Summary
I press myography, er en intakt liten del av et fartøy montert på to små kanyler og satt under trykk til et passende luminale trykk. Her beskriver vi en fremgangsmåte for å måle vasorelaxation responsen i mus tre
Abstract
Pressure myograph systemer er utsøkt anvendbare ved funksjonell vurdering av små arterier, satt under trykk til et passende transmuralt trykk. Den nær fysiologisk tilstand oppnådd i press myography tillater inngående karakterisering av iboende respons til farmakologiske og fysiologiske stimuli, som kan ekstrapoleres til den i vivo-oppførsel av det vaskulære bed. Pressure myograph har flere fordeler fremfor konvensjonelle wire myographs. For eksempel kan mindre motstand fartøy bli studert ved strengt kontrollert og fysiologisk relevant intraluminale press. Her studerer vi muligheten av 3 rd orden mesenteric arterier (3-4 mm lange), preconstricted med phenylephrine, til vaso-slappe av i respons på acetylkolin. Mesenteriske arterier er montert på to kanyler som er koblet til en trykksatt og forseglet system som holdes ved konstant trykk på 60 mmHg. Den lumen og ytre diameter av fartøyet er continuouslu registrert med et videokamera, slik sanntid kvantifisering av vasokonstriksjon og vasorelaxation som reaksjon på fenylefrin-og acetylkolin, henholdsvis.
For å demonstrere anvendelsen av press myography å studere årsakene til hjerte-og karsykdommer, vurderte vi endotel-avhengig vaskulær funksjon i en murine modell av systemisk hypertensjon. Mus mangelfull i α 1-subenheten av løselig guanylatsyklase (sGCα 1 - / -) er hypertensive når du er på en 129S6 (S6) bakgrunn (sGCα en -/-S6), men ikke når du er på en C57BL / 6 (B6) bakgrunn (sGCα 1 -/-B6). Ved hjelp av press myography, viser vi at sGCα 1-mangel fører til svekket endotel-avhengig vasorelaxation. Den vaskulær dysfunksjon er mer uttalt i sGCα en -/-S6 enn i sGCα en -/-B6 mus, sannsynligvis bidragng til høyere blodtrykk i sGCα en -/-S6 enn i sGCα en -/-B6 mus.
Pressure myography er en relativt enkel, men følsom og mechanistically nyttig teknikk som kan brukes til å vurdere effekten av ulike stimuli på vaskulær kontraksjon og avslapning, og dermed forsterke vår innsikt i de mekanismene bak hjerte-og karsykdommer.
Introduction
Press myograph systemer brukes til å måle fysiologiske funksjoner og egenskaper av små arterier, vener og andre fartøy. En intakt lite segment av en arterie eller vene er montert på to små glass kanyler og satt under trykk til et passende luminal trykk, slik at fartøyet for å opprettholde mesteparten av sin in vivo-egenskaper (figur 1 og 2). Den nær fysiologisk tilstand i et trykk-myograph reflekterer in vivo-oppførsel av det vaskulære bed, slik at undersøkelse av iboende egenskaper (f.eks myogenisk tone) på isolerte kar. Noen av fordelene ved trykk myography løpet ledning myography, hvor musklene trekker vurdert ved direkte mekanisk kopling til en kraft transduser 1, inkluderer (i) at mikro motstand arterier, som definerer den samlede motstand utviklet i vaskulær-systemet, kan bli studert, mens ledning myograph er begrenset til større kanal-arterier, (ii) tlue risikoen for å skade endotelet er redusert ettersom ingen ledninger som må føres gjennom årehulrommet, (iii) at den naturlige formen på fartøyet er bedre opprettholdes, og (iv) at fartøyet dimensjon kan studeres ved et bredt spekter av press eller Skjærspenning to.
Studerer mikro fartøy kan være mer informativ enn å studere større kanal arteries til å forstå patofysiologien og molekylære mekanismer som bidrar til endret vaskulær tone i kardiovaskulære sykdommer som høyt blodtrykk. For eksempel kan nedsatt endotelfunksjon forbundet med å mate musene et fettrikt kosthold i 8 uker bli demonstrert i to nd-order mesenteric arteries 3, men ikke i aorta ringer (figur 3). En annen fordel med press myography er at indre myogenisk innsnevring av den trykksatte beholderen er til stede, og at rollen og funksjonen til endotelet i dette fenomenet kan studeres. Her beskr viIBE bruk av et trykk myograph å studere vaskulær reaktivitet av mus mesenteriske 3. rekkefølge motstand arterier i en innstilling av nedsatt nitrogenoksid (NO)-cGMP signalering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Utarbeidelse av løsning
- 500X EDTA lager: veie 500 mg EDTA-Na 2 • 2H 2 O og oppløses i 50 ml avionisert vann. Oppbevar ved romtemperatur.
- KCl depolariserende løsning.
- Forbered K10X stamløsning: 3,69 g NaCl, 18,64 g KCl, 0,36 g MgSo4 vannfri, 0,41 g KH 2 4 PO, 0,46 g CaCl 2 • 2H 2 O. Løs opp i 250 ml avionisert vann. Oppbevar ved romtemperatur.
- For 100 ml endelig KCl depolariserende løsning 1X: Oppløs 0,21 NaHCO 3, 0,18 g glukose i 90 ml deionisert vann. Tilsett 10 ml K10X stamløsning. Legg 95 mL av 500X EDTA-løsning. Bland godt. Oppbevar ved 4 ° C. Bruk innen en uke.
- Forbered frisk HEPES-PSS løsning på dagen av eksperimentet (For en liter).
- 6.96 g NaCl, 0,35 g KCl, 0,288 g MgSo4 • 7H 2 O, 0,1605 g KH 2 4 PO, 2,38 g HEPES. Oppløses i 100 mldeionisert vann. Mark som kolbe A.
- 0.312 g CaCl 2 • 2H 2 O. Oppløs i 100 ml deionisert vann. Marker som kolbe B.
- 1.25 g 3 NaHCO, 0,991 g glukose. Løs opp i 98 ml deionisert vann. Marker som kolbe C.
- Tilsett 2 ml 500X EDTA i kolbe C. Ta 700 ml deionisert vann i en stor kolbe. Hell innholdet i kolbe A, B og C i stor kolbe med kontinuerlig risting. Juster pH til 7,4 med NaOH.
2. Legemidler som brukes
- Phenylephrine (10 -2 M): Løs opp 20,37 mg i 10 ml avionisert vann. Delmengde 1 ml og oppbevar ved -80 ° C. Serielt fortynnet for å oppnå 10 -3, 10 -4, 10 -5, -6 og 10 mol / L på dagen for eksperimentet.
- Acetylkolin (10 -2 M): Oppløs 18.17 mg i 10 ml deionisert vann. Delmengde 1 ml og oppbevar ved -80 ° C. Serielt fortynne å få 10 -3, 10 -4, 10 -5 og 10 -6mol / L på dagen for eksperimentet.
3. Mus
Mann WT og sGCα 1 - / - mus på S6 og B6 bakgrunn ble undersøkt i denne studien. Den sGCα 1 - / - ble generert som beskrevet tidligere 4,5. Bolig og prosedyrer som involverer forsøksdyr (mus) ble godkjent av underkomiteen på forskning Animal Care of Massachusetts General Hospital i Boston, MA.
4.. Måling av vaskulær reaktivitet i Mesenteric arterie
- Avlive mus med pentobarbital (200 mg / kg, ip). Åpne bukhulen og dissekere ut mesenteric vev. Isolere og dissekere en mesenteric arterie av 3. orden fri for bindevev og fettvev, og plasser arterien i iskaldt HEPES-PSS løsning pre-likevekt med 95% O 2/5% CO 2 i 15 min. Skjær ringer av 2-3 mm lengde uten forgrening fra mesentericarterie. Skille mellom arterier og vener på mikro fartøy nivå er problematisk når det ikke er blod i fartøyene. Derfor anbefaler vi å identifisere skipet mens det fortsatt er intakt i dyret før dissekere den ut.
- Fyll i glasset kanyler i trykket myograph kammer (DMT Model 110P & 11P versjon 1.31, figur 2) med HEPES-PSS-løsning ved hjelp av en 10 ml sprøyte gjennom innløps-og utløpsventiler. Fylling av kanyle bør gjøres forsiktig og nøye så høyt trykk kan skade den skjøre svinger tilkoblet kanyler. Etter påfylling kanyler lukke både innløp og utløp ventiler tett.
- Montere en ende av fartøyet på høyre kanyle og nøye binde den med en fin tråd av nylon-sutur. Med hjelp av en sprøyte, skylle og fylle karet med HEPES løsning via løpsventil. Bring i venstre kanylen nærmere fartøyet og montere den andre enden av beholderen på den. Knytte det med nylon sutur. Fyllkammeret med opp til 10 ml med HEPES-løsning. Kontroller for lekkasjen ved å skyve HEPES-løsning over innløpsventilen ved hjelp av en sprøyte.
- Installer kammer på myograph og under videokameraet. Start oksygen og varme (37 ° C) i kammeret. Koble innløpsventilen med rør P1 fra den første HEPES-løsning reservoaret, mens ventilen er lukket. La enhver boble og løsning pasning inn i røret inntil det ikke er noen luftbobler i røret. Åpne ventilen.
- Koble den venstre ventilen på kammer med tube P2 kommer fra trykkregulator. Igjen se etter eventuelle bobler. Det bør ikke være noen bobler eller lekkasje i hele systemet.
- Gå til press menyen på myo-grensesnittet panel eller i programvaren og slå på pumpen mens du slår AV strømmen.
- Åpne programmet og klikk SAMLE. Fartøyet skal ses på skjermen nå (fig. 3). Fartøyet er synlige ved hjelp av et kamera montert på et mikroskop, slik at overvåkingsng og analyse av årehulrommet, kar diameter, og veggtykkelse.
- Gradvis øke interluminal press via P1 ventilen ved å velge P1 trykket i myo-grensesnittet panel eller i programmet og angir trykket som følger; 5 mmHg → 10 → 20 → 40 → 60 mmHg. Fartøyet har en tendens gang å vri eller convolute mens trykket øker, justere spenningen eller belastning tilsvarende ved hjelp av vertikal eller langsgående micropositioner (figur 2). Stabilisere skipet ved 60 mm Hg og 37 ° C i det minste i 45 min. Endre badekaret løsning en gang med pre-varmet HEPES under likevekt.
- Påfør 10 ml KCl depolariserende løsning, varmet ved 37 ° C, til badet for å fullt ut depolarize glatte muskelceller og oppnå maksimal innsnevring. Etter stabil innsnevring, skyll bad med HEPES løsning tre ganger hvert 10 min.
- Sjekk levedyktigheten av fartøyet og integriteten til endotelet ved stabil og reproduksjonvertible respons på tilsetning av fenylefrin (10 -5 M) og acetylcholin (10 -5 M). Skylling 3 ganger med HEPES-oppløsning hvert 10. min.
- Legg fenylefrin (10 -5 M) til preconstrict fartøyet, og når en stabil innsnevring er oppnådd, utføre en kumulativ konsentrasjon-responskurve vasodilatasjon (CRC) ved sekvensiell tilsetning av økende doser av acetylkolin (10 -9, 3 x 10 - 9, 10 -8, 3 X 10 -8, 10 -7, 3 X 10 -7, 10 -6, 3 x 10 -6, og 10 -5 M). Etter siste dose, skyll 3 ganger med HEPES løsning hvert 10 min før du starter ny CRC.
- Bestem passive lumen diameter ved å bruke Ca 2 +-free PSS inneholder 2 mM EGTA. Fra den innspilte kalkeringer måle lumen diameter for hvert dose-respons (figur 4), som vil bli brukt til å beregne alle parametere.
- Uttrykke alle acetylkolin avslapping svar som percentage endring i lumen diameter etter fenylefrin preconstriction sammenliknet med differansen mellom kalsium-fri diameter og diameteren etter fenylefrin innsnevring, ved hjelp av følgende ligning:
- Prosentvis dilatasjon = 100% x [(D x - D i) / (D-Ca-fri - D i)], der D er den målte lumen diameter og x, i, og Ca-fri betegne arterielle diametre ved hver dose av agonist (x), fenylefrin innledende diameter følgende innsnevring (i), og i Ca2 +-fri buffer (Ca-fri).
Fem. Statistisk analyse
Alle kontinuerlige målinger er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. Den vaskulær reaktivitet i mesenteric arteries er analysert av gjentatte-tiltak toveis ANOVA. I alle tilfeller, P <0,05 ansett som statistisk signifikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
NO er sentralt involvert i vedlikehold av blodtrykket homeostase både hos mennesker 6 og i dyremodeller 7. Evnen til ikke å kontrollere vaskulær glatt muskulatur avslapning er mediert av løselig guanylatsyklase (SGC), en heme-holdig heterodimeric enzym som genererer cGMP åtte. Nylig ble en blodtrykk-endring genetisk variant identifisert i en locus som inneholder sGCα 1 og sGCβ en gener, som illustrerer betydningen av SGC i å regulere blodtrykket hos mennesker 9. Interessant, mannlige mus mangelfull i α 1-subenheten av SGC (sGCα 1 - / -) er hypertensive når du er på en 129S6 (S6) bakgrunn (sGCα en -/-S6) 5, men ikke når du er på en C57BL / 6 (B6) bakgrunn (sGCα en -/-B6) 4. Vi brukte press myography å studere vaskulær avslapning respons på acetylkolin i mesenteric Resistance arteries isolert fra WT og sGCα 1 - / - mus på S6 og B6 bakgrunn og preconstricted med phenylephrine (figur 4). Vi studerte motstand arteries fordi de definerer ultimate motstand og etterlevelse av karsystemet og dermed direkte regulere blodtrykket. sGCα 1-mangel var assosiert med en redusert evne til å indusere en cetylcholine vaskulær avslapning, uten hensyn til den genetiske bakgrunn av musene undersøkt (Fig. 4 og 5). Imidlertid var endotel-avhengige avslapping mer alvorlig forringet i sGCα 1 - / - mus på bakgrunn S6 enn i sGCα 1 - / - mus på B6 bakgrunnen (figur 5) 10. Sammen utgjør disse funnene tyder på at den reduserte følsomheten av det vaskulære karet som endotelial-avhengig avkobling kan bidra til stamme-spesifikk hypertensjon i SGC & alphen, en - / - mus.
Figur 1. Skjematisk skildrer de ulike delene av trykket myograph kammer (DMT). Inset viser en montert skip på kanyler i kammeret. Klikk her for å se større figur .
Figur 2. Representative bilder, som tas under videoopptak, av en 2 nd for mus mesenteric arterie under (A) basal og (B) phenylephrine-indusert innsnevring. Den ytre diameter og fartøy lumen er avgrenset av grønne og røde linjer, henholdsvis. Sporene i de riktige panelene, er signalintensiteten målt i area definert av den blå boksen i bildene til venstre, for ytre diameter (grønne piler) og lumen diameter (røde piler).
Figur 3. Endotelial dysfunksjon i mus fôret med høy-fett diett i 8 uker var ikke tydelig i aorta ringer. Endothelial funksjon ble målt ved vasorelaxation respons indusert av acetylkolin (10 -9 til 10 -5 M) i phenylephrine (10 -5 M) pre -kontrakt aorta ringer. Standard kosthold, matet vill-type mus en standard diett (n = 8), høy-fett diett, vill-type mus matet en fettrik diett for 4-6 uker (n = 13).
Figur 4. Representative opprinnelige kalkering av doseresponskurve av acetylkolin på phenylephrine-proconstricted 2 nd for mesenteric arteriene ble isolert fra en WTB6 (A) og en sGCα en -/-S6 mus (B). piler representerer kumulativ tilsetning av økende doser av acetycholine (10 -9-10 -5 M). X-aksen representerer tid (i sekunder), representerer Y-aksen lumen diameter (i mm). Klikk her for å se større figur .
Figur 5. Den belastningen-spesifikke hypertensjon hos sGCα 1 - / - mus er assosiert med større nedskrivning av vaskulær reaktivitet i sGCα en -/-S6 mus enn i sGCα en -/-B6 mus Muligheten av acetylkolin (10 -9 til 10 -5. ) for å indusere avslapning er kvantifisert i phenylephrine-precontracted (10 -5 M) mesenteric arteries fra mannlige vill type (WT, lukkede symboler, full linje) og sGCα 1 - / - (åpne symbnols, stiplet linje) mus på B6 (sirkler) eller S6 (ruter) genetisk bakgrunn . Acetycholine-indusert vaskulær avslapning er svekket i større grad i sGCα en -/-S6 enn i sGCα en -/-B6 mus. N = 3,5,3 og 6 for sGCα en -/-S6, sGCα en -/-B6, WTS6, henholdsvis. † * P <0,05 vs sGCα en -/-B6, P <0.05 vs sGCα 1 - / - av samme genetiske bakgrunn. Tilpasset skjema Buys, et al. (2012).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mus er eksperimentell modell for mange etterforskere, delvis på grunn av muligheten for å innføre genetiske modifikasjoner, og dermed generere mus modeller for menneskelig patofysiologi. Den vasoaktivt status for liten motstand, men ikke for større kanal-fartøyer definerer hovedsakelig regulering av blodstrømmen gjennom det vaskulære system 11.. Størrelsen av motstanden arterier i små dyr, slik som mus, hindrer bruk av en wire myograph å studere mikrovaskulær funksjon. Press myographs ikke bare overvinne denne begrensningen, men også gi rom for måling av vaskulær funksjon under nær fysiologiske forhold.
Vi har tidligere rapportert at mannlige mus mangelfull i sGCα en er hypertensive når du er på en 129S6 (S6) bakgrunn (sGCα en -/-S6) 5, men ikke når du er på en C57BL / 6 (B6) bakgrunn (sGCα en -/-B6) 4. Vi antok at dette stog-relatert misforhold i blodtrykk skyldes forskjellene i vaskulær reaktivitet mellom sGCα 1 - / - mus på B6 og S6 bakgrunn. Ved hjelp av et trykk myograph, studerte vi endotel-avhengige vasorelaxation responser i 3 rd rekkefølge mesenteric arteries. Acetylcholin er en muskarin agonist som binder seg til sin reseptor på endotelet å aktivere endotelisk nitrogenoksidsyntase (eNOS) via økende intracellulær Ca2 + konsentrasjonen. INGEN kan deretter aktivere SGC i den underliggende glattmuskelcelle lag å indusere avslapning.
Ved hjelp av press myography å sammenligne evnen til endotelial avledet NEI til vasorelax mesenteric arteries isolert fra WT og sGCα 1 - / - mus på S6 og B6 bakgrunn, identifiserte vi forskjeller i vaskulær reaktivitet mellom sGCα 1 - / - mus på B6 og S6 bakgrunner 10. sGCα 1 -mangel var assosiert med svekket endotel-avhengig vasorelaxation i både S6 og B6 mus. Men var dette verdifall større i sGCα en -/-S6 enn i sGCα en -/-B6 mus. Redusert evne til acetylkolin å indusere vasorelaxation i S6 mus bidrar trolig til økningen i blodtrykket observert i sGCα en -/-S6 mus, men ikke i sGCα en -/-B6 mus. Selv om forhøyet blodtrykk er ofte tilskrives nyreabnormiteter 12, disse resultatene styrker den nye hypotesen om at primære forandringer av vaskulær glatt muskulatur tone, for eksempel som i forbindelse med nedsatt NO-cGMP signalering 10,13, kan direkte bidra til utvikling av systemisk hypertensjon 14.
I konklusjonen, er trykket myograph teknikken et svært kraftig verktøy i hendene på den vaskulære fysiolog eller farmakolog og kan be brukt for å analysere mikro fartøy funksjon. Vår studie viser anvendelsen av press myography i å oppdage underliggende karlidelser i en modell av systemisk hypertensjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke legene. Paul Huang og Dmitriy Atochin for bruk av DMT press myograph og Drs. Binglan Yu og Chong Lei for å gi mus fôret med høyt fettinnhold eller standard diett.
Finansieringskilde
Dette arbeidet ble støttet av Scientist Development Grant 10SDG2610313 fra American Heart Association (til ES Buys), og en Eleanor og Miles Shore 50th Anniversary Fellowship program for Scholars i medisin fra Harvard Medical School (til ES Buys).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358 | |
| CaCl2 (2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M65-500 | |
| KH2PO4 | Sigma | P3786 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318 | |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP121 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Phenylephrine | Acros Organics | AC20724 | |
| Acetylcholine | Sigma | A6625 | |
| Pressure Myograph System | DMT |
References
- Bridges, L. E., Williams, C. L., Pointer, M. A., Awumey, E. M. Mesenteric artery contraction and relaxation studies using automated wire myography. J. Vis .Exp. (55), e3119 (2011).
- Arribas, S. M., Daly, C. J., McGrath, I. C. Measurements of vascular remodeling by confocal microscopy. Methods Enzymol. 307, 246-273 (1999).
- Lei, C., Yu, B., et al. Inhaled Nitric Oxide Attenuates the Adverse Effects of Transfusing Stored Syngeneic Erythrocytes in Mice with Endothelial Dysfunction after Hemorrhagic Shock. Anesthesiology. , (2012).
- Buys, E. S., Cauwels, A., et al. sGCα1β1 attenuates cardiac dysfunction and mortality in murine inflammatory shock models. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 297 (2), H654-H663 (2009).
- Buys, E. S., Sips, P., et al. Gender-specific hypertension and responsiveness to nitric oxide in sGCα1 knockout mice. Cardiovasc. Res. 79 (1), 179-186 (2008).
- Panza, J. A., Quyyumi, A. A., Brush, J. E., Epstein, S. E. Abnormal endothelium-dependent vascular relaxation in patients with essential hypertension. N. Engl. J. Med. 323 (1), 22-27 (1990).
- Huang, P. L., Huang, Z., et al. Hypertension in mice lacking the gene for endothelial nitric oxide synthase. Nature. 377 (6546), 239-242 (1995).
- Friebe, A., Koesling, D. The function of NO-sensitive guanylyl cyclase: what we can learn from genetic mouse models. Nitric Oxide. 21 (3-4), 149-156 (2009).
- Ehret, G. B., Munroe, P. B., et al. Genetic variants in novel pathways influence blood pressure and cardiovascular disease risk. Nature. 478 (7367), 103-109 (2011).
- Buys, E. S., Raher, M. J., et al. Genetic modifiers of hypertension in soluble guanylate cyclase alpha1-deficient mice. J. Clin. Invest. 122 (6), 2316-2325 (2012).
- Kauffenstein, G., Laher, I., Matrougui, K., Guerineau, N. C., Henrion, D. Emerging role of G protein-coupled receptors in microvascular myogenic tone. Cardiovascular Research. 95 (2), 223-232 (2012).
- Ruilope, L. M. Hypertension in 2010: Blood pressure and the kidney. Nat. Rev. Nephrol. 7 (2), 73-74 (2011).
- Michael, S. K., Surks, H. K., et al. High blood pressure arising from a defect in vascular function. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (18), 6702-6707 (2008).
- Mendelsohn, M. E. In hypertension, the kidney is not always the heart of the matter. J. Clin. Invest. 115 (4), 840-844 (2005).
