para el estudio de la glicocálix pulmonar. Microscopía intravital del pulmón es un reto, dado artefacto significativo movimiento pulmonar y cardiaca. Aunque los avances recientes permiten la inmovilización de los pulmones del ratón in vivo 12, 13, existen dudas acerca del impacto fisiológico de pulmón estasis. Inmovilidad de pulmón se asocia con disminución de óxido nítrico endotelial señalización 14, una vía de señalización que afecta tanto a la adhesión de neutrófilos 15 y lesión pulmonar 16. Además, la inmovilización de un área de pulmón expone que rodea a los alvéolos móviles perjudiciales fuerzas de cizallamiento (la denominada "atelectrauma"), de acuerdo con los conceptos clásicos fisiológicos deinterdependencia alveolar 17.

En 2008, Arata Tabuchi, Kuebler Wolfgang y sus colegas desarrollaron una técnica quirúrgica que permite la microscopía intravital de un pulmón de ratón con libertad de movimiento 18. Artefacto respiratorio resultante de esta técnica puede ser negado por el uso de imágenes de alta velocidad, incluyendo la medición simultánea de campo claro y microscopía fluorescente. En este informe, se detalle cómo imagen instantánea exclusión dextrano se puede emplear para medir el espesor de ESL en la microcirculación subpleural de un pulmón de ratón de libre movimiento, in vivo. Esta técnica se puede modificar fácilmente para determinar glicocálix función, específicamente, la capacidad de un intacta ESL para excluir circulante elementos de la superficie endotelial. Recientemente hemos usado estas técnicas para determinar la importancia de la integridad pulmonar ESL para el desarrollo de lesión pulmonar aguda durante enfermedades inflamatorias sistémicas tales como sepsis 2.

Protocol

1. Preparación de tubos quirúrgicos, catéteres vasculares, Ventana pared torácica Etapa microscopía intravital. Hemos hecho a medida de una etapa de plexiglás sobre la que se encuentra el ratón anestesiado durante la microscopía. Esta etapa se adapta tanto a un 15 cm por 10 cm flexible, tabla de cortar de plástico (en la que el ratón se encuentra durante la inducción de la anestesia, la colocación de traqueotomía, y el cateterismo venoso), así como un elemento de calentamiento d…

Representative Results

El método experimental descrito en los pasos 1-6 se permitir la captura de fotogramas múltiples de DIC simultánea (claro) y las imágenes fluorescentes. Para determinar el espesor ESL, las imágenes grabadas se revisan por un observador ciego después de la finalización del protocolo experimental. El uso de un marco de enfoque, subpleural microvasos (<20 m de diámetro) se identifican, por lo menos 3 microvasos se encuentran típicamente en un solo cuadro (Figura 10). El uso de software de análi…

Discussion

Coincidiendo con la expansión del uso de microscopía in vivo, hay una creciente apreciación tanto para el gran tamaño de la ESL, así como sus numerosas contribuciones a la función vascular. Estos datos emergentes, sin embargo, se derivan principalmente de estudios de la vasculatura sistémica. En efecto, el uso de microscopía in vivo en el pulmón es técnicamente difícil, dado artefacto significativo movimiento pulmonar y cardíaco.

Varios avances…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a los Dres. Arata Tabuchi y Wolfgang Kuebler (Universidad de Toronto) para la instrucción con respecto a la microscopía intravital. Damos las gracias a Andrew Cahill (Nikon Instruments) para la asistencia en el diseño e implementación de microscopía. Este trabajo fue financiado por el NIH / NHLBI subvenciones P30 HL101295 y K08 HL105538 (a EPS).

Materials

Name of Reagent
FITC-dextran (150 kDa) Sigma FD150S
TRITC-dextran (150 kDa) Sigma T1287
Streptavidin-coated fluorescent microspheres Bangs Laboratories CP01F/10428 Dragon Green fluorescence (similar to FITC)
Ketamine Moore Medical
Xylazine Moore Medical
Anti-ICAM-1 biotinylated antibody eBioscience Clone YN1/1.7.4 1:50 dilution
Isotype biotinylated antibody eBioscience IgG2b eB149/10H5 1:50 dilution
EQUIPMENT
Mechanical ventilator Harvard Apparatus Inspira
Tracheostomy catheter Harvard Apparatus 730028
Electrocautery apparatus DRE Medical Valleylab SSE-2L
Bipolar cautery forceps Olsen Medical 10-1200I 9.9cm McPherson
Temperature control system World Precision Instruments ATC1000
Syringe pump Harvard Apparatus Pump 11 Elite
Microscope (widefield) Nikon LV-150
Microscope (confocal) Nikon A1R
Image splitter Photometrics DV2
CCD camera Photometrics CoolSNAP HQ2
Image processing software Nikon NIS Elements
Polyvinylidene membrane Kure Wrap
Circular cover slip Bellco 5CIR-1-BEL 5 mm, #1 thickness
Glue (cover slip to membrane) Pattex Flussig (liquid) For affixing cover slip to membrane
Glue (cover slip to mouse) Pattex Gel For attaching membrane to mouse
Surgical tubing Intramedic PE50, PE10
Suture Fisher 4:0 silk
Electric razor Oster 78997
Curved surgical forceps Roboz
Straight surgical forceps Roboz
Surgical scissors Roboz
Surgical microscissors Roboz
Surgical needle driver Roboz
Surgical tape Fisher
Kitchen sponges (cut into wedges) various

References

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Cite This Article
Yang, Y., Yang, G., Schmidt, E. P. In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer. J. Vis. Exp. (72), e50322, doi:10.3791/50322 (2013).

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