Fare Pulmoner Endotelyal Yüzey Katman in vivo ölçümü olarak
Summary
Endotelyal endotel / glycocalyx yüzey tabakası ideal intravital mikroskobu kullanılarak incelenmiştir. Intravital mikroskop teknik gibi akciğer gibi hareketli bir organ zordur. Biz eş zamanlı aydınlık ve floresan mikroskop serbestçe-hareket eden endotel yüzey tabakasının kalınlığını belirlemede nasıl kullanılabileceğini göstermek<em> In vivo</em> Fare akciğer.
Abstract
Endotel glycocalyx vasküler lümeni döşeyen proteoglikanlar ve ilişkili glikozaminoglikanlar bir tabakadır. İn vivo olarak, glycocalyx endotel fonksiyonun korunmasında katkıda önemli bir endotel yüzey tabakası (ESL) oluşturan, son derece sulu olduğunu. Endotel glycocalyx genellikle in vitro olarak anormal bir doku ve standart tekniklerle tespit sırasında kaybolur gibi, ESL çalışma intravital mikroskopi kullanımını gerektirir. Alveoler mikrovasküler iyi yaklaşık karmaşık fizyolojisi için, pulmoner intravital görüntüleme ideal bir serbestçe hareket eden akciğer gerçekleştirilir. Bu preparatlar, bununla birlikte, genelde geniş hareket artefaktı muzdarip. Bir serbestçe hareket eden bir fare akciğer bölgesinin, kapalı göğüs intravital mikroskopisi endotel yüzey floresan-etiketli yüksek molekül ağırlıklı dekstranlar ve ESL dışlama yoluyla glycocalyx bütünlük ölçmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Gerektirir Bu non-kurtarma cerrahi teknik,eşzamanlı aydınlık ve fare akciğer floresan görüntüleme, karıştırıcı akciğer hasarı inducing delil olmadan subplevral mikrovasküler uzunlamasına gözlem için izin verir.
Introduction
Endotel glycocalyx damar intima astar proteoglikanlar ve ilişkili glikozaminoglikanların bir hücre dışı bir tabakadır. İn vivo olarak, glycocalyx nötrofil endotel sıvı geçirgenliği, 1 de dahil olmak üzere endotel çeşitli fonksiyonları düzenler önemli bir endotel yüzey tabaka (ESL) şekillendirme, yüksek hidratlanır yapışma 2, ve sıvı makaslama kuvveti 3 mechanotransduction.
Tarihsel olarak, glycocalyx dolayı standart doku fiksasyonu ve işleme 6 sırasında kültürlü Hücre preparatlarının 4, 5 ve degradasyon yılında aberrance için underappreciated olmuştur. Artan kullanımı intravital mikroskopi 7 (in vivo mikroskopi, IVM) sağlık ve hastalık sırasında damar işlev ESL önemi artan bilimsel ilgi ile çakıştı. ESL ışık mikroskobu ile görülemez ve kolayca etiketli edilemezRBC aglütinasyon 8 ve fatal pulmoner emboli (yayınlanmamış gözlemler) neden floresan glycocalyx-bağlayıcı lektin eğilimini verilen vivo,. Birçok dolaylı yaklaşımlar dolayısıyla böyle kremaster ve mezenterik mikrodolaşımını olmayan hareketli vasküler yataklarda ESL kalınlığı (ve, uzatma, glycocalyx bütünlüğü) anlamak için geliştirilmiştir. Bu teknikler, endotel yüzeyinden endotel zar (Mikropartikül görüntü velosimetri 9) yanı sıra, hantal, floresan-etiketli damar işaretleyicileri (örneğin dekstranlar) kapsamından ölçüm mesafe bir fonksiyonu olarak hız mikropartikül dolaşan farklılıklar ölçümü, (dekstran dışlama tekniği 10, 11). Bu teknikler, sadece dekstran dışlanma zaman içinde tek bir noktada yapılan ölçümlerden ESL kalınlığı tahmin yeteneğine sahiptir. Eşzamanlı olarak aydınlık mikroskobu (genişliği kullanılarak vasküler genişlikleri ölçerek"görünmez" ESL) ve ESL dışlanmış bir vasküler tracer floresan mikroskop clusive, ESL kalınlığı vasküler genişlikleri 2 arasındaki bir buçuk fark olarak hesaplanabilir.
ESL kalınlığı ani bir ölçü kullanılması pulmoner glycocalyx çalışmaları için çok uygundur. Akciğer intravital mikroskopi belirgin pulmoner ve kardiyak hareket artefaktı verilen zordur. Son gelişmeler vivo 12, 13 fare akciğer immobilizasyonu için izin iken, endişeleri akciğer staz fizyolojik etkileri ile ilgili hangi. Akciğer hareketsizlik 14 sinyalizasyon azalmış endotelyal nitrik oksit, nötrofil adezyonu 15 ve akciğer hasarı 16 hem de etkilediğini bir sinyal yolağı ile ilişkilidir. Dahası, klasik fizyolojik kavramlar doğrultusunda akciğer zararlı kesme kuvvetleri ("atelectrauma" denilen) mobil alveoller çevreleyen ortaya bir alanı immobilizasyonu,alveoler bağımlılık 17.
2008 yılında, Arata Tabuchi, Wolfgang Kuebler ve arkadaşları serbestçe hareket eden fare akciğer 18 intravital mikroskopi için izin veren bir cerrahi tekniği geliştirdi. Bu teknik kaynaklanan Solunum dışlayıcı aydınlık ve floresan mikroskobu ile eş zamanlı ölçüm da dahil olmak üzere yüksek hızlı görüntülemede kullanımı tarafından etkisiz olabilir. Anlık dekstran dışlama görüntüleme in vivo, serbestçe hareket fare akciğer subplevral mikrosirkülasyon ESL kalınlığını ölçmek için istihdam edilebilir Bu yazıda ayrıntılı. Bu teknik, kolayca, fonksiyon özellikle glycocalyx belirlemek için endotel yüzeyinden dolaşan elemanları dışarıda bırakmak ESL bir bozulmamış bir yeteneklerini değiştirilebilir. Biz son zamanlarda, sepsis 2 gibi sistemik inflamatuar hastalıklar sırasında akut akciğer hasarı gelişmesine pulmoner ESL bütünlüğünün önemini belirlemek için bu teknikler kullandık.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vivo mikroskopi arasında genişleyen kullanımı ile çakışık, ESL önemli boyutu yanı sıra vasküler fonksiyonu olan sayısız katkıları hem artan takdir vardır. Bu ortaya çıkan veriler, ancak, esas olarak sistemik vasküler çalışmalarından elde edilir. Nitekim, akciğerde vivo mikroskobu kullanımı teknik olarak verilen belirgin pulmoner ve kardiyak hareket artefaktı, meydan okuyor.
Çeşitli yeni teknik gelişmeler akciğer mikro 12, 13 intrav…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Dr teşekkür ederim. Arata Tabuchi ve intravital mikroskopi ile ilgili talimat Wolfgang Kuebler (Toronto Üniversitesi). Biz mikroskobu tasarımı ve uygulanmasında yardım için Andrew Cahill (Nikon Instruments) teşekkür ederim. Bu çalışma NIH / NHLBI hibe P30 HL101295 ve K08 HL105538 (EPS) tarafından finanse edildi.
Materials
| Name of Reagent | |||
| FITC-dextran (150 kDa) | Sigma | FD150S | |
| TRITC-dextran (150 kDa) | Sigma | T1287 | |
| Streptavidin-coated fluorescent microspheres | Bangs Laboratories | CP01F/10428 | Dragon Green fluorescence (similar to FITC) |
| Ketamine | Moore Medical | ||
| Xylazine | Moore Medical | ||
| Anti-ICAM-1 biotinylated antibody | eBioscience | Clone YN1/1.7.4 | 1:50 dilution |
| Isotype biotinylated antibody | eBioscience | IgG2b eB149/10H5 | 1:50 dilution |
| EQUIPMENT | |||
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | Inspira | |
| Tracheostomy catheter | Harvard Apparatus | 730028 | |
| Electrocautery apparatus | DRE Medical | Valleylab SSE-2L | |
| Bipolar cautery forceps | Olsen Medical | 10-1200I | 9.9cm McPherson |
| Temperature control system | World Precision Instruments | ATC1000 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | Pump 11 Elite | |
| Microscope (widefield) | Nikon | LV-150 | |
| Microscope (confocal) | Nikon | A1R | |
| Image splitter | Photometrics | DV2 | |
| CCD camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 | |
| Image processing software | Nikon | NIS Elements | |
| Polyvinylidene membrane | Kure Wrap | ||
| Circular cover slip | Bellco | 5CIR-1-BEL | 5 mm, #1 thickness |
| Glue (cover slip to membrane) | Pattex | Flussig (liquid) | For affixing cover slip to membrane |
| Glue (cover slip to mouse) | Pattex | Gel | For attaching membrane to mouse |
| Surgical tubing | Intramedic | PE50, PE10 | |
| Suture | Fisher | 4:0 silk | |
| Electric razor | Oster | 78997 | |
| Curved surgical forceps | Roboz | ||
| Straight surgical forceps | Roboz | ||
| Surgical scissors | Roboz | ||
| Surgical microscissors | Roboz | ||
| Surgical needle driver | Roboz | ||
| Surgical tape | Fisher | ||
| Kitchen sponges (cut into wedges) | various |
References
- Negrini, D., Tenstad, O., Passi, A., Wiig, H. Differential degradation of matrix proteoglycans and edema development in rabbit lung. AJP – Lung Cellular and Molecular Physiology. 290, L470-L477 (2006).
- Schmidt, E. P., et al. The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis. Nat. Med. 18, 1217-1223 (2012).
- Florian, J. A., et al. Heparan sulfate proteoglycan is a mechanosensor on endothelial cells. Circ. Res. 93, e136-e142 (2003).
- Chappell, D., et al. The Glycocalyx of the Human Umbilical Vein Endothelial Cell: An Impressive Structure Ex Vivo but Not in Culture. Circulation Research. 104, 1313-1317 (2009).
- Potter, D. R., Damiano, E. R. The hydrodynamically relevant endothelial cell glycocalyx observed in vivo is absent in vitro. Circ. Res. 102, 770-776 (2008).
- Weinbaum, S., Tarbell, J. M., Damiano, E. R. The Structure and Function of the Endothelial Glycocalyx Layer. Annual Review of Biomedical Engineering. 9, 121-167 (2007).
- Pittet, M., Weissleder, R. Intravital Imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
- Kilpatrick, D. C., Graham, C., Urbaniak, S. J., Jeffree, C. E., Allen, A. K. A comparison of tomato (Lycopersicon esculentum) lectin with its deglycosylated derivative. Biochem. J. 220, 843-847 (1984).
- Smith, M. L., Long, D. S., Damiano, E. R., Ley, K. Near-wall micro-PIV reveals a hydrodynamically relevant endothelial surface layer in venules in vivo. Biophys. J. 85, 637-645 (2003).
- Vink, H., Duling, B. R. Identification of Distinct Luminal Domains for Macromolecules, Erythrocytes, and Leukocytes Within Mammalian Capillaries. Circ. Res. 79, 581-589 (1996).
- Marechal, X., et al. Endothelial glycocalyx damage during endotoxemia coincides with microcirculatory dysfunction and vascular oxidative stress. Shock. 29, 572-576 (2008).
- Presson, R. G., et al. Two-Photon Imaging within the Murine Thorax without Respiratory and Cardiac Motion Artifact. The American Journal of Pathology. 179, 75-82 (2011).
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat. Meth. 8, 91-96 (2011).
- Pearse, D. B., Wagner, E. M., Permutt, S. Effect of ventilation on vascular permeability and cyclic nucleotide concentrations in ischemic sheep lungs. J. Appl. Physiol. 86, 123-132 (1999).
- Hossain, M., Qadri, S., Liu, L. Inhibition of nitric oxide synthesis enhances leukocyte rolling and adhesion in human microvasculature. Journal of Inflammation. 9, 28 (2012).
- Schmidt, E. P., et al. Soluble guanylyl cyclase contributes to ventilator-induced lung injury in mice. AJP – Lung Cellular and Molecular Physiology. 295, L1056-L1065 (2008).
- Mead, J., Takishima, T., Leith, D. Stress distribution in lungs: a model of pulmonary elasticity. J. Appl. Physiol. 28, 596-608 (1970).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. J. Appl. Physiol. 104, 338-346 (2008).
- Gattinoni, L., Protti, A., Caironi, P., Carlesso, E. Ventilator-induced lung injury: the anatomical and physiological framework. Crit. Care Med. 38, 539-548 (2010).
- Tabuchi, A., Kim, M., Semple, J. W., Kuebler, W. M. Acute Lung Injury Causes Pendelluft Between Adjacent Alveoli In Vivo. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 183, A2490 (2011).
- Roebuck, K. A., Finnegan, A. Regulation of intercellular adhesion molecule-1 (CD54) gene expression. J. Leukoc. Biol. 66, 876-888 (1999).
