在体测量小鼠肺血管内皮表面层
Summary
内皮细胞糖萼/内皮细胞表面层是理想的使用活体显微镜研究。活体显微镜技术上具有挑战性的运动器官如肺。我们展示了如何同时明场和荧光显微镜可用于估计内皮表面层的厚度，在可自由移动<em在体内</em>小鼠肺。
Abstract
内皮糖萼层衬在血管腔的蛋白多糖和相关的葡糖胺聚糖。 在体内 ，糖复合物是高度水合，形成大量的内皮细胞表面层（ESL），有助于血管内皮功能的维护。由于内皮细胞糖复合物往往是异常失去了在标准组织内固定技术在体外和活体显微镜，研究中需要使用的ESL。为了更好地逼近复杂的生理学的肺泡微血管，是理想的可自由移动的肺进行肺活体成像。这些准备工作，但是，一般会有大量的运动伪影。我们证明如何闭胸，可以使用一个可自由移动的小鼠肺活体显微镜测量糖萼通过ESL排除从内皮细胞表面的荧光标记的高分子量葡聚糖的完整性。此非恢复的手术技术，这需要同步明场和荧光成像的小鼠肺，允许纵向观察胸膜下微血管不引起混淆肺损伤的证据。
Introduction
内皮糖萼层衬在血管内膜蛋白多糖和相关的葡糖胺聚糖是一种细胞外， 在体内，糖萼高度水合，形成大量的内皮细胞表面层（ESL），调节多种内皮细胞功能，包括透液性1，嗜中性粒细胞-内皮粘附2，和机械力的流体剪切应力3。
从历史上看，糖萼一直怀才不遇由于其在培养的细胞制剂4，5和其降解过程中的标准的组织固定和处理6的畸变。越来越多地使用活体显微镜（IVM） 在体内的显微镜，也伴随着高度的科学兴趣在健康和疾病中的血管功能的重要性，ESL。 ESL是不可见的光镜，并不能容易地标记体内的荧光腊梅糖结合凝集素的倾向，导致红细胞凝集和致死性肺动脉栓塞（未发表意见）。因此，一些间接的方法推断出ESL在非移动，如提睾和肠系膜微循环血管床的厚度（和推而广之，蛋白质复合物的完整性）。这些技术包括在循环微粒速度从内皮膜（微粒图像测速9）以及笨重，荧光标记的血管标记物（ 如葡聚糖）的排除测量从内皮表面的距离的函数的测量的差异（的葡聚糖排除技术10，11）。这些技术中，只有葡聚糖排斥是能够推定的ESL从在一个单一的时间点测量的厚度。通过同时测定血管宽度使用明视野显微镜（宽度ESL厚度CLUSIVE“看不见”的ESL）和排除从ESL血管示踪剂的荧光显微镜，可以计算为一个血管的宽度2之间的差的一半。
的瞬时测量的ESL厚度的使用是非常适合于研究的肺糖萼。活体显微镜的肺是具有挑战性的，显着的肺和心脏运动伪影。虽然最近的进步使固定的小鼠肺在体内 12 13，关注方面存在肺瘀血的生理影响。肺动与减少内皮型一氧化氮信号14信号转导通路，同时影响中性粒细胞黏附15和肺损伤16。此外，固定肺公开周围移动肺泡损害剪切力（即所谓的“atelectrauma”）的区域，按照与经典的生理概念肺泡相互依存17。
2008年，矶田渊沃尔夫冈·库伯勒和他的同事开发出一种手术技术，使活体显微镜可自由移动的小鼠肺18。呼吸的神器所产生的这种技术可以通过使用高速成像，包括明场和荧光显微镜的同时测量被否定。在这份报告中，我们详细介绍了如何瞬间右旋糖酐排除成像可以用来测量ESL厚度可自由移动， 在小鼠体内的肺胸膜下的微循环。这种技术可以很容易地修改，以确定糖萼函数具体地，一个完整的ESL排除循环从内皮细胞表面的元素的能力。最近，我们利用这些技术来决定的重要性，肺ESL完整的全身性炎症性疾病如败血症2急性肺损伤的发展。
Protocol
Representative Results
Discussion
与体内显微镜扩大使用一致，有规模庞大的ESL以及其众多的血管功能的不断升值。然而，这些新兴的数据，主要来自全身血管的研究。事实上，在肺在体内显微镜技术挑战，由于显着的肺和心脏运动伪影。
一些最近的技术进步允许稳定的肺鼠标移动，给予活体技术更好地应用到肺微循环12，13。然而，这些方法有可能混淆了肺动的生理后果。由于肺是目?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢博士。矶田渊和：沃尔夫冈·库伯勒（多伦多大学）关于活体显微镜指令。我们感谢安德鲁·卡希尔（尼康仪器）在显微镜的设计和实施的援助。这项工作是由美国国立卫生研究院/ NHLBI拨款的P30 HL101295和K08 HL105538（EPS）。
Materials
| Name of Reagent | |||
| FITC-dextran (150 kDa) | Sigma | FD150S | |
| TRITC-dextran (150 kDa) | Sigma | T1287 | |
| Streptavidin-coated fluorescent microspheres | Bangs Laboratories | CP01F/10428 | Dragon Green fluorescence (similar to FITC) |
| Ketamine | Moore Medical | ||
| Xylazine | Moore Medical | ||
| Anti-ICAM-1 biotinylated antibody | eBioscience | Clone YN1/1.7.4 | 1:50 dilution |
| Isotype biotinylated antibody | eBioscience | IgG2b eB149/10H5 | 1:50 dilution |
| EQUIPMENT | |||
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | Inspira | |
| Tracheostomy catheter | Harvard Apparatus | 730028 | |
| Electrocautery apparatus | DRE Medical | Valleylab SSE-2L | |
| Bipolar cautery forceps | Olsen Medical | 10-1200I | 9.9cm McPherson |
| Temperature control system | World Precision Instruments | ATC1000 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | Pump 11 Elite | |
| Microscope (widefield) | Nikon | LV-150 | |
| Microscope (confocal) | Nikon | A1R | |
| Image splitter | Photometrics | DV2 | |
| CCD camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 | |
| Image processing software | Nikon | NIS Elements | |
| Polyvinylidene membrane | Kure Wrap | ||
| Circular cover slip | Bellco | 5CIR-1-BEL | 5 mm, #1 thickness |
| Glue (cover slip to membrane) | Pattex | Flussig (liquid) | For affixing cover slip to membrane |
| Glue (cover slip to mouse) | Pattex | Gel | For attaching membrane to mouse |
| Surgical tubing | Intramedic | PE50, PE10 | |
| Suture | Fisher | 4:0 silk | |
| Electric razor | Oster | 78997 | |
| Curved surgical forceps | Roboz | ||
| Straight surgical forceps | Roboz | ||
| Surgical scissors | Roboz | ||
| Surgical microscissors | Roboz | ||
| Surgical needle driver | Roboz | ||
| Surgical tape | Fisher | ||
| Kitchen sponges (cut into wedges) | various |
References
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