Summary
ここでは、ドーパミン作動性に（DA）ニューロンの年齢依存性神経変性を研究するために設立されている2つのアッセイを記述する
Abstract
キイロショウジョウバエは、神経系の老化と病的変性過程を研究するための貴重なモデル生物である。実験系としてのハエの利点はその遺伝扱いやす、短寿命と複雑な行動を観察し、定量的に分析するための可能性を含む。 ショウジョウバエの脳の特定の神経集団における疾患にリンクされた遺伝子の発現は、例えば、パーキンソン病およびアルツハイマー5、ヒト神経変性疾患をモデル化するために使用することができる。
ドーパミン作動性（DA）ニューロンは、高齢化、人間の脳の中で最も脆弱な神経細胞集団の一つである。パーキンソン病では（PD）、最も一般的な神経変性運動障害は、DAニューロンの加速された損失は運動機能が徐々にかつ不可逆的な衰退につながる。年齢および環境毒素への曝露に加えて、DAニューロンの損失を符号化における特定の突然変異によって悪化するいくつかの遺伝子のまたはプロモーター領域。そのようなPD関連対立遺伝子の同定は、in vivoでの DAニューロンの神経変性を研究するためのモデルとしてのショウジョウバエの使用のための実験的な基礎を提供しています。例えば、 ショウジョウバエ DAニューロンの反復するヒトの疾患のいくつかの機能、DAニューロンの例えば進行性消失と減少し運動機能2におけるPD-リンクヒトα-シヌクレイン遺伝子の発現。したがって、このモデルは正常PD 20.32潜在的な治療標的を同定するために使用されている。
ここでは、一般的にショウジョウバエのDAニューロンの年齢依存性神経変性を研究するために使用されている2つのアッセイを説明：大人になって脳の驚愕誘発される負の走地性応答およびチロシン水酸化酵素の免疫染色に基づいて登山 アッセイは、DAニューロンの数を監視するためにマウント異なる年齢で。どちらの場合も、UAS、tのインビボ発現具体的にはDAのニューロンにおけるransgenesは、チロシンヒドロキシラーゼ（TH）プロモーター-Gal4のドライバ線3、10を使用することによって達成することができる。
Introduction
ここに記載されるアッセイの特異性は、ドーパミン作動性ニューロン3における特異的発現を達成するために、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子の調節配列を利用したGal4フライラインの使用に依存している。チロシンヒドロキシラーゼは、ドーパミン合成の最初と律速段階を触媒する。ドーパミンのそれと成人のハエの脳の重なりでTH免疫反応性は、（実施例6を参照）、in vivoで DAニューロンを同定するために良い候補TH作る。また、THGal4の発現パターンは、ドーパ脱炭酸酵素遺伝子から調節配列が含まれており、DAニューロンだけでなく、トランスジェニック発現を駆動するようDdcGal4など他Gal4のラインのそれよりもより具体的であるだけでなく、3グリア細胞のセロトニン作動性ニューロンのサブセットで。
Feanyとベンダー（2000）最初のPD-リンクヒトα-シヌクレイン遺伝子の汎神経表現は、STAの漸進的損失を加速することが観察さショウジョウバエのRTLE誘発性陰性走地性の動作が。我々はexpressionofα-シヌクレイン導入遺伝子10を駆動するためにDA-ニューロン特異THGal4ラインを使用して同様の結果を観察し、この中でNrf2の経路の神経保護の役割を研究するために、この機能の読み出しに使用されているPD 14のショウジョウバエモデル。ここで説明する特定のアッセイは、2および3から適合される。
ショウジョウバエの脳は、共焦点顕微鏡で脳全体のマウントに可視化することができる、少なくとも5つの異なるクラスタ（PPL1、PPL2、PAL、PPM1 / 2、PPM3）（実施例11と7を参照）に配置された100以上のDAニューロンが含まれています。それは11、9歳とショウジョウバエ脳の下落でDAニューロンの数かどうかはまだ議論の余地があるが、年齢依存性神経変性は、PD-リンクされた遺伝子がヒトの疾患をモデル化するために変異/過剰発現されたハエで観察される5。 DAのニューロンにおけるヒトα-シヌクレインの発現は、そのような効果を有し、したがって、PDのモデルとして用いられている。ここでは、DAニューロンが細胞マーカーとしてTHを使用してマウントし、脳全体でカウントするためのアッセイを記述します。このアッセイは、13と10から適応されています。
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Protocol
1。驚愕誘発される負の走地性アッセイ
- 希望の遺伝子型のハエを選択し、それらは、20〜30の動物のコホート内のグループにランダムに、性によって、それらを分離し、2〜3日ごとに新しい食品バイアルにそれらを反転;テストハエの各セット（ つまり、年齢をマッチさせたコホート、1コホート/遺伝子型）は、少なくとも週に一回。
- 負の走地性試験前の30分には、CO 2でハエを麻酔し、2つの空の食品バイアル（ 材料表を参照）（チャンバー寸法明確なテープとの開口部で結合で作られた前標識透明なプラスチックチューブにそれらを配置さ：19センチメートル×2.85センチメートル）。我々のアッセイでは、一般的に25ハエ/真空管を使用しています。
注意してください。回復時間を麻酔からは、数分から数時間まで変えることができる（ 例えば、O / N）および試験特定の遺伝子のために最適化されるべきである。 - 垂直surfacの上に吸い取り紙やテープ紙に高さが異なる。（1 - 20件目をCMから）マーク電子、ベンチに垂直。
- 紙の前にチューブを置きますチューブはすべて整列さと限り正確高さ測定を可能にするために紙にできるだけ近くにする必要があります。
- チューブの前に（ "特別装備"の表を参照）は、デジタルカメラを置き、紙20〜30センチメートルの距離で、スタンド（ピペットチップボックスなど ）に、 "映画"オプションを選択して開始録音が、この時点で、あなたはまた、連続した試験の間の時間を追跡するためにタイマーを開始する必要があります。
- ハエは数秒（ 例えば 10秒）のためにチューブをタップしてチューブの底に集めることができます。このステップは、実験全体を通して（ つまり 、同じ時間、同じ強さ、同じ演算子）一貫して実行する必要があります。
- 10秒のためのデジタルカメラでハエの動きを記録します。
- 1分間隔で、ステップ1.5から1.7まで14回繰り返します。
- データを分析する：
- を超えているハエの数を数える撮影した動画の目視検査により、10秒後、2センチマーク。
注：私達のアッセイ条件でハエ'負の走地性の動作は驚くべき後の最初の10秒を超えて続かなかった（ つまり、ハエは、それらの後に驚くべきすべての方向に10秒を動かし始めた）。最小距離2 cmであったこの時間ウィンドウ内の制御ハエ（THGal4ドライバを表現すなわち 1週齢のハエ、 図1の凡例を参照）となりました。したがって、私たちは行動を開始した後、異なる年齢や遺伝子型10秒のハエの登山活動を分析するための基準として2センチメートルマークを使用していました。これらのパラメータは、（異なる遺伝的背景や実験条件に例えばのため）テストハエの動作の違いを説明するために調整が必要な場合があります。我々のアッセイ条件では、すべての遺伝子型が悪く行ったり、同様に制御遺伝子型のハエにテストされていることに注意してください。 - 15からの結果の平均を取る試験。
- チューブ内のハエの総数（=％が活動を登る）の割合としてエクスプレス平均、繰り返し数（N）は、各遺伝子型についてテスト独立コホートの数で与えられる
- 時間の経過とともに異なる遺伝子型間の統計的有意性を評価する。これは、スチューデントのt検定 （2遺伝子型を比較する場合）、またはそのようなグラフパッド（グラフパッドソフトウェア、Inc.Laホヤなどの商用ソフトを使ってボンフェローニ事後検定（多重比較を行うとき）に続いて2ウェイANOVA分析を行うことができますCA、USA）。
- を超えているハエの数を数える撮影した動画の目視検査により、10秒後、2センチマーク。
注意
私たちは、室温で、同じ光条件下で、一日の同じ時刻にすべての私たちのアッセイを行う。 12時間の明/暗サイクル環境でハエを保つことはハエ '歩行行動に概日リズムの影響を制御することをお勧めします。
2。チロシン水酸化酵素の免疫全脳マウントの検定
ソリューションおよびバッファ
固定液：リン酸4％パラホルムアルデヒド（PFA）は、緩衝生理食塩水（PBS）
洗浄バッファー：0.1％トリトンX-100 PBS中
ブロッキング緩衝液：0.1 Mトリス-HCl、pH7.5で、0.15MのNaCl、0.1％トリトンX-100、0.5％BSA
マウントメディア：MOWIOL-ダブコ（ハーロウE、レーンD.、抗体 - 実験室マニュアル、コールド·スプリング·ハーバー研究所プレス、コールド·スプリング·ハーバー、NY、アメリカ、10:418（1988で説明されたプロトコルを参照））
手順
- キューティクルワックスを除去するため、約1分間、70％EtOHでいっぱい解剖皿にハエを入れて。
- 転送は氷冷PBSでいっぱい別の解剖皿に飛ぶ。
- 脳を解剖：
- （：削除翼と脚オプション）腹側を上にしてフライを置きます。
- 離れて身体から頭を引っ張っ：鉗子への1セットを使用身体と脳の損傷を防ぐために、目の下キューティクルを保持するために別のものにしがみつく
- 口先を取り外します。
- スリットの反対側に頭のキューティクルにしがみつく口吻を除去した後、開いたままにし、脳が頭部カプセルから削除されるまで反対方向に引っ張る。
- 脳からすべてのキューティクルを削除します。
- すべての空気で満たされた気管組織を除去するが、これは次のインキュベーションステップ中に浮遊するから脳を防ぐことができます。
- P-200ピペットチップの先端から数ミリをカットし、0.1％トリトンX-100/PBSソリューションとそれを平衡
- 準備されたP-200ピペットチップを使用して、4％PFA / PBSを0.5mlで満たさ0.5ミリリットルエッペンドルフチューブに脳を転送し、解剖が完了するまで氷上に保つ。
- 20分間室温で頭脳を修正：ラックにエッペンドルフチューブを入れてnutatorにラックを配置することによって、穏やかに回転を適用します。
- 固定液を削除P-1000マイクロピペットを用いて、0.1％トリトンX-100/PBS 0.5 mlを加える反転によってミックスと1分間インキュベートさせ、一度この洗浄工程を繰り返します。
- 第二の洗浄からバッファを削除し、0.1％トリトンX-100/PBSを0.5mlを加え、20分間室温でインキュベートしてみましょう、このステップを二回繰り返す。
- 洗浄緩衝液を取り出し、脳はRTで1時間（0.1Mトリス-HCl、pH7.5で、0.15MのNaCl、0.1％トリトンX-100、0.5％BSA）ブロッキングバッファーでインキュベートすることができます。
- 4で、二日間、ブロッキング溶液に抗TH抗体の1:100希釈（ "特定の試薬の表"を参照）で脳をインキュベート穏やかに回転し（ステップ2.6を参照してください。）とC、。
- 洗浄手順2.7を繰り返します。と2.8 ..
- 穏やかな回転と、4℃で、二日間、二次antibodyinブロッキング溶液の1:200希釈で脳を平衡化します。
- 洗浄手順2.7を繰り返します。と2.8 ..
- 図2Aに示すように、マウントスライドを準備します。
- ADD 2カバーガラス（24×60ミリメートル、ない。1.5）への取り付け、メディアのX25μlの滴。
- スライドの真ん中に隙間を残して取り付けメディアの上に置いて2つのカバーガラス（サイズ18×18ミリメートル、ない。2）、乾燥させます。
- 洗浄バッファーを外し、マウントメディアを50μlを加え、脳が上下にピペッティングすることにより、それに平衡化することができます。
- カットP-200ピペットチップ（ステップ2.4を参照）2カバーガラスの間の空間にスライドに脳を転送しないカバースリップでそれらをカバーを使用した。 1.5（ 図2Aを参照してください。向きにスライド上の脳は7を参照）。
注：サンプルは、前方および局留め両方の視覚化を可能にする2つのカバーガラスとの間に取り付けられている脳のrior側。 - マウントメディアとカバーガラスの間に空間全体を埋め、すべての空気を除去するための一つの角からピペット;マニキュアを乾燥したシールができます。
- 共焦点顕微鏡を用いて1.0μmのステップサイズ（ ショウジョウバエ成体脳内のドーパミン作動性クラスターの解剖識別のための7を参照）、z軸に沿って光のセクションのシリーズを取得し、特定のクラスタ内のドーパミン作動性ニューロンの数を評価する。
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Representative Results
我々は、PD 14のショウジョウバエモデルにおけるストレス保護Nrf2の経路の役割を研究するためにここに記載のアッセイを使用している。このモデルは、TH Gal4のドライバ2,10を用いてDAのニューロンにおけるヒトα-シヌクレイン遺伝子の発現に依存する。
図1は TH Gal4のドライバの制御下に別の導入遺伝子を発現しているオスのハエに驚愕誘発性の負の走地性（クライミング）アッセイの代表的な結果を示している。すべての遺伝子型は、時間の経過とともに自発運動の低下を示すテストしたが、PD-リンク表現、ヒトα-シヌクレイン導入遺伝子は、年齢をマッチさせた対照ハエ（単独のTH Gal4のドライバ）に対して加速衰退を示すか、または共発現飛ぶ飛ぶNrf2のDNA結合パートナーMafを-S。同様の結果は、雌ハエで観察された。
図2は TH免疫蛍光ベースのDAのための代表的結果を示しニューロン数。図の凡例に記載されているように4週齢の雄ハエから脳のPPL1ニューロンの数で異なる遺伝的背景の影響が定量化される。 α-シヌクレインを発現しているハエの脳のPPL1ニューロンの小さいが重大な損失に注意してください。
図1。指示された遺伝子型のの驚愕誘発性陰性の走地性アッセイ。コホート年齢をマッチさせたハエは、一週間の間隔で自発運動について試験した。クライミング活性をバイアルをタップし、バイアルに含まれるハエの総数の百分率としてこの値を発現した後に2センチメートルマーク10秒間上記ハエの数をカウントすることによって計算した。データは、平均値±20〜30ハエの5つの独立したコホートのSEMを示す。有意性は、ボンフェローニ事後検定（P <0.05）との双方向のANOVAにより評価した。違いTHとの間で、テストした他の三つの遺伝子型のα-Synfliesやハエは4と5週目に有意であった。
図2。 TH免疫蛍光によるDAのニューロンの検出および計数。A.フロー図は、脳のスライドを調製するためのプロトコルを示す。各ステップの詳細についてはテキストを参照してください。全脳マウントのB.描写顕微鏡写真（右hemibrain、後部ビュー）THのために免疫染色。共焦点Zシリーズ画像のセット（1,024×1,024の形式でライカSP2共焦点顕微鏡、40X油目標（N / 1.25）、フレーム平均2、ステップサイズが1μm、で取得し、最大投影としてコンパイルされました）を示す。 PPL1 DAニューロンのクラスターの位置が強調表示されます。C.代表RESUはDAニューロンのためのLTSはTH免疫染色を用いて得られたカウント。 PPL1クラスタ内のニューロンの数は、各焦点のzシリーズ。のN個々の画像を検査することによって評価した各遺伝子型について分析独立したサンプル数を表す。データは平均±SEMでの意義は、スチューデントのt検定（* P <0.05）で評価した。 より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。
遺伝子型： 'CON'、THGal4 / +; THGal4 / +; 'UAS-Synの'、THGal4、UAS
-αSynuclein/ +; THGal4、UAS-αSynuclein/ +; 'UAS-Mafを-S'、THGal4/UASMaf-S; THGal4 / +; 'UAS-αSYN / UAS-Mafを-S'、THGal4、UAS-αSynuclein/ UASMaf-S; THGal4、UAS-αSynuclein/ +; 'KEAP1 EY5'、THGal4 / +; THGal4/keap1 EY5; 'UAS-αSyn/keap1 EY5'、THGal4、UAS-αSynuclein/ +; THGal4、UAS-αSynuclein/keap1EY5。
[バローネらから再生。2011） "疾患モデルとメカニズム"の"オープン·アクセス"政策と一致]
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Discussion
アッセイは、経路または異なる疾患連動型遺伝的背景（5件）で同様に高齢化でDAニューロンの維持に小さな化合シグナリング、特定の遺伝子の役割を研究するための有用なアプローチを提供し、ここで説明。
ショウジョウバエの驚愕誘発される負の走地性の動作が広く、特にPD連動型変異の存在下で異なる遺伝的背景におけるDAニューロンの機能のための読み出し機能として使用されてきた。異なる研究間でいくつかの不一致は（より詳細な議論のために12を参照）が観察されている。これらは、各チューブでテストハエ数（ハエ'コホート対シングルフライ）を含むさまざまなアッセイセットアップ条件、に少なくとも部分的にCO 2媒介麻酔と連続した数の後の回復の時間が起因している臨床試験（ジの例として4と11を参照fferentアッセイセットアップ）。したがって、このようなパラメータをコントロールすることをお勧めし、必要であれば特定のアッセイの要件のためにそれらを最適化することがあります。
TH免疫染色/共焦点顕微鏡によるDAのニューロンの定量はTHGal4駆動型GFPの発現およびGFP蛍光/共焦点顕微鏡によるDAのニューロンの識別に基づく方法と同じ意味で使用されている。 2つの方法はほとんどの場合、同等の結果を得、それはDAニューロンの機能状態に敏感であるのでしかし、一般的には、TH免疫染色技術は私達と他の研究者によって好まれる。より詳細な比較については11と10を参照してください。このアッセイは、フライのヘッドホモジネート中のドーパミンのレベルが[例として1を参照]測定によって補完することができます。
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Disclosures
我々は我々は競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
我々は有用な議論のための技術支援とGerasimos P. Sykiotisためクリスティンソマーズ、フライ銘柄に対してレオPallanckに感謝します。この作品は、MCBにNIH訓練助成T32CA009363によって賄われていた
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rabbit anti-tyrosine hydroxylase antibody | Millipore | AB152 | |
| Donkey TRITC-labeled anti rabbit IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-026-152 | |
| Mowiol | Calbiochem | 475904 | |
| DABCO | Sigma | D2522 | |
| Equipment | |||
| Polystyrene vials | VWR | 89092-734 | 28.5 x 95 mm |
| Digital camera | Canon | PowerShot A3100IS (model) | 12.1 Megapixels 4X Optical Zoom |
| Glass coverslips no. 1.5 | VWR | 48366 205 48393 252 | Sizes: 18 x 18 mm, 24 x 60 mm |
| Glass coverslips no. 2 | VWR | 48368-040 | Size: 18 x 18 mm |
| Dissection dishes | Electron Microscopy Sciences | 70543-01 | Size: 30 mm O.D. |
| Dumostar No. 5 tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72705-01 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 (model) | |
| Confocal microscope | Leica | SP2 or SP5 (model) | |
Materials Table. |
|||
References
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