In vivo meting van de muis Pulmonary Endothelial oppervlaktelaag
Summary
De endotheliale glycocalyx / endotheliale oppervlaktelaag is ideaal bestudeerd met behulp van intravitale microscopie. Intravitale microscopie is technisch uitdagend in een bewegend orgaan zoals de longen. We zien hoe gelijktijdige helderveld en fluorescentiemicroscopie kan worden gebruikt om endotheeloppervlak laagdikte schatten in een vrij bewegende<em> In vivo</em> Muis long.
Abstract
De endotheliale glycocalyx is een laag van proteoglycanen en glycosaminoglycanen verbonden langs de vasculaire lumen. In vivo, de glycocalyx is sterk gehydrateerde, die een belangrijke endotheliale oppervlaktelaag (ESL) die bijdraagt aan het behoud van de endotheelfunctie. Aangezien de endotheliale glycocalyx is vaak afwijkend in vitro en gaat verloren tijdens normale weefsel fixatie technieken, studie van de ESL vereist het gebruik van intravitale microscopie. Om zo goed mogelijk benadert de complexe fysiologie van de alveolaire microvasculatuur, wordt pulmonale intravitale beeldvorming idealiter uitgevoerd op een vrij bewegende long. Deze preparaten echter gewoonlijk lijden uitgebreide bewegingsartefacten. We zien hoe closed-chest intravitale microscopie van een vrij bewegende muizenlong kan worden gebruikt om glycocalyx integriteit meten via ESL uitsluiting van fluorescentie-gemerkt hoog molecuulgewicht dextranen van het endotheeloppervlak. Dit terminaal chirurgische techniek, die vereistgelijktijdige helderveld en fluorescerende beeldvorming van de muis long, zorgt voor een longitudinale observatie van de subpleural microvasculatuur zonder aanwijzingen voor het induceren van confounding longschade.
Introduction
De endotheliale glycocalyx is een extracellulair laag van proteoglycanen en glycosaminoglycanen verbonden langs de vasculaire intima. In vivo, de glycocalyx is sterk gehydrateerde, die een belangrijke endotheliale oppervlaktelaag (ESL) die een verscheidenheid van functies zoals endotheliale vloeistof permeabiliteit 1, neutrofiel-endotheliale regelt adhesie 2 en de mechanotransductie vloeistof schuifspanning 3.
Historisch gezien is de glycocalyx is ondergewaardeerde vanwege zijn aberrance in gekweekte celpreparaten 4, 5 en de afbraak tijdens normale weefsel fixatie en verwerking 6. Het toenemende gebruik 7 van intravitale microscopie (in vivo microscopie, IVM) heeft samen met verhoogde wetenschappelijke belangstelling voor het belang van de ESL tot vaatfunctie bij gezondheid en ziekte. De ESL is onzichtbaar voor lichtmicroscopie en kunnen niet gemakkelijk worden geëtiketteerdvivo, gezien de neiging van fluorescerende glycocalyx-bindende lectinen te RBC agglutinatie 8 en fatale longembolie (niet gepubliceerde observaties) veroorzaken. Verschillende indirecte benaderingen zijn daarom ontwikkeld om ESL dikte (en, bij uitbreiding, glycocalyx integriteit) af te leiden in niet-bewegende vaatbedden zoals de cremasteric en mesenteriale microcirculations. Deze technieken omvatten het meten van verschillen in circulerende microdeeltje snelheid als functie van de afstand tot de endotheliale membraan (micropartikel image velocimetry 9) en het meten van de uitsluiting van volumineuze, fluorescentie-gemerkt vasculaire markers (bijv. dextranen) van het endotheeloppervlak (dextran uitsluiting techniek 10, 11). Van deze technieken alleen dextran uitsluiting kan schatten ESL dikte van metingen op een bepaald tijdstip. Door het gelijktijdig meten van vasculaire breedtes met helderveld microscopie (een breedte inclusive de "onzichtbare" ESL) en fluorescentiemicroscopie van een vasculair tracer buiten de ESL kan ESL dikte worden berekend als de helft van het verschil tussen vasculaire breedtes 2.
Het gebruik van een momentane meting van ESL dikte geschikt voor studie van de pulmonale glycocalyx. Intravitale microscopie van de long is een uitdaging, een grote mate van pulmonale en cardiale bewegingsartefact. Hoewel recente vorderingen maken voor immobilisatie van muizenlongen in vivo 12, 13 bestaan zorgen over de fysiologische gevolgen van long stasis. Lung immobiliteit wordt in verband gebracht met een verminderde endotheel NO signalering 14, een signaalweg die zowel neutrofiele adhesie 15 en longschade 16 beïnvloedt. Bovendien immobilisatie van een gebied van long bloot rond mobiele alveolen schadelijke afschuifkrachten (zogenaamde "atelectrauma"), in overeenstemming met de klassieke fysiologische begrippenalveolaire onderlinge afhankelijkheid 17.
In 2008, Arata Tabuchi, Wolfgang Kuebler en collega's ontwikkelden een chirurgische techniek waardoor intravitale microscopie van een vrij bewegende muizenlong 18. Respiratoire artefact als gevolg van deze techniek kan worden teniet gedaan door gebruik van snelle beeldvorming, met inbegrip gelijktijdige meting van helderveld en fluorescentiemicroscopie. In dit verslag wordt beschreven hoe momentane dextran uitsluiting imaging kunnen worden gebruikt om VSV dikte te meten in de subpleural microcirculatie van een vrij bewegende, in vivo muizenlong. Deze techniek kan eenvoudig worden aangepast om glycocalyx bepalen functie-specifiek, het vermogen van een intact ESL uitsluiten circulerende elementen van het endotheeloppervlak. We hebben onlangs deze technieken het belang van pulmonale ESL integriteit van de ontwikkeling van acute longbeschadiging te bepalen tijdens systemische ontstekingsziekten zoals sepsis 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Samenvallend met het toenemende gebruik van in vivo microscopie, is er toenemende waardering voor zowel de aanzienlijke omvang van de ESL evenals de talrijke bijdragen tot vasculaire functie. Deze nieuwe gegevens, echter, zijn hoofdzakelijk afkomstig uit studies van de systemische vaatstelsel. Inderdaad, het gebruik van in vivo microscopie in de long technische uitdagingen, aangezien significante pulmonale en cardiale bewegingsartefacten.
Verschillende recente technische on…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Drs. Arata Tabuchi en Wolfgang Kuebler (Universiteit van Toronto) voor instructies over intravitale microscopie. Wij danken Andrew Cahill (Nikon Instruments) voor hulp bij het microscopie ontwerp en uitvoering. Dit werk werd gefinancierd door NIH / NHLBI subsidies P30 HL101295 en K08 HL105538 (naar EPS).
Materials
| Name of Reagent | |||
| FITC-dextran (150 kDa) | Sigma | FD150S | |
| TRITC-dextran (150 kDa) | Sigma | T1287 | |
| Streptavidin-coated fluorescent microspheres | Bangs Laboratories | CP01F/10428 | Dragon Green fluorescence (similar to FITC) |
| Ketamine | Moore Medical | ||
| Xylazine | Moore Medical | ||
| Anti-ICAM-1 biotinylated antibody | eBioscience | Clone YN1/1.7.4 | 1:50 dilution |
| Isotype biotinylated antibody | eBioscience | IgG2b eB149/10H5 | 1:50 dilution |
| EQUIPMENT | |||
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | Inspira | |
| Tracheostomy catheter | Harvard Apparatus | 730028 | |
| Electrocautery apparatus | DRE Medical | Valleylab SSE-2L | |
| Bipolar cautery forceps | Olsen Medical | 10-1200I | 9.9cm McPherson |
| Temperature control system | World Precision Instruments | ATC1000 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | Pump 11 Elite | |
| Microscope (widefield) | Nikon | LV-150 | |
| Microscope (confocal) | Nikon | A1R | |
| Image splitter | Photometrics | DV2 | |
| CCD camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 | |
| Image processing software | Nikon | NIS Elements | |
| Polyvinylidene membrane | Kure Wrap | ||
| Circular cover slip | Bellco | 5CIR-1-BEL | 5 mm, #1 thickness |
| Glue (cover slip to membrane) | Pattex | Flussig (liquid) | For affixing cover slip to membrane |
| Glue (cover slip to mouse) | Pattex | Gel | For attaching membrane to mouse |
| Surgical tubing | Intramedic | PE50, PE10 | |
| Suture | Fisher | 4:0 silk | |
| Electric razor | Oster | 78997 | |
| Curved surgical forceps | Roboz | ||
| Straight surgical forceps | Roboz | ||
| Surgical scissors | Roboz | ||
| Surgical microscissors | Roboz | ||
| Surgical needle driver | Roboz | ||
| Surgical tape | Fisher | ||
| Kitchen sponges (cut into wedges) | various |
References
- Negrini, D., Tenstad, O., Passi, A., Wiig, H. Differential degradation of matrix proteoglycans and edema development in rabbit lung. AJP – Lung Cellular and Molecular Physiology. 290, L470-L477 (2006).
- Schmidt, E. P., et al. The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis. Nat. Med. 18, 1217-1223 (2012).
- Florian, J. A., et al. Heparan sulfate proteoglycan is a mechanosensor on endothelial cells. Circ. Res. 93, e136-e142 (2003).
- Chappell, D., et al. The Glycocalyx of the Human Umbilical Vein Endothelial Cell: An Impressive Structure Ex Vivo but Not in Culture. Circulation Research. 104, 1313-1317 (2009).
- Potter, D. R., Damiano, E. R. The hydrodynamically relevant endothelial cell glycocalyx observed in vivo is absent in vitro. Circ. Res. 102, 770-776 (2008).
- Weinbaum, S., Tarbell, J. M., Damiano, E. R. The Structure and Function of the Endothelial Glycocalyx Layer. Annual Review of Biomedical Engineering. 9, 121-167 (2007).
- Pittet, M., Weissleder, R. Intravital Imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
- Kilpatrick, D. C., Graham, C., Urbaniak, S. J., Jeffree, C. E., Allen, A. K. A comparison of tomato (Lycopersicon esculentum) lectin with its deglycosylated derivative. Biochem. J. 220, 843-847 (1984).
- Smith, M. L., Long, D. S., Damiano, E. R., Ley, K. Near-wall micro-PIV reveals a hydrodynamically relevant endothelial surface layer in venules in vivo. Biophys. J. 85, 637-645 (2003).
- Vink, H., Duling, B. R. Identification of Distinct Luminal Domains for Macromolecules, Erythrocytes, and Leukocytes Within Mammalian Capillaries. Circ. Res. 79, 581-589 (1996).
- Marechal, X., et al. Endothelial glycocalyx damage during endotoxemia coincides with microcirculatory dysfunction and vascular oxidative stress. Shock. 29, 572-576 (2008).
- Presson, R. G., et al. Two-Photon Imaging within the Murine Thorax without Respiratory and Cardiac Motion Artifact. The American Journal of Pathology. 179, 75-82 (2011).
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat. Meth. 8, 91-96 (2011).
- Pearse, D. B., Wagner, E. M., Permutt, S. Effect of ventilation on vascular permeability and cyclic nucleotide concentrations in ischemic sheep lungs. J. Appl. Physiol. 86, 123-132 (1999).
- Hossain, M., Qadri, S., Liu, L. Inhibition of nitric oxide synthesis enhances leukocyte rolling and adhesion in human microvasculature. Journal of Inflammation. 9, 28 (2012).
- Schmidt, E. P., et al. Soluble guanylyl cyclase contributes to ventilator-induced lung injury in mice. AJP – Lung Cellular and Molecular Physiology. 295, L1056-L1065 (2008).
- Mead, J., Takishima, T., Leith, D. Stress distribution in lungs: a model of pulmonary elasticity. J. Appl. Physiol. 28, 596-608 (1970).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. J. Appl. Physiol. 104, 338-346 (2008).
- Gattinoni, L., Protti, A., Caironi, P., Carlesso, E. Ventilator-induced lung injury: the anatomical and physiological framework. Crit. Care Med. 38, 539-548 (2010).
- Tabuchi, A., Kim, M., Semple, J. W., Kuebler, W. M. Acute Lung Injury Causes Pendelluft Between Adjacent Alveoli In Vivo. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 183, A2490 (2011).
- Roebuck, K. A., Finnegan, A. Regulation of intercellular adhesion molecule-1 (CD54) gene expression. J. Leukoc. Biol. 66, 876-888 (1999).
