Summary
Em Miografia pressão, um pequeno segmento de um vaso intacto é montado sobre duas pequenas cânulas e pressurizado a uma pressão adequada luminal. Aqui, descrevemos o método para medir a resposta vasorelaxation do mouse 3
Abstract
Sistemas myograph pressão são primorosamente útil na avaliação funcional das pequenas artérias, pressurizado a uma pressão transmural adequado. A condição fisiológica perto alcançado em Miografia pressão permite a caracterização aprofundada das respostas intrínsecas a estímulos farmacológicos e fisiológicos, os quais podem ser extrapolados para o comportamento in vivo do leito vascular. Myograph pressão possui diversas vantagens em relação myographs fios convencionais. Por exemplo, os vasos de resistência menores pode ser estudada a pressões intraluminais estritamente controlados e fisiologicamente relevante. Aqui, vamos estudar a possibilidade de 3 ª ordem artéria mesentérica (3-4 mm de comprimento), preconstricted com fenilefrina, a vaso-relaxamento em resposta à acetilcolina. Artérias mesentéricas são montados em duas cânulas ligadas ao sistema pressurizado, selado e que é mantida a uma pressão constante de 60 mmHg. O diâmetro do lúmen e o exterior do vaso são Continuously gravado com uma câmara de vídeo, que permite a quantificação da vasoconstrição e relaxação de vasos em resposta a fenilefrina e acetilcolina em tempo real, respectivamente.
Para demonstrar a aplicabilidade do Miografia pressão para estudar a etiologia da doença cardiovascular, avaliou-se a função vascular endotélio-dependente em um modelo murino de hipertensão sistémica. Camundongos deficientes na subunidade α 1 da guanilato ciclase solúvel (sGCα 1 - / -) são hipertensos quando em um (S6) Fundo 129S6 (sGCα 1 -/-S6), mas não quando em um C57BL / 6 (B6) fundo (sGCα 1 -/-B6). Usando Miografia pressão, demonstramos que sGCα 1 deficiência resulta em alterações na vasorelaxation endotélio-dependente. A disfunção vascular é mais acentuada em sGCα 1 -/-S6 que em sGCα 1 -/-B6 ratos, provavelmente CONTRIBUTOng a maior pressão no sGCα 1 -/-S6 que em sGCα um -/-B6 ratinhos.
Miografia pressão é uma técnica relativamente simples, mas sensível e mecanisticamente útil que pode ser utilizado para avaliar o efeito de diferentes estímulos na contracção e relaxamento vascular, aumentando, assim, o nosso conhecimento sobre os mecanismos subjacentes à doença cardiovascular.
Introduction
Myograph sistemas de pressão são usadas para medir a função e as propriedades fisiológicas das pequenas artérias, veias e outros recipientes. Um pequeno segmento de uma artéria ou veia intactas é montada sobre dois pequenos cânulas de vidro e pressurizado a uma pressão luminal adequada, permitindo que o recipiente para manter a maior parte do seu características in vivo (Figuras 1 e 2). A condição fisiológica perto num myograph pressão reflecte o comportamento in vivo do leito vascular, o que permite a investigação das propriedades intrínsecas (por exemplo, o tom miogénica) de vasos isolados. Algumas das vantagens da Miografia Miografia pressão ao longo do fio, onde a contração muscular é avaliada através de acoplamento mecânico directo a um transdutor de força 1, incluem: (i) que as micro artérias de resistência, que definem a resistência global desenvolvido no sistema vascular, podem ser estudadas, enquanto myograph fio está limitado a maiores artérias condutas, (ii) tchapéu o risco de danificar o endotélio é reduzido uma vez que não há necessidade de fios de ser passado através do lúmen do vaso, (iii) que a forma natural do vaso é melhor mantida, e (iv) que dimensão navio pode ser estudado em uma ampla gama de pressões ou estresse de cisalhamento 2.
Estudar micro vasos pode ser mais informativo do que estudar maiores artérias do conduíte para ajudar a compreender os mecanismos fisiopatológicos e moleculares que contribuem para a alteração do tônus vascular em doenças cardiovasculares, como hipertensão. Por exemplo, a deficiência da função endotelial associada com a alimentação de ratos uma dieta rica em gorduras durante 8 semanas podia ser demonstrado em 2 ª ordem artérias mesentéricas 3, mas não em anéis da aorta (Figura 3). Outra vantagem é que a pressão Miografia constrição miogénica intrínseca do recipiente pressurizado está presente, e que o papel e a função do endotélio para este fenómeno pode ser estudada. Aqui, nós describe o uso de uma pressão myograph para estudar a reactividade vascular mesentérica de rato 3 ª ordem artérias resistência numa configuração de óxido nítrico prejudicada (NO)-cGMP sinalização.
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Protocol
1. Preparação da Solução
- Estoque 500X EDTA: pesar 500 mg EDTA-Na 2 • 2H 2 O e dissolver em 50 ml de água deionizada. Guarde à temperatura ambiente.
- KCl solução despolarizante.
- Preparar a solução estoque K10X: 3,69 g NaCl, 18,64 g de KCl, 0,36 g MgSO4 anidro, 0,41 g KH 2 PO 4, 0,46 g de CaCl2 • 2H 2 O. Dissolve-se em 250 ml de água desionizada. Guarde à temperatura ambiente.
- Para 100 ml de solução final de KCl 1X despolarizante: Dissolver 0,21 NaHCO3, 0,18 g de glicose em 90 ml de água desionizada. Adicionar 10 ml da solução de K10X. Adicionar 95 ul de solução de EDTA 500X. Misturar bem. Armazenar a 4 ° C. É dentro de uma semana.
- Preparar solução fresca de HEPES-PSS no dia da experiência (para 1 litro).
- 6,96 g de NaCl, 0,35 g de KCl, 0,288 g de MgSO4 • 7H 2 O, 0,1605 g de KH 2 PO 4, 2,38 g de HEPES. Dissolve-se em 100 mlde água desionizada. Marcar como frasco A.
- 0,312 g CaCl 2 • 2H 2 O. Dissolve-se em 100 ml de água desionizada. Marcar como frasco B.
- 1,25 g de NaHCO3, 0,991 g de glicose. Dissolve-se em 98 ml de água desionizada. Marcar como frasco C.
- Adicionam-se 2 ml de EDTA num frasco de 500X C. Aqui 700 ml de água desionizada num balão de grande. Deite o conteúdo do balão A, B e C em grande balão com vórtex contínuo. Ajustar o pH para 7,4 com NaOH.
2. Drogas usadas
- A fenilefrina (10 -2 M): Dissolve-se 20,37 mg em 10 ml de água desionizada. Alíquota de 1 ml e armazenar a -80 ° C. Diluir em série para obtenção de 10 -3, 10 -4, 10 -5 e 10 -6 mol / L no dia da experiência.
- A acetilcolina (10 -2 M): Dissolve-se 18,17 mg em 10 ml de água desionizada. Alíquota de 1 ml e armazenar a -80 ° C. Diluir em série para obtenção de 10 -3, 10 -4, 10 -5, -6 e 10mol / l no dia da experiência.
3. Ratos
Macho WT e sGCα 1 - / - murganhos no fundo S6 e B6 foram estudados ao longo deste estudo. O sGCα 1 - / - foram gerados como descrito anteriormente 4,5. Habitação e procedimentos que envolvem animais de laboratório (ratos) foram aprovados pela Subcomissão de Pesquisa Animal Care do Massachusetts General Hospital, Boston, MA.
4. Medição de reatividade vascular em artéria mesentérica
- Eutanásia dos ratinhos com pentobarbital (200 mg / kg, ip). Abra a cavidade abdominal e dissecar o tecido mesentérica. Isolar e dissecar uma artéria mesentérica de 3 ª ordem isenta de tecido conjuntivo e adiposo e colocar a artéria no gelado Hepes PSS solução pré-equilibrada com 95% de O2 / 5% de CO 2 durante 15 min. Cortar anéis de 2-3 mm de comprimento, sem ramificação do mesentéricaartéria. A diferenciação entre artérias e veias nível micro vasos é problemático quando não há sangue nos vasos. Portanto, recomendamos identificar a embarcação enquanto ela ainda está intacta no animal antes de dissecá-lo para fora.
- Preencher as cânulas de vidro na câmara de pressão myograph (DMT Modelo 110P & 11P versão 1.31, Figura 2) com a solução de HEPES-PSS com a ajuda de uma seringa de 10 ml por meio de válvulas de entrada e de saída. Preenchimento de cânula deve ser feito com cuidado e com cuidado, pois a pressão excessiva pode danificar o transdutor frágil ligado a cânulas. Após o preenchimento cânulas fechar tanto de entrada e válvulas de saída com força.
- Montar uma extremidade do navio para cânula direito e amarrá-lo com cuidado e com um fio fino de fio de náilon. Com a ajuda de uma seringa, lave e preencher o recipiente com solução HEPES através da válvula de admissão. Trazer a cânula esquerda para mais perto do navio e montado na outra extremidade do recipiente sobre ele. Amarre-o com fio de náilon. Preenchera câmara com até 10 ml com a solução de HEPES. Entrada para o vazamento empurrando suavemente solução HEPES, através da válvula de entrada com a ajuda de uma seringa.
- Instalar a câmara na myograph e sob a câmara de video. Inicie o oxigénio e calor (37 ° C) na câmara. Ligação a válvula de admissão com o tubo de P1 a partir do primeiro reservatório para a solução de HEPES, enquanto a válvula é fechada. Que qualquer bolha e solução passe através do tubo até que não existam bolhas no tubo. Abrir a válvula.
- Ligação a válvula esquerdo da câmara com o tubo P2 proveniente do regulador de pressão. Novamente verifique se há bolhas. Não deve haver quaisquer bolhas ou vazamento em todo o sistema.
- Vá para o menu pressão sobre o painel de mio-interface ou no software e ligar a bomba enquanto desligar o fluxo.
- Abra o programa e clique em Collect. Veículo deve ser visto no ecrã agora (Figura 3). O vaso é visualizado com uma câmara montada num microscópio, permitindo monitoring e análise do lúmen do vaso, o diâmetro do vaso, e a espessura da parede.
- Aumentar gradualmente a pressão interluminal através da válvula P1 seleccionando pressão P1 no painel de mio-interface ou no programa e insira o valor da pressão da seguinte forma; 5 mmHg → 10 → 20 → 40 → 60 mmHg. Veículo algures tende a torcer ou convolute enquanto a pressão está a aumentar, ajustar a tensão ou tensão de acordo com a ajuda de microposicionador vertical ou longitudinal (Figura 2). Equilibrar a embarcação a 60 mmHg e 37 ° C, pelo menos durante 45 min. Altere a solução do banho uma vez com HEPES pré-aquecido durante equilíbrio.
- Aplicar 10 ml de solução despolarizante de KCl, pré-aquecida a 37 ° C, para o banho de despolarizar totalmente as células musculares lisas e alcançar a constrição máxima. Depois de constrição estável, lavar a banheira com solução HEPES 3 vezes a cada 10 min.
- Verificar a viabilidade do vaso e da integridade do endotélio, por estabilidade e reprodutibilidaderespostas comestíveis à adição de fenilefrina (10 -5 M) e acetilcolina (10 -5 M). Lavar 3 vezes com solução tampão HEPES a cada 10 min.
- Adicionar fenilefrina (10 -5 M) para preconstrict do navio, e quando uma constrição estável foi obtida, efectuar uma curva de resposta de concentração-cumulativa vasodilatação (CDC), por adição sequencial de doses crescentes de acetilcolina (10 -9, 3 x 10 - 9, 10 -8, 3 x 10 -8, 10 -7, 3 x 10 -7, 10 -6, 3 x 10 -6 e 10 -5 M). Após a última dose, lavar 3 vezes com solução HEPES a cada 10 minutos antes de iniciar novo CRC.
- Determinar o diâmetro do lúmen passiva através da aplicação de Ca 2 + PSS e contendo 2 mM de EGTA. A partir do diâmetro luminal medida traçados gravado para cada resposta a dose (Figura 4), que será utilizado para calcular todos os parâmetros.
- Expresse todas as respostas de relaxamento acetilcolina como percentagem mudança no diâmetro do lúmen, após a pré-fenilefrina em comparação com a diferença entre o diâmetro livre de cálcio e diâmetro após constrição fenilefrina, usando a seguinte equação:
- Dilatação percentual = 100% x [(D x - D i) / (D-Ca livre - D i)], em que D é o diâmetro do lúmen medido e x, i e Ca-livre denotar diâmetros arteriais para cada dose de agonista (x), segue diâmetro inicial fenilefrina constrição (i), e em Ca 2 + tampão livre (Ca-free).
5. Análise Estatística
Todas as medições contínuas são expressos como média ± SEM. A reatividade vascular em artérias mesentéricas é analisada por medidas repetidas ANOVA de duas vias. Em todos os casos, P <0,05 é considerado estatisticamente significativo.
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Representative Results
NO está envolvido centralmente na manutenção da homeostase da pressão sanguínea tanto em humanos como 6 e 7, em modelos animais. A capacidade do NO para controlar o relaxamento do músculo liso vascular é mediada por guanilato ciclase solúvel (sGC), um enzima heterodimérica contendo heme que gera cGMP 8. Recentemente, uma pressão sanguínea de modificação variante genética foi identificada num local que contém a sGCα 1 e genes sGCβ 1, ilustrando a relevância da GCs na regulação da pressão sanguínea em seres humanos 9. Curiosamente, ratos machos deficientes em α uma subunidade da SGC (sGCα 1 - / -) são hipertensos quando em um (S6) Fundo 129S6 (sGCα 1 -/-S6) 5, mas não quando em um fundo C57BL / 6 (B6) (sGCα 1 -/-B6) 4. Usamos Miografia pressão para estudar o relaxamento vascular em resposta a acetilcolina, em mesentérica resiartérias postura isolado de WT e sGCα 1 - / - murganhos nos S6 e B6 origens e preconstricted com fenilefrina (Figura 4). Foram estudadas as artérias de resistência porque eles definem a resistência final e conformidade do sistema vascular e, assim, regular diretamente a pressão arterial. sGCα uma deficiência foi associada a uma diminuição da capacidade de um cetylcholine para induzir o relaxamento vascular, independentemente do fundo genético dos ratinhos estudados (Figura 4 e 5). No entanto, o relaxamento dependente do endotélio foi mais marcadamente prejudicada em sGCα 1 - / - ratos no fundo S6 que em sGCα 1 - / - ratos no fundo B6 (Figura 5) 10. Juntos, estes resultados sugerem que a diminuição da sensibilidade da vasculatura ao relaxamento dependente do endotélio pode contribuir para a hipertensão específica de estirpe em GCs & alf; uma 1 - / - murganhos.
Figura 1. Esquema representando as várias partes da pressão myograph câmara (DMT). Inset mostra um navio montado em cânulas na câmara. Clique aqui para ver a figura maior .
Figura 2. Imagens representativas, capturadas durante a gravação de vídeo, de 2 ª ordem do mouse artéria mesentérica em (A) e basal (B) constrição fenilefrina induzida. O diâmetro externo e luz do vaso são delineadas por linhas verde e vermelho, respectivamente. Os traços nos painéis da direita representam a intensidade do sinal, medida no area definida pela caixa azul nas imagens à esquerda, para o diâmetro externo (setas verdes) e diâmetro do lúmen (setas vermelhas).
Figura 3. A disfunção endotelial em ratinhos alimentados com a dieta rica em gorduras durante 8 semanas não foi aparente em anéis da aorta. Função endotelial foi medida pela resposta de relaxamento vascular induzida por acetilcolina (10 -9 a 10 -5 M) fenilefrina (10 -5 M) pré -contratado anéis de aorta. Dieta padrão, ratinhos de tipo selvagem alimentados com uma dieta padrão (n = 8); dieta alta em gordura, de tipo selvagem ratinhos alimentados com uma dieta rica em gordura durante 4-6 semanas (n = 13).
Figura 4. Representante traçados originais de uma curva dose-resposta da acetilcolina sobre fenilefrina proconstricted 2 ª ordem mesenteric artérias isoladas de um WTB6 (A) e um sGCα 1 -/-S6 rato (B). setas representam adição de doses cumulativas crescentes de acetilcolina (10 -9 a 10 -5 M). O eixo X representa o tempo (em segundos), o eixo Y representa o diâmetro do lúmen (em m). Clique aqui para ver a figura maior .
Figura 5. A hipertensão específica de tensão em sGCα 1 - / - ratos está associada com maior comprometimento da reatividade vascular em sGCα 1 -/-S6 ratos do que em sGCα um -/-B6 camundongos A capacidade de acetilcolina (10 -9 a 10 -5. ) para induzir o relaxamento é quantificada em p fenilefrinarecontracted (10 -5 M) artérias mesentéricas de tipo selvagem (WT, símbolos fechados, em linha cheia) e sGCα um macho - / - (symbnols abertas, linha tracejada) ratos na B6 (círculos) ou S6 (quadrados) de fundo genético . Relaxamento vascular induzido por acetilcolina é prejudicada em maior medida em sGCα 1 -/-S6 que em sGCα um -/-B6 camundongos. N = 3,5,3 e 6 para 1 sGCα -/-S6, sGCα 1 -/-B6, WTS6, respectivamente. † * P <0,05 vs sGCα um -/-B6, P <0.05 vs sGCα 1 - / - do mesmo fundo genético. Buys adaptados forma, et al. (2012).
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Discussion
Camundongos são o modelo experimental de escolha para muitos pesquisadores, em parte por causa da possibilidade de introduzir modificações genéticas, gerando modelos de mouse para fisiopatologia humana. O estado vasoativas de pequena resistência, mas não dos vasos maiores conduíte define em grande parte a regulação do fluxo de sangue em todo o sistema vascular 11. O tamanho das artérias de resistência em animais pequenos, tais como ratos, previne a utilização de um fio myograph para estudar a função microvascular. Myographs pressão não só superar esta limitação, mas também para permitir a medição da função vascular sob condições fisiológicas próximos.
Nós relatamos anteriormente que ratos machos deficientes em sGCα 1 são hipertensos quando em um (S6) Fundo 129S6 (sGCα 1 -/-S6) 5, mas não quando em um (B6) fundo C57BL / 6 (sGCα 1 -/-B6) 4. Nossa hipótese é que este sdisparidade trem relacionada com a pressão arterial é devido às diferenças na reatividade vascular entre sGCα 1 - / - ratos nas B6 e S6 origens. Usando um myograph pressão, estudamos as respostas relaxamento dependente do endotélio em 3 ª ordem artérias mesentéricas. A acetilcolina é um agonista do receptor muscarínico, que se liga ao seu receptor no endotélio para activar óxido nítrico sintase endotelial (eNOS) por meio de aumento intracelular de Ca 2 + de concentração. NÃO pode, posteriormente ativar sGC na camada de células do músculo liso subjacente para induzir o relaxamento.
Usando Miografia pressão para comparar a capacidade de NO endotelial derivado de artérias mesentéricas vasorelax isoladas de WT e sGCα 1 - / - murganhos no fundo S6 e B6, identificou diferenças de reactividade vascular entre sGCα 1 - / - ratos B6 e no S6 Fundos 10. sGCα 1 -foi associado com deficiência de relaxamento dependente do endotélio deficiente em ambos os ratinhos B6 e S6. No entanto, esta redução do valor foi maior em sGCα 1 -/-S6 que em sGCα um -/-B6 ratinhos. A diminuição da capacidade para induzir a relaxação de vasos de acetilcolina em murganhos S6 provavelmente contribui para o aumento da pressão arterial observada em sGCα um -/-S6 ratos, mas não no sGCα um -/-B6 ratinhos. Embora a pressão arterial elevada é muitas vezes atribuída a anomalias renais 12, estes resultados reforçam a hipótese emergente que anormalidades primárias do tônus do músculo liso vascular, por exemplo, como associados com deficiência NO-cGMP sinalização 10,13, pode contribuir diretamente para o desenvolvimento de hipertensão arterial sistêmica 14.
Em conclusão, a técnica myograph pressão é uma ferramenta muito poderosa nas mãos do fisiologista vascular ou farmacologista e pode be usadas para analisar a função de micro vasos. Nosso estudo demonstra a aplicabilidade da Miografia pressão na detecção de anomalias vasculares subjacentes em um modelo de hipertensão arterial sistêmica.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer as Dras. Paul Huang e Dmitriy Atochin para uso de DMT pressão myograph e as Dras. Binglan Yu e Chong Lei para a prestação de ratos alimentados com dieta rica em gordura ou dieta padrão.
Fonte de financiamento
Este trabalho foi apoiado pelo cientista Desenvolvimento Grant 10SDG2610313 da American Heart Association (a ES Buys) e um Miles Shore 50 programa Fellowship Anniversary Eleanor e for Scholars em Medicina pela Harvard Medical School (a ES Buys).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358 | |
| CaCl2 (2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M65-500 | |
| KH2PO4 | Sigma | P3786 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318 | |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP121 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Phenylephrine | Acros Organics | AC20724 | |
| Acetylcholine | Sigma | A6625 | |
| Pressure Myograph System | DMT |
References
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