במדידת vivo של שכבת פני שטח האנדותל ריאתי המאוסה
Summary
שכבת פני שטח glycocalyx / אנדותל האנדותל היא למד באופן אידיאלי באמצעות מיקרוסקופ intravital. מיקרוסקופיה Intravital טכני מאתגרת באיבר מרגש כגון ריאות. אנחנו מדגימים איך brightfield סימולטני ומיקרוסקופיה ניאון ניתן להשתמש כדי להעריך את עובי שכבת פני שטח האנדותל שבנע בחופשיות,<em> In vivo</em> ריאות עכבר.
Abstract
Glycocalyx אנדותל הוא שכבה של proteoglycans וglycosaminoglycans הנלווה המצפה את חלל כלי הדם. בחי, glycocalyx הוא hydrated מאוד, ויצר שכבת האנדותל משמעותית משטח (ESL) שתורמת לשמירה על תפקוד האנדותל. כglycocalyx האנדותל הוא לעתים קרובות סוטה במבחנה והוא אבד במהלך טכניקות קיבוע רקמות הרגילות, מחקר של ESL דורש שימוש במיקרוסקופ intravital. כדי להתקרב לפיסיולוגיה המורכבת ביותר של microvasculature מכתשיים, הדמית intravital ריאה מבוצעת באופן אידיאלי על ריאות באופן חופשי אל לב. הכנות אלה, עם זאת, בדרך כלל סובלות מחפץ תנועה נרחבת. אנחנו מדגימים איך מיקרוסקופיה intravital סגור חזה של ריאת עכבר שנע בחופשיות, יכולה לשמש למדידת תקינות glycocalyx באמצעות הדרה של ESL dextrans משקל המולקולרי שכותרת-fluorescently הגבוה ממשטח אנדותל. טכניקה זו אינה התאוששות אחרי ניתוח, שדורשתbrightfield בו זמנית והדמית ניאון של ריאת העכבר, מאפשרים תצפית אורך של microvasculature subpleural ללא עדות לגרימת פציעת ריאות בלבול.
Introduction
Glycocalyx אנדותל הוא שכבה תאית של proteoglycans וglycosaminoglycans הנלווה המצפה את כלי דם אינטימה. בחי, glycocalyx הוא hydrated מאוד, ויצר שכבת האנדותל משמעותית משטח (ESL), המסדירה מגוון רחב של פונקציות אנדותל כולל חדירות נוזלי 1, נויטרופילים אנדותל- הידבקות 2, וmechanotransduction של 3 מאמץ גזירת נוזל.
מבחינה הסטורית, glycocalyx היה מוערך בשל aberrance בהכנות בתרבית תאים 4, 5 והשפלתה במהלך קיבוע רקמה הסטנדרטי ועיבוד 6. השימוש הגובר 7 של מיקרוסקופיה intravital (במיקרוסקופ vivo, IVM) שעלה בקנה אחד עם עניין מדעי מוגבר בחשיבות של ESL לתפקוד כלי דם במהלך מחלה ובריאות. ESL הוא בלתי נראה למיקרוסקופ אור ולא יכול להיות מתויג בקלותvivo, בהתחשב בנטייה של קטיני ניאון glycocalyx מחייבים לגרום להתלכדות RBC 8 ותסחיפי ריאות קטלניים (תצפיות שלא פורסמו). גישות עקיפות אחדות לכן פותחו להסיק עובי ESL (ובהרחבה, יושרת glycocalyx) במיטות שאינן נעות וסקולריים כגון microcirculations cremasteric וmesenteric. טכניקות אלו כוללות מדידה של הבדלים במהירות במחזור microparticle כפונקציה של מרחק מקרום אנדותל (velocimetry תמונת microparticle 9) כמו גם המדידה של ההדרה של סמנים מגושמים, fluorescently כותרת וכלי דם (למשל dextrans) ממשטח אנדותל (טכניקת dextran הדרת 10, 11). טכניקות אלו, רק הדרת dextran מסוגלת לאמוד עובי ESL ממדידות שנעשו בנקודה אחת בזמן. על ידי מדידת רוחב כלי דם בו זמנית באמצעות מיקרוסקופיה brightfield (רוחב בclusive של ESL "בלתי נראה"), ומיקרוסקופיה ניאון של נותב כלי דם הוצא מESL, עובי ESL ניתן לחשב כמחצית ההפרש בין רוחב כלי דם 2.
השימוש באמצעי מיידי של עובי ESL הוא מותאם היטב ללימוד glycocalyx ריאתי. מיקרוסקופיה Intravital של הריאות היא מאתגרת, בהתחשב בחפץ לב וריאות תנועה משמעותי. למרות התקדמות שחל באחרונה לאפשר לקיבוע של ריאות עכבר ב12 vivo, 13, חששות קיימים לגבי ההשפעה הפיזיולוגית של ריאות קיפאון. חוסר תנועת ריאות קשור בתחמוצת חנקן האנדותל ירד איתות 14, מסלול איתות המשפיע גם הידבקות נויטרופילים 15 ופציעה 16 ריאות. יתר על כן, קיבוע של אזור של ריאה חושפת מקיף alveoli הנייד לכוחות גזירה שפגיעתו (מה שנקרא "atelectrauma"), בהתאם למושגים הפיסיולוגיים הקלסיים שלתלות הדדית מכתשיים 17.
בשנת 2008, אראטה Tabuchi, וולפגנג Kuebler ועמיתיו פתחו טכניקת ניתוח המאפשרת למיקרוסקופיה intravital של ריאת עכבר שנע בחופשיות-18. חפץ נשימה הנובע מטכניקה זו ניתן לשלול על ידי שימוש בהדמיה במהירות גבוהה, כולל מדידה סימולטנית של brightfield ומיקרוסקופ פלואורסצנטי. בדו"ח זה, אנו פירוט כיצד הדמית הדרת dextran מיידית יכולה להיות מועסקת על מנת למדוד את עובי ESL בזרימת דם subpleural של שנע בחופשיות-, in vivo ריאות עכבר. טכניקה זו ניתן לשנות בקלות כדי לקבוע glycocalyx פונקציה ספציפית, יכולתו של שלם ESL שלא לכלול במחזור אלמנטים ממשטח אנדותל. אנחנו השתמשנו בטכניקות אלה לאחרונה כדי לקבוע את החשיבות של יושרת ESL ריאתי להתפתחות פציעת ריאות חריפה במחלות דלקתיות מערכתיות כגון אלח דם 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
ביחד עם התרחבות השימוש במיקרוסקופ בvivo, יש הערכה גוברת הוא לגודל משמעותי של ESL, כמו גם התרומות הרבות שלו לתפקוד כלי דם. נתונים אלה המתעוררים, לעומת זאת, נובעים בעיקר ממחקרים של מערכת כלי הדם המערכתית. ואכן, שימוש במיקרוסקופ בvivo הריאות מאתגר מבחינה טכנית, ניתן ח…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לבני זוג. אראטה Tabuchi וולפגנג Kuebler (אוניברסיטת טורונטו) להוראה בדבר מיקרוסקופיה intravital. אנו מודים לאנדרו קייהיל (ניקון מכשירים) לסיוע בתכנון ויישום מיקרוסקופים. עבודה זו מומנה על ידי NIH / NHLBI מענקים P30 HL101295 וK08 HL105538 (למניה).
Materials
| Name of Reagent | |||
| FITC-dextran (150 kDa) | Sigma | FD150S | |
| TRITC-dextran (150 kDa) | Sigma | T1287 | |
| Streptavidin-coated fluorescent microspheres | Bangs Laboratories | CP01F/10428 | Dragon Green fluorescence (similar to FITC) |
| Ketamine | Moore Medical | ||
| Xylazine | Moore Medical | ||
| Anti-ICAM-1 biotinylated antibody | eBioscience | Clone YN1/1.7.4 | 1:50 dilution |
| Isotype biotinylated antibody | eBioscience | IgG2b eB149/10H5 | 1:50 dilution |
| EQUIPMENT | |||
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | Inspira | |
| Tracheostomy catheter | Harvard Apparatus | 730028 | |
| Electrocautery apparatus | DRE Medical | Valleylab SSE-2L | |
| Bipolar cautery forceps | Olsen Medical | 10-1200I | 9.9cm McPherson |
| Temperature control system | World Precision Instruments | ATC1000 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | Pump 11 Elite | |
| Microscope (widefield) | Nikon | LV-150 | |
| Microscope (confocal) | Nikon | A1R | |
| Image splitter | Photometrics | DV2 | |
| CCD camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 | |
| Image processing software | Nikon | NIS Elements | |
| Polyvinylidene membrane | Kure Wrap | ||
| Circular cover slip | Bellco | 5CIR-1-BEL | 5 mm, #1 thickness |
| Glue (cover slip to membrane) | Pattex | Flussig (liquid) | For affixing cover slip to membrane |
| Glue (cover slip to mouse) | Pattex | Gel | For attaching membrane to mouse |
| Surgical tubing | Intramedic | PE50, PE10 | |
| Suture | Fisher | 4:0 silk | |
| Electric razor | Oster | 78997 | |
| Curved surgical forceps | Roboz | ||
| Straight surgical forceps | Roboz | ||
| Surgical scissors | Roboz | ||
| Surgical microscissors | Roboz | ||
| Surgical needle driver | Roboz | ||
| Surgical tape | Fisher | ||
| Kitchen sponges (cut into wedges) | various |
References
- Negrini, D., Tenstad, O., Passi, A., Wiig, H. Differential degradation of matrix proteoglycans and edema development in rabbit lung. AJP – Lung Cellular and Molecular Physiology. 290, L470-L477 (2006).
- Schmidt, E. P., et al. The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis. Nat. Med. 18, 1217-1223 (2012).
- Florian, J. A., et al. Heparan sulfate proteoglycan is a mechanosensor on endothelial cells. Circ. Res. 93, e136-e142 (2003).
- Chappell, D., et al. The Glycocalyx of the Human Umbilical Vein Endothelial Cell: An Impressive Structure Ex Vivo but Not in Culture. Circulation Research. 104, 1313-1317 (2009).
- Potter, D. R., Damiano, E. R. The hydrodynamically relevant endothelial cell glycocalyx observed in vivo is absent in vitro. Circ. Res. 102, 770-776 (2008).
- Weinbaum, S., Tarbell, J. M., Damiano, E. R. The Structure and Function of the Endothelial Glycocalyx Layer. Annual Review of Biomedical Engineering. 9, 121-167 (2007).
- Pittet, M., Weissleder, R. Intravital Imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
- Kilpatrick, D. C., Graham, C., Urbaniak, S. J., Jeffree, C. E., Allen, A. K. A comparison of tomato (Lycopersicon esculentum) lectin with its deglycosylated derivative. Biochem. J. 220, 843-847 (1984).
- Smith, M. L., Long, D. S., Damiano, E. R., Ley, K. Near-wall micro-PIV reveals a hydrodynamically relevant endothelial surface layer in venules in vivo. Biophys. J. 85, 637-645 (2003).
- Vink, H., Duling, B. R. Identification of Distinct Luminal Domains for Macromolecules, Erythrocytes, and Leukocytes Within Mammalian Capillaries. Circ. Res. 79, 581-589 (1996).
- Marechal, X., et al. Endothelial glycocalyx damage during endotoxemia coincides with microcirculatory dysfunction and vascular oxidative stress. Shock. 29, 572-576 (2008).
- Presson, R. G., et al. Two-Photon Imaging within the Murine Thorax without Respiratory and Cardiac Motion Artifact. The American Journal of Pathology. 179, 75-82 (2011).
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat. Meth. 8, 91-96 (2011).
- Pearse, D. B., Wagner, E. M., Permutt, S. Effect of ventilation on vascular permeability and cyclic nucleotide concentrations in ischemic sheep lungs. J. Appl. Physiol. 86, 123-132 (1999).
- Hossain, M., Qadri, S., Liu, L. Inhibition of nitric oxide synthesis enhances leukocyte rolling and adhesion in human microvasculature. Journal of Inflammation. 9, 28 (2012).
- Schmidt, E. P., et al. Soluble guanylyl cyclase contributes to ventilator-induced lung injury in mice. AJP – Lung Cellular and Molecular Physiology. 295, L1056-L1065 (2008).
- Mead, J., Takishima, T., Leith, D. Stress distribution in lungs: a model of pulmonary elasticity. J. Appl. Physiol. 28, 596-608 (1970).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. J. Appl. Physiol. 104, 338-346 (2008).
- Gattinoni, L., Protti, A., Caironi, P., Carlesso, E. Ventilator-induced lung injury: the anatomical and physiological framework. Crit. Care Med. 38, 539-548 (2010).
- Tabuchi, A., Kim, M., Semple, J. W., Kuebler, W. M. Acute Lung Injury Causes Pendelluft Between Adjacent Alveoli In Vivo. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 183, A2490 (2011).
- Roebuck, K. A., Finnegan, A. Regulation of intercellular adhesion molecule-1 (CD54) gene expression. J. Leukoc. Biol. 66, 876-888 (1999).
