Medición in vivo de la capa de ratón pulmonar superficie endotelial
Summary
El endotelio glicocalix / endotelial capa superficial está muy bien estudiada mediante microscopía intravital. Microscopía intravital es técnicamente difícil en un órgano en movimiento, como el pulmón. Se demuestra cómo simultánea campo claro y microscopía de fluorescencia se puede usar para estimar el espesor de capa de la superficie endotelial en un libremente moviendo<em> In vivo</em> Pulmón de ratón.
Abstract
El glicocálix endotelial es una capa de proteoglicanos y glicosaminoglicanos asociados que recubren el lumen vascular. In vivo, el glicocáliz es altamente hidratada, formando una capa sustancial superficie endotelial (ESL) que contribuye al mantenimiento de la función endotelial. A medida que el glicocalix endotelial es a menudo aberrante in vitro y se pierde durante las técnicas estándar de fijación del tejido, el estudio de la ESL requiere el uso de microscopía intravital. Para mejor se aproximan a la compleja fisiología de la microvasculatura alveolar, formación de imágenes intravital pulmonar se realiza idealmente en un pulmón de libre movimiento. Estas preparaciones, sin embargo, sufren típicamente de un artefacto de movimiento extensa. Se demuestra cómo tórax cerrado microscopía intravital de un pulmón de ratón libremente de movimiento se puede utilizar para medir la integridad del glicocálix a través de la exclusión de ESL fluorescente marcada con dextranos de alto peso molecular a partir de la superficie endotelial. Esta técnica quirúrgica no recuperación, que requierecampo claro y simultánea de imagen fluorescente de la pulmón de ratón, permite la observación longitudinal de la microvasculatura subpleural sin evidencia de la inducción de lesión pulmonar confusión.
Introduction
El glicocálix endotelial es una capa extracelular de proteoglicanos y glicosaminoglicanos asociados que recubren la íntima vascular. In vivo, el glicocáliz es altamente hidratada, formando una capa sustancial superficie endotelial (ESL) que regula una variedad de funciones endoteliales incluyendo permeabilidad del fluido 1, neutrófilos endotelial adhesión 2, y 3 de la mecanotransducción fluido esfuerzo cortante.
Históricamente, el glicocálix ha sido subestimado debido a su aberración en preparaciones de células cultivadas de 4, 5 y su degradación durante la fijación del tejido estándar y de procesamiento 6. El creciente uso de la microscopía intravital 7 (microscopía in vivo, IVM) ha coincidido con mayor interés científico en la importancia de la ESL para la función vascular en la salud y la enfermedad. El ESL es invisible para microscopía de luz y no pueden ser fácilmente etiquetados enin vivo, dada la propensión de fluorescentes glicocálix lectinas de unión a causar aglutinación de RBC 8 y embolia pulmonar no fatal (observaciones no publicadas). Varios enfoques indirectos, se han desarrollado para deducir espesor ESL (y, por extensión, la integridad glicocáliz) que no se mueven en los lechos vasculares tales como los microcirculations cremastéricos y mesentérica. Estas técnicas incluyen la medición de las diferencias en la velocidad de circulación de micropartículas como una función de la distancia de la membrana endotelial (velocimetría de imagen de micropartículas 9), así como la medición de la exclusión de los voluminosos, marcadas con fluorescencia marcadores vasculares (por ejemplo dextranos) de la superficie endotelial (técnica de exclusión de dextrano 10, 11). De estas técnicas, sólo la exclusión de dextrano es capaz de estimar ESL espesor de las mediciones realizadas en un solo punto en el tiempo. Midiendo simultáneamente anchuras vasculares usando microscopía de campo claro (una anchura enconcluyente de la "invisible" ESL) y microscopía de fluorescencia de un trazador vascular excluidos de la ESL, espesor ESL se puede calcular como la mitad de la diferencia entre las anchuras de 2 vasculares.
El uso de una medida instantánea de espesor ESL es muy adecuado para el estudio de la glicocálix pulmonar. Microscopía intravital del pulmón es un reto, dado artefacto significativo movimiento pulmonar y cardiaca. Aunque los avances recientes permiten la inmovilización de los pulmones del ratón in vivo 12, 13, existen dudas acerca del impacto fisiológico de pulmón estasis. Inmovilidad de pulmón se asocia con disminución de óxido nítrico endotelial señalización 14, una vía de señalización que afecta tanto a la adhesión de neutrófilos 15 y lesión pulmonar 16. Además, la inmovilización de un área de pulmón expone que rodea a los alvéolos móviles perjudiciales fuerzas de cizallamiento (la denominada "atelectrauma"), de acuerdo con los conceptos clásicos fisiológicos deinterdependencia alveolar 17.
En 2008, Arata Tabuchi, Kuebler Wolfgang y sus colegas desarrollaron una técnica quirúrgica que permite la microscopía intravital de un pulmón de ratón con libertad de movimiento 18. Artefacto respiratorio resultante de esta técnica puede ser negado por el uso de imágenes de alta velocidad, incluyendo la medición simultánea de campo claro y microscopía fluorescente. En este informe, se detalle cómo imagen instantánea exclusión dextrano se puede emplear para medir el espesor de ESL en la microcirculación subpleural de un pulmón de ratón de libre movimiento, in vivo. Esta técnica se puede modificar fácilmente para determinar glicocálix función, específicamente, la capacidad de un intacta ESL para excluir circulante elementos de la superficie endotelial. Recientemente hemos usado estas técnicas para determinar la importancia de la integridad pulmonar ESL para el desarrollo de lesión pulmonar aguda durante enfermedades inflamatorias sistémicas tales como sepsis 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Coincidiendo con la expansión del uso de microscopía in vivo, hay una creciente apreciación tanto para el gran tamaño de la ESL, así como sus numerosas contribuciones a la función vascular. Estos datos emergentes, sin embargo, se derivan principalmente de estudios de la vasculatura sistémica. En efecto, el uso de microscopía in vivo en el pulmón es técnicamente difícil, dado artefacto significativo movimiento pulmonar y cardíaco.
Varios avances…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a los Dres. Arata Tabuchi y Wolfgang Kuebler (Universidad de Toronto) para la instrucción con respecto a la microscopía intravital. Damos las gracias a Andrew Cahill (Nikon Instruments) para la asistencia en el diseño e implementación de microscopía. Este trabajo fue financiado por el NIH / NHLBI subvenciones P30 HL101295 y K08 HL105538 (a EPS).
Materials
| Name of Reagent | |||
| FITC-dextran (150 kDa) | Sigma | FD150S | |
| TRITC-dextran (150 kDa) | Sigma | T1287 | |
| Streptavidin-coated fluorescent microspheres | Bangs Laboratories | CP01F/10428 | Dragon Green fluorescence (similar to FITC) |
| Ketamine | Moore Medical | ||
| Xylazine | Moore Medical | ||
| Anti-ICAM-1 biotinylated antibody | eBioscience | Clone YN1/1.7.4 | 1:50 dilution |
| Isotype biotinylated antibody | eBioscience | IgG2b eB149/10H5 | 1:50 dilution |
| EQUIPMENT | |||
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | Inspira | |
| Tracheostomy catheter | Harvard Apparatus | 730028 | |
| Electrocautery apparatus | DRE Medical | Valleylab SSE-2L | |
| Bipolar cautery forceps | Olsen Medical | 10-1200I | 9.9cm McPherson |
| Temperature control system | World Precision Instruments | ATC1000 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | Pump 11 Elite | |
| Microscope (widefield) | Nikon | LV-150 | |
| Microscope (confocal) | Nikon | A1R | |
| Image splitter | Photometrics | DV2 | |
| CCD camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 | |
| Image processing software | Nikon | NIS Elements | |
| Polyvinylidene membrane | Kure Wrap | ||
| Circular cover slip | Bellco | 5CIR-1-BEL | 5 mm, #1 thickness |
| Glue (cover slip to membrane) | Pattex | Flussig (liquid) | For affixing cover slip to membrane |
| Glue (cover slip to mouse) | Pattex | Gel | For attaching membrane to mouse |
| Surgical tubing | Intramedic | PE50, PE10 | |
| Suture | Fisher | 4:0 silk | |
| Electric razor | Oster | 78997 | |
| Curved surgical forceps | Roboz | ||
| Straight surgical forceps | Roboz | ||
| Surgical scissors | Roboz | ||
| Surgical microscissors | Roboz | ||
| Surgical needle driver | Roboz | ||
| Surgical tape | Fisher | ||
| Kitchen sponges (cut into wedges) | various |
References
- Negrini, D., Tenstad, O., Passi, A., Wiig, H. Differential degradation of matrix proteoglycans and edema development in rabbit lung. AJP – Lung Cellular and Molecular Physiology. 290, L470-L477 (2006).
- Schmidt, E. P., et al. The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis. Nat. Med. 18, 1217-1223 (2012).
- Florian, J. A., et al. Heparan sulfate proteoglycan is a mechanosensor on endothelial cells. Circ. Res. 93, e136-e142 (2003).
- Chappell, D., et al. The Glycocalyx of the Human Umbilical Vein Endothelial Cell: An Impressive Structure Ex Vivo but Not in Culture. Circulation Research. 104, 1313-1317 (2009).
- Potter, D. R., Damiano, E. R. The hydrodynamically relevant endothelial cell glycocalyx observed in vivo is absent in vitro. Circ. Res. 102, 770-776 (2008).
- Weinbaum, S., Tarbell, J. M., Damiano, E. R. The Structure and Function of the Endothelial Glycocalyx Layer. Annual Review of Biomedical Engineering. 9, 121-167 (2007).
- Pittet, M., Weissleder, R. Intravital Imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
- Kilpatrick, D. C., Graham, C., Urbaniak, S. J., Jeffree, C. E., Allen, A. K. A comparison of tomato (Lycopersicon esculentum) lectin with its deglycosylated derivative. Biochem. J. 220, 843-847 (1984).
- Smith, M. L., Long, D. S., Damiano, E. R., Ley, K. Near-wall micro-PIV reveals a hydrodynamically relevant endothelial surface layer in venules in vivo. Biophys. J. 85, 637-645 (2003).
- Vink, H., Duling, B. R. Identification of Distinct Luminal Domains for Macromolecules, Erythrocytes, and Leukocytes Within Mammalian Capillaries. Circ. Res. 79, 581-589 (1996).
- Marechal, X., et al. Endothelial glycocalyx damage during endotoxemia coincides with microcirculatory dysfunction and vascular oxidative stress. Shock. 29, 572-576 (2008).
- Presson, R. G., et al. Two-Photon Imaging within the Murine Thorax without Respiratory and Cardiac Motion Artifact. The American Journal of Pathology. 179, 75-82 (2011).
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat. Meth. 8, 91-96 (2011).
- Pearse, D. B., Wagner, E. M., Permutt, S. Effect of ventilation on vascular permeability and cyclic nucleotide concentrations in ischemic sheep lungs. J. Appl. Physiol. 86, 123-132 (1999).
- Hossain, M., Qadri, S., Liu, L. Inhibition of nitric oxide synthesis enhances leukocyte rolling and adhesion in human microvasculature. Journal of Inflammation. 9, 28 (2012).
- Schmidt, E. P., et al. Soluble guanylyl cyclase contributes to ventilator-induced lung injury in mice. AJP – Lung Cellular and Molecular Physiology. 295, L1056-L1065 (2008).
- Mead, J., Takishima, T., Leith, D. Stress distribution in lungs: a model of pulmonary elasticity. J. Appl. Physiol. 28, 596-608 (1970).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. J. Appl. Physiol. 104, 338-346 (2008).
- Gattinoni, L., Protti, A., Caironi, P., Carlesso, E. Ventilator-induced lung injury: the anatomical and physiological framework. Crit. Care Med. 38, 539-548 (2010).
- Tabuchi, A., Kim, M., Semple, J. W., Kuebler, W. M. Acute Lung Injury Causes Pendelluft Between Adjacent Alveoli In Vivo. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 183, A2490 (2011).
- Roebuck, K. A., Finnegan, A. Regulation of intercellular adhesion molecule-1 (CD54) gene expression. J. Leukoc. Biol. 66, 876-888 (1999).
