Summary
圧力筋運動記録法では、容器の無傷の小セグメントは、2つの小さなカニューレに取り付けられて、適切な内腔の圧力に加圧した。ここでは、マウス3の血管弛緩応答を測定する方法を説明
Abstract
圧力ミオグラフシステムは、適切な経壁圧に加小動脈の機能評価、で絶妙に便利です。圧力筋運動記録法で達成近い生理状態は血管床の生体内挙動に外挿することができる薬理学的および生理学的な刺激に固有の応答の詳細な特性評価を可能にします。圧力ミオグラフは、従来のワイヤmyographsに比べていくつかの利点を有する。例えば、小さい抵抗容器はしっかりと制御され、生理学的に適切な管腔内の圧力で研究することができる。ここでは、アセチルコリンに反応して血管リラックスするフェニレフリンで前収縮させた3次腸間膜動脈（長い3〜4ミリメートル）、、の能力を研究しています。腸間膜動脈を60 mmHgで一定の圧力に維持される加圧されてシールされたシステムに接続された2つのカニューレに取り付けられている。脈管の内腔と外径がcontinuouあるずるそうはそれぞれ、フェニレフリンおよびアセチルコリンに反応して血管収縮と血管弛緩のリアルタイム定量化を可能にし、ビデオカメラを用いて記録した。
心血管疾患の病因を研究するために、圧力筋運動記録法の適用可能性を実証するため、我々は、全身性高血圧症のマウスモデルにおける内皮依存性血管機能を評価した。可溶性グアニル酸シクラーゼ（ - / - sGCα1）のα1サブユニット欠損マウスは時129S6（S6）背景（sGCα1 -/-S6）に高血圧ですが、ないときはC57BL / 6（B6）背景（sGCαに1 -/-B6）。圧力筋運動記録法を用いて、障害内皮依存性血管弛緩におけるsGCα1欠乏の結果のことを示しています。血管の機能不全は、おそらくcontributisGCα1 -/-B6マウスよりsGCα1 -/-S6においてより顕著であるsGCα1 -/-B6マウスよりsGCα1 -/-S6が高い血圧にNG。
圧力筋運動記録法により、心血管疾患のメカニズムに私達の洞察力を増強、血管の収縮と弛緩に様々な刺激の効果を評価するために使用することができ、比較的簡単ですが、高感度かつ機構的に有用な技術である。
Introduction
圧力ミオグラフシステムは小動脈、静脈及び他の血管の生理学的機能および特性を測定するために使用される。動脈または静脈の無傷の小セグメントは、2つの小さなガラスカニューレに取り付けられ、槽がインビボ特性（ 図1および2）のの大部分を維持することができ、適切な内腔の圧力に加圧される。圧力ミオグラフにおける生理学的状態の近くに孤立血管の本質的な性質（ 例えば筋トーン）の調査を可能にする、血管床の生体内挙動に反映されます。筋収縮力変換装置1への直接の機械的結合によって評価されるワイヤ筋運動記録法、過圧力筋運動記録法の利点のいくつかは、血管系で開発された全体の抵抗を定義するマイクロ抵抗動脈が、一方で、検討することができる（i）を含むワイヤーミオグラフは大きい導管動脈、（ⅱ）Tに限定されているまだワイヤが（iii）の容器の自然な形状が良好に維持される、血管内腔を通過する必要がないので、内皮細胞に損傷を与えるハット危険性が低減され、および（iv）した船舶寸法は、広範囲ので学ぶことができる圧力やせん断応力2。
微細血管を勉強することは、高血圧などの心血管疾患で、変更された血管緊張に貢献病態と分子メカニズムを理解するために大規模な導管動脈の勉強よりも有益なことができます。例えば、8週間のマウスに高脂肪食を供給するに関連付けられている血管内皮機能障害はなく、大動脈輪で2 回オーダー腸間膜動脈を3（ 図3）で実証することができます。圧力筋運動記録法の別の利点は、加圧容器の固有筋収縮が存在することであり、この現象内皮の役割と機能について検討することができる。ここでは、DESCR損なわれた一酸化窒素（NO）-cGMPのシグナリングの設定でマウスの腸間膜3次抵抗動脈の血管反応性を研究するために、圧力ミオグラフの使用をIBE。
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Protocol
1。溶液の調製
- 500X EDTAストック：500mgのEDTA- の Na 2•2H 2 Oを比較検討し、50ミリリットルの脱イオン水に溶解する。室温で保管してください。
- 塩化カリウムは、ソリューションを脱分極。
- 3.69グラムのNaCl、18.64グラムのKCl、0.36グラム硫酸マグネシウム無水、0.41グラムのKH 2 PO 4、0.46グラムのCaCl 2•2H 2 O：K10Xストック溶液を調製250ミリリットルの脱イオン水に溶解する。室温で保管してください。
- ソリューション1Xを脱分極100ミリリットル最終のKClの場合：90ミリリットル脱イオン水0.21のNaHCO 3、0.18グラムのブドウ糖を溶かす。 K10X原液10mlのを追加します。 500X EDTA溶液95μLを加える。よく混ぜる。 4℃で保存一週間以内にご使用ください。
- 実験の日（1リットル用）に新鮮なHEPES-PSS溶液を調製。
- 6.96グラムのNaCl、0.35グラムのKCl、0.288グラムし、MgSO 4·7H 2 O•、0.1605グラムKH 2 PO 4、2.38グラムHEPES。 100mlに溶解する脱イオン水。フラスコAとマーク
- 0.312グラムのCaCl 2•2H 2 O脱イオン水100mlに溶解する。フラスコBとしてマーク
- 1.25グラムのNaHCO 3、0.991グラムのブドウ糖。 98ミリリットルの脱イオン水に溶解する。フラスコC.としてマーク
- C.大きなフラスコ内の700ミリリットルの脱イオン水を取るフラスコ中500X EDTA 2 mlを加え。連続ボルテックス大きなフラスコにフラスコA、BおよびCの内容を注ぐ。 NaOHでpHを7.4に調整する。
2。使用される薬剤
- フェニレフリン（10 -2 M）：10ミリリットルの脱イオン水に20.37ミリグラム溶かす。 -80アリコート1ミリリットルと店舗℃の直列実験の日に、10 -3、10 -4、10 -5〜10 -6モル/ Lを得るために希釈する。
- アセチルコリン（10 -2 M）：10ミリリットルの脱イオン水に18.17ミリグラム溶かす。 -80アリコート1ミリリットルと店舗℃のシリアル10 -3、10 -4、10 -5及び10 -6を得るために希釈する実験当日のモル/ L。
3。マウス
男性WTとsGCα1 - / - S6とB6の背景にマウスがこの研究を通して検討した。 sGCα1 - / -は4,5前述のように作製した。実験動物（マウス）を含むハウジングと手順はマサチューセッツ総合病院、ボストン、マサチューセッツ州の研究動物のケアに小委員会によって承認された。
4。腸間膜動脈における血管反応性の測定
- （200 mg / kg体重、腹腔内）ペントバルビタールでマウスを安楽死させる。腹腔を開き、腸間膜組織を解剖する。分離し、解剖結合および脂肪組織の自由3次の腸間膜動脈、および95％O 2/15分間、5％CO 2で予め平衡化し、氷冷HEPES-PSS溶液中の動脈を置く。無腸間から分岐して2〜3ミリメートルの長さのリングをカット動脈。血管内に血液が存在しない場合ミクロ血管レベルで動脈と静脈を区別することは問題である。したがって、我々はそれを解剖前に動物でまだそのままである一方、血管を識別をお勧めします。
- 入口および出口弁を通しての10ml注射器の助けを借りて、HEPES-PSS溶液を用いて圧力ミオグラフ室（DMTモデル110P＆11Pバージョン1.31、 図2）におけるガラスカニューレに記入します。過度の圧力がカニューレに接続されている脆弱なトランスデューサーを破損する恐れがあるので、カニューレの充填を穏やかにし、慎重に行う必要があります。充填後カニューレはしっかり入口と出口バルブの両方を閉じます。
- 右カニューレに容器の一方の端を取り付け、慎重にナイロン縫合糸の一つ細かい鎖とそれを結ぶ。注射器の助けを借りて、入口弁経由HEPES溶液を容器にフラッシュと記入。近い容器に左のカニューレに持参し、その上に容器のもう一方の端をマウントします。ナイロン縫合糸でそれを結ぶ。埋めるHEPES溶液で10ミリリットルまでとチャンバー。優しく注射器の助けを借りて、入口弁を介しHEPES溶液を押すことで漏れをチェックします。
- ミオグラフで、ビデオカメラの下でチャンバーをインストールします。チャンバー内の酸素や熱（37℃）を起動します。バルブが閉じている間、第HEPES液リザーバからチューブP1と入口弁を接続する。チューブ内に気泡がなくなるまで、チューブを介して任意のバブルとソリューションパスしましょう。バルブを開きます。
- チューブP2は圧力調整器から来るとチャンバーの左バルブを接続します。任意の気泡を再度確認してください。全体のシステム内の任意の気泡や漏れがあってはいけません。
- ミオインターフェイスパネル上またはソフトウェア内の圧力メニューに移動し、流れをOFFしながらポンプをONにしてください。
- プログラムを開いて、COLLECTをクリックします。容器（ 図3）現在画面に表示されるべきである。容器はmonitoriを可能にする、顕微鏡に取り付けられたカメラで可視化されるngのと血管腔、血管径、肉厚の分析。
- 徐々にミオ - インターフェイスパネルまたはプログラムのP1の圧力を選択することにより、P1バルブ経由interluminal圧力を高め、次のように圧力値を入力します。5 mmHgの→10→20→40→60 mmHgの。容器はいつか圧力が増加している間にねじったり畳み込むする傾向;テンションを調整したり、垂直または縦マイクロポジショナー（ 図2）の助けを借りて、それに応じて負担。 60 mmHgので容器を平衡化し、37℃45分間、少なくとも。平衡時に予め温めHEPESで一度浴溶液を変更します。
- のKCl脱分極溶液10mlを適用し、完全に平滑筋細胞を脱分極および最大収縮を達成するために浴に、37℃で温め。安定したくびれた後、HEPES溶液3回、10分ごとにバスをすすいでください。
- 安定して再現することにより内皮の血管と整合性の実行可能性を確認してくださいフェニレフリンの添加（10 -5 M）およびアセチルコリンへ撓応答（10 -5 M）。 HEPES溶液ごとに10分で3回すすいでください。
- -容器preconstrict、安定したくびれが得られた場合に、アセチルコリンの増加する用量（10 -9、3×10の逐次添加によって累積濃度血管拡張応答曲線（CRC）を実行するフェニレフリン（10 -5 M）を追加9、10 -8、3×10 -8、10 -7、3×10 -7、10 -6、3×10 -6および10 -5 M）。最終投与後、10分ごとに新しいCRCを開始する前にHEPES溶液で3回すすいでください。
- 2mMのEGTAを含むCa 2 +のフリーPSSを適用することにより、受動的な内腔の直径を決定します。すべてのパラメータを計算するために使用される各用量反応のための記録されたトレーシング対策ルーメン径（ 図4）から。
- PERCとしてすべてのアセチルコリン弛緩応答を表現以下の式を用いてフェニレフリン収縮後のカルシウムフリー直径と直径、の違いと比べてフェニレフリンpreconstriction後の内腔直径entageの変更：
- パーセンテージ拡張= 100％X [（D X - D I）/（Dカルシウムフリー - D I）]、ここで、Dは測定された内腔直径およびXは、私であり、CA送料アゴニストの各用量で動脈の直径を表す（x）は、初期の直径以下はくびれは、（i）、およびCa 2 +を含まないバッファ（CA-無料）フェニレフリン。
5。統計分析
すべての連続測定は、平均±SEMとして表される。腸間膜動脈の血管反応性を反復測定の双方向分散分析によって分析される。すべての場合において、P <0.05は統計的に有意であると考えられる。
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Representative Results
NOは集中人間6および動物モデル7の両方で血圧の恒常性の維持に関与していません。血管平滑筋の弛緩を制御するNOの能力は、可溶性グアニル酸シクラーゼ（sGCの）、cGMPの8を生成ヘム含有ヘテロ酵素によって媒介される。近年、血圧修飾遺伝的変異は、ヒト9の血圧を調節するのsGCの関連性を示す、sGCα1およびsGCβ1遺伝子を含む遺伝子座の同定された。興味深いことに、sGCの（sGCα1 - / - ）のα1サブユニット欠損雄マウスは、高血圧のとき129S6（S6）背景（sGCα1 -/-S6）5上ではなく、ときにC57BL / 6（B6）の背景に（sGCα1 -/-B6）4。私たちは、腸間膜住民でアセチルコリンに反応して血管の弛緩を勉強する圧力筋運動記録法を使用した- / - S6とB6背景やフェニレフリン（ 図4）で前収縮させた上でマウスのスタンスの動脈はWTとsGCα1から分離された。彼らは血管系の究極の抵抗とコンプライアンスを定義するため、直接血圧を調節するので、我々は抵抗の動脈を検討した。 sGCα1欠乏 関係なく勉強マウス（ 図4および5）の遺伝的背景の、血管の弛緩を誘導するcetylcholineの能力の低下と関連していた。 - / - B6の背景にマウス（ 図5）10sGCα1よりS6の背景にマウス- / -しかし、内皮依存性弛緩はより顕著sGCα1に障害されていた。一緒に、これらの知見は、内皮依存性弛緩に対する血管系の減少感度はsGCの＆ALPHで株特異高血圧に貢献するかもしれないことを示唆している図1 - / -マウス。
図1。回路図は、圧力ミオグラフ室（DMT）の様々な部分を描いた。挿入図チャンバー内カニューレに取り付けられた船。 大きい図を表示するには、ここをクリックしてください 。
図2。 （A）基礎及び（B）フェニレフリン誘発のくびれの下に2次マウス腸間膜動脈の録画中にキャプチャ代表画像は、、。外径、血管内腔は、それぞれ緑と赤の線で区切られています。右のパネルでトレースはARで測定された信号強度を表すEAは外径（緑の矢印）とルーメン径（赤矢印）のために、左の画像では青色のボックスで定義されている。
図3。 8週間の高脂肪食を与えたマウスでは血管内皮機能障害、大動脈輪に明らかではなかった。内皮機能はフェニレフリンにおけるアセチルコリン（10 -9〜10 -5 M）（10 -5 M）前により誘導される血管弛緩応答によって測定された大動脈輪を委託。標準飼料、野生型マウスは、標準食（N = 8）を供給して、高脂肪食を、野生型マウスは4-6週間（N = 13）が、高脂肪食を与えた。
図4。フェニレフリンproconstricted 2次mの上のアセチルコリンの用量反応曲線の代表的な元のトレーシングWTB6（）とsGCα1 -/-S6マウス（B）から分離された。矢印esenteric動脈はアセチルコリンの漸増用量（10 -9〜10 -5 M）の累積加算を表す。 X軸は時間（秒）を表し、Y軸は内腔直径（μM）を表します。 より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。
図5。 sGCα1株特異高血圧- / -マウスはsGCα1における血管反応性の大きい減損-/-S6マウスsGCα1 -/-B6マウスよりも関連付けられているアセチルコリンの能力は、（10 -9〜10 -5。 ）を誘導するための緩和がフェニレフリン-Pで定量され- / - （オープンsymbnols、破線）B6上のマウス（丸）またはS6（四角）遺伝的背景の雄の野生型（WT、閉じ記号、フルライン）とsGCα1からrecontracted（10 -5 M）腸間膜動脈。アセチルコリン誘発の血管弛緩はsGCα1 -/-B6マウスよりsGCα1 -/-S6に大きい程度に損なわれる。 NsGCα1 = 3,5,3および6 -/-S6、それぞれsGCα1 -/-B6、WTS6、。 †* P <0.05対1sGCα-/-B6、P <0.05対sGCα1 - / - 、同一の遺伝的背景。適応フォーム買収ら （2012）。
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Discussion
マウスは一部であるため、それによって人間の病態生理のためのマウスモデルを生成する遺伝子改変を導入する可能性があるため、多くの研究者のための選択の実験モデルである。血管小さい抵抗の状態ではなく、より大きな導管血管のは、主に脈管系11を通して血流の調節を画定する。マウスのような小動物の抵抗動脈、のサイズが微小血管の機能を研究するためのワイヤミオグラフの使用を防止します。圧力myographsはこの制限を克服するだけでなく、近い生理的条件下で血管機能の測定を可能にするだけでなく。
我々は以前時129S6（S6）背景（sGCα1 -/-S6）5ではなく、C57BL / 6（B6）バックグラウンド（sGCα1 -/-B6）上の上のsGCα1欠損雄マウスは、高血圧であることが報告4。私たちは、このSという仮説を立てた- / - B6とS6背景上でマウスの血圧の電車関連の格差がsGCα1の間の血管反応性の違いによるものです。圧力ミオグラフを用いて、3次腸間膜動脈内皮依存性血管弛緩応答を研究した。アセチルコリンは、細胞内Ca 2 +濃度を増加介して内皮型一酸化窒素合成酵素（eNOSの）を活性化する内皮におけるその受容体に結合するムスカリン受容体アゴニストである。 NOはその後弛緩を誘発するために、基礎となる平滑筋細胞層にsGCの活性化に登録する。
- / - WTとsGCα1から分離vasorelax腸間膜動脈にNO派生内皮の能力と比較する圧力筋運動記録法を使用した- / - B6とS6にマウスS6とB6の背景にマウスを、私たちはsGCα1の間の血管反応性の違いを識別背景10。 sGCα1 -欠乏はS6とB6マウスの両方で障害内皮依存性血管弛緩と関連していた。しかし、この障害はsGCα1 -/-B6マウスよりsGCα1 -/-S6の方が大きかった。 S6マウスで血管弛緩を誘導するアセチルコリンの能力の低下は、おそらくsGCα1 -/-S6マウスではなくsGCα1 -/-B6マウスで観察された血圧の上昇に寄与している。高血圧は、しばしば腎異常12に起因しているが、これらの結果は、血管平滑筋の緊 張の主な異常が、損なわNO-cGMPのシグナリング10,13に関連付けられたとして、例えば、直接、全身性高血圧の発展に寄与することができる新たな仮説を強化する14。
結論では、圧力ミオグラフ技術は血管生理学や薬理学者の手に非常に強力なツールであり、bができますeはマイクロ血管機能を分析するために使用。我々の研究は、全身性高血圧のモデルでは、基礎となる血管の異常を検出する圧力筋運動記録法の適用可能性を示しています。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
著者は博士に感謝します。 DMT圧力ミオグラフとDRSを使用するためのポール黄とドミトリAtochin。高脂肪食または標準食を与えたマウスを提供するためのBinglan Yuとチョンレイ。
資金源
この作品は、ハーバードメディカルスクール（ESに買収）から医学学者サイエンティスト開発米国心臓協会（ESに買収）からグラント10SDG2610313、とエレノアとマイルズショア50周年記念フェローシッププログラムによってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358 | |
| CaCl2 (2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M65-500 | |
| KH2PO4 | Sigma | P3786 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318 | |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP121 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Phenylephrine | Acros Organics | AC20724 | |
| Acetylcholine | Sigma | A6625 | |
| Pressure Myograph System | DMT |
References
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