Summary
paramagnetic गुण की hemozoin की देर चरणों को अलग करने के लिए उपयोग किया जाता है
Abstract
पी. अन्य प्लाज्मोडियम प्रजातियों के विपरीत, फाल्सीपेरम प्रयोगशाला है, जो अपने अध्ययन की सुविधा 1 में संवर्धित किया जा सकता है. जबकि हासिल पेरासाइटिमिया ≈ 40% सीमा तक पहुँच सकते हैं, अन्वेषक आमतौर पर लगभग 10% से कम प्रतिशत रहता है. कई मामलों में यह परजीवी युक्त असंक्रमित लोगों से लाल रक्त कोशिकाओं (RBCs) को अलग करने के लिए संस्कृति को समृद्ध और एक भी प्रयोग के साथ आगे बढ़ना करने के लिए आवश्यक है.
जब पी. फाल्सीपेरम एरिथ्रोसाइट को संक्रमित करता है, परजीवी degrades और हीमोग्लोबिन 2, 3 से खिलाती है. हालांकि, परजीवी एक बहुत ही विषाक्त लौह युक्त haem 4 आधा भाग, 5 के साथ सौदा होगा. परजीवी एक आभ्यांतरिक क्रिस्टल 6 haemozoin, 7 बुलाया बहुलक में haem बदलने के द्वारा इसकी विषाक्तता eludes. यह लौह युक्त अणु अपने भोजन रिक्तिका में संग्रहीत किया जाता है और में यह धातु एक oxidative राज्य जो 8 haem में एक से अलग है. haem में लोहे की ferric राज्यozoin यह एक paramagnetic असंक्रमित एरिथ्रोसाइट्स में अनुपस्थित संपत्ति पर प्रदान करता है. के रूप में हमलावर परजीवी परिपक्वता तक पहुँचता है, की सामग्री के haemozoin भी 9 बढ़ जाती है, जो पी. के नवीनतम दौर पर भी अधिक अनुचुंबकत्व bestows एरिथ्रोसाइट अंदर फाल्सीपेरम.
इस paramagnetic संपत्ति, पी. के नवीनतम दौर के आधार पर फाल्सीपेरम संक्रमित लाल रक्त कोशिकाओं को एक चुंबकीय मोतियों से युक्त स्तंभ के माध्यम से संस्कृति गुजर द्वारा अलग किया जा सकता है. इन मोतियों चुंबकीय बन जाते हैं जब उन्हें युक्त स्तंभ एक चुंबक धारक पर रखा जाता है. संक्रमित लाल रक्त कोशिकाओं, के कारण उनके अनुचुंबकत्व, तो स्तंभ के अंदर फंस जाएगा, जबकि प्रवाह के माध्यम से शामिल होंगे सबसे अधिक हिस्सा है, असंक्रमित एरिथ्रोसाइट्स और परजीवी की उन युक्त प्रारंभिक दौर के लिए,.
यहाँ, हम चुंबकीय कॉलम, है जो अच्छा परजीवी व्यवहार्यता 10 का कहना है के साथ देर से मंच परजीवी की आबादी को समृद्ध करने की पद्धति का वर्णन.इस प्रक्रिया के प्रदर्शन के बाद, स्वाधीन संस्कृति एक मशीन को लौट जा सकता है शेष परजीवी बढ़ जारी रखने के लिए अनुमति देते हैं.
Protocol
प्रोटोकॉल के सभी चरणों, के अलावा centrifugations, एक नमूना बाँझ रखने हुड के अंदर बाहर किया जाना चाहिए.
1. पी. के देर चरण अलगाव फाल्सीपेरम संक्रमित एरिथ्रोसाइट्स
प्लाज्मोडियम संक्रमित एरिथ्रोसाइट्स की सभी देर चरणों इस पद्धति से अलग किया जा सकता है, के बाद से hemozoin, है जो परजीवी पर अनुचुंबकत्व प्रदान जीनस के लिए एक आम metabolite है. संस्कृति में एक उच्च पेरासाइटिमिया (3-10%) इस प्रोटोकॉल के साथ बेहतर पैदावार प्राप्त करने के लिए सिफारिश की है, हालांकि एक विशिष्ट संस्कृति 2-4% हेमाटोक्रिट (लाल रक्त कोशिकाओं की मात्रा प्रतिशत) और 1-8% पेरासाइटिमिया (संक्रमित का प्रतिशत शामिल होंगे लाल रक्त कोशिकाओं). परजीवियों Trager और 1 Jansen द्वारा वर्णित के रूप में संवर्धित किया जा सकता है.
- एक साधारण, बहु हिस्सा सेटअप हर schizont अलगाव प्रक्रिया के लिए इकट्ठा किया जाना चाहिए. इस के लिए, लोकसभा कॉलम, एक चुंबकीय MidiMACS विभाजक और Miltenyi बायोटेक से एक एमएसीएस MultiStand (1 चित्रा
- एक अलग ट्यूब (भर में 50 मिलीलीटर conicals का उपयोग), 1640 RPMI के 23.2 मिलीग्राम और 7.5% सोडियम बिकारबोनिट का काम समाधान बनाने 750 μl मिश्रण. Discarding के लिए हाथ पर अतिरिक्त ट्यूब और प्रवाह के माध्यम से परजीवी संस्कृति के इकट्ठा.
- स्तंभ काम समाधान के 3 मिलीलीटर जोड़ें यह संतुलन में लाना है, और के माध्यम से एक ट्यूब में प्रवाह त्यागें.
- पी. के 8 मिलीग्राम जोड़ें फाल्सीपेरम स्तंभ के लिए संस्कृति, यकीन है कि जैसे ही काम के समाधान के पिछले भाग के रूप में संस्कृति से स्तंभ की किया गया है बाहर धक्का दे दिया, प्राप्त ट्यूब इकट्ठा अनबाउंड संस्कृति की वसूली शुरू एक द्वारा प्रतिस्थापित किया गया है. यह संस्कृति किसी भी आगे गिराए से बचने के लिए आवश्यक है.
- एक बार कॉलम के माध्यम से संस्कृति का प्रवाह बंद हो गया है, काम के समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ने के लिए शेष लाल रक्त कोशिकाओं स्तंभ से बाहर धक्का.
- कदम धुलाई: स्तंभ काम समाधान के एक और 3 मिलीलीटर जोड़ें और "त्यागने" ट्यूब में तरल बह इकट्ठा करने में किया जा रहा है अन्य ट्यूब में प्रवाह के माध्यम से संस्कृति के रूप में सहेजा गिराए से बचने के लिए.
- क्षालन: एक बार 3 मिलीलीटर कॉलम के माध्यम से पारित किया है, स्टैंड से बाद अलग और यह एक 15 मिलीलीटर ट्यूब के शीर्ष पर जगह है.
- फिर, स्तंभ काम समाधान के 3 मिलीलीटर जोड़ने. यह कदम देर मंच परजीवी कि स्तंभ की माला में फंस गए थे के साथ संक्रमित एरिथ्रोसाइट्स elutes.
नोट: इस बिंदु पर, और परजीवी की राशि की आवश्यकता पर निर्भर करता है, दूसरे / संग्रह का दौर है, स्पष्ट रूप से मूल संस्कृति में पेरासाइटिमिया की सीमा के अधीन शुरू करते हैं. स्तंभ के रूप में लंबे समय reused किया जा सकता है प्रवाह के रूप में एक स्थिर स्थिति बरकरार रखता है.
- एकत्र परजीवी की एकाग्रता: 15 मिलीलीटर कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 150 XG प्रोद्धावन में प्रयोग किया जाने वाला घोलक युक्त ट्यूब अपकेंद्रित्रएक अंधेरे गोली parasitized एरिथ्रोसाइट्स से फार्म.
- तरल पर्याप्त छोड़ने के लिए एक बहुत छोटा सा नमूना लेने के लिए और एकाग्रता और माइक्रोस्कोपी के माध्यम से कुल उपज का निर्धारण (2 नीचे चरण देखें) तैरनेवाला निकालें.
- इस समय, अगर और देर से मंच परजीवी के अलगाव पर कब्जा संतोषजनक ढंग से पूरा किया है, एकत्र संस्कृति फिर ताजा मीडिया के साथ सेते हैं.
- बाद के प्रयोगों के लिए आवश्यक मात्रा और समाधान में एकत्र परजीवी पतला.
2. पवित्रता और यील्ड विश्लेषण
- परजीवी एक hemocytometer का उपयोग कर और प्रकाश खुर्दबीन के नीचे गिनती के द्वारा प्राप्त की एकाग्रता सत्यापित करें. गिनती करने के लिए, hemocytometer के कवर पर्ची तहत एकत्र परजीवी और मीडिया के मिश्रण के 10 μl जोड़ें. चार quadrants में की hemocytometer परजीवी की संख्या की गणना और 4 से कुल संख्या विभाजित. 4 10 द्वारा संक्रमित ई की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए है कि संख्या को गुणामिलीलीटर प्रति rythrocytes.
नोट्स:) मिश्रण की एकाग्रता गोली resuspending के पल में उपयोगकर्ता द्वारा फैसला किया जाएगा अधिक या कम मध्यम जोड़कर,. एक सुझाव काम एकाग्रता 5.5 एक्स 10 μl के प्रति 4 schizontes (यह आमतौर पर एकत्र परजीवी 100-300 μl जोड़कर हासिल की है) है. यदि इस एकाग्रता की 20 μl 100 मीडिया और एरिथ्रोसाइट्स, एक ठेठ 4% hematocrit संस्कृति के बारे में 1% की एक पेरासाइटिमिया के μl मिश्रण की एक अंतिम मात्रा करने के लिए जोड़ा है प्राप्त किया जाएगा. ख) के तहत hemocytometer गिनती करने के लिए जल्दी हो सकता है, के बाद से एरिथ्रोसाइट्स कक्ष के अंदर नमूना dries के रूप में lysing शुरू है. संक्रमित एरिथ्रोसाइट्स, जो बहुमत होना चाहिए एक अंधेरे स्थान के अंदर है, जो उन्हें गैर संक्रमित लोगों से अलग दिखाई देगा.
- प्रदर्शन एक पतली परत Giemsa स्लाइड्स को 10% मेथनॉल में बहुत तेजी से, फिक्सिंग उन्हें सुखाने, और टी डुबो द्वारा संग्रह की पवित्रता का आकलन करने में दागGiemsa की एक 20% समाधान में हेम आसुत जल से पतला दाग. 10 मिनट, जिसके बाद वे हवा से सूख जा सकता है और खुर्दबीन के तहत जांच के लिए स्लाइड दाग. 70% से ऊपर अच्छी तरह से एक पेरासाइटिमिया प्राप्त होना चाहिए.
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Representative Results
चित्रा 2 में है, चुंबकीय कॉलम के माध्यम से गुजर संस्कृति दिखाया है, पहले (ए) और (बी) की प्रक्रिया के बाद. आमतौर पर एक से दो संक्रमित एरिथ्रोसाइट्स एक 100X बढ़ाई क्षेत्र पर देखा जाता है के रूप में चित्रा 2 में दिखाया तीर चित्रा 2A में संक्रमित एरिथ्रोसाइट्स की ओर इशारा करते हुए के साथ,. एक ठेठ प्रक्रिया में, 5% पेरासाइटिमिया (2A चित्रा) में एक संस्कृति के साथ शुरू, इस प्रक्रिया का प्रदर्शन आम तौर पर 97% -100% (चित्रा 2B) के एक पेरासाइटिमिया के साथ एरिथ्रोसाइट्स पैदा करता है. पेरासाइटिमिया के 20X के आदेश पर संवर्धन आसानी से प्राप्त किया है, और कॉलम के माध्यम से संस्कृति के कई गुजरता पी. की एक उच्च उपज प्राप्त कर सकते हैं फाल्सीपेरम देर चरण संक्रमित एरिथ्रोसाइट्स, के रूप में की जरूरत है या इच्छित.
चित्रा 1.
चित्रा 2. ) एक ठेठ 5% संवर्धन पहले परजीवी सामग्री unsynchronized. 1 इस चुंबकीय प्रक्रिया के माध्यम से एकत्र परजीवी के μl नमूना Giemsa सना हुआ था और 100X बढ़ाई देखा. एक से तीन संक्रमित एरिथ्रोसाइट्स दायरे से किसी भी क्षेत्र (तीर के साथ चिह्नित)). बी संवर्धन के बाद परजीवी सामग्री में आमतौर पर देखा जाता है. एक 1 इस चुंबकीय प्रक्रिया के माध्यम से एकत्र परजीवी के μl नमूना Giemsa सना हुआ है और 100X बढ़ाई देखा. पेरासाइटिमिया अब 99% है.
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Discussion
मलेरिया परजीवी पी. की इन विट्रो संस्कृतियों में फाल्सीपेरम संस्कृति के प्रसार के उच्चतम बिंदु पर असंक्रमित लाल रक्त कोशिकाओं की तुलना में आधे से अधिक के साथ एक सीमित पेरासाइटिमिया प्रदर्शन. सबसे अनुसंधान प्रयोगों के लिए, यह करने के लिए संक्रमित एरिथ्रोसाइट्स साथ ही काम करने के लिए वांछनीय है. यह अंत करने के लिए, एक अलग तकनीक संक्रमण के अनुसार संस्कृति में विभाजित करने के लिए आवश्यक है. उपयोगी विधियों streptolysin हे का उपयोग करने के लिए permeabilize और uninfected 11 RBCs और अंतर centrifugations विविधताओं जो दो समूहों के विभिन्न घनत्व का लाभ लेने के एक श्रृंखला lyze शामिल हैं. इन तरीकों में से कुछ जेलाटीन प्लवनशीलता 12 और 13 Plasmion का उपयोग करें, लेकिन सबसे आम विभिन्न घनत्व की परत बनाने के लिए विभिन्न लाल रक्त कोशिकाओं जाल घनत्व ढाल मध्यम Percoll है, जो 14 परजीवी कुछ विषाक्तता उपस्थित हो सकता है इस्तेमाल किया पदार्थ शामिल हैं.
हम हाएक 1 पॉल द्वारा वर्णित है और आगे ट्रांग 15, 16, paramagnetic haemozoin, एक निष्क्रिय परजीवी द्वारा हीमोग्लोबिन की पाचन द्वारा उत्पादित क्रिस्टल की संपत्ति के आधार पर विश्लेषण तकनीक का इस्तेमाल किया है. हमारे समूह द्वारा कहीं सूचना दी, इस विधि गैर इनवेसिव है और ऐसा लगता परजीवी है, के रूप में सामान्य से संकेत के बाद उपचार ताजा एरिथ्रोसाइट्स के आक्रमण की क्षमता, के रूप में Percoll द्वारा संवर्धन के अधीन परजीवी के आक्रमण की दर की तुलना में प्रभावित नहीं ढाल centrifugation 10, 14, 17. इस लाभ के लिए इसके अलावा, अगर संस्कृति संक्रमित एरिथ्रोसाइट्स के एक उच्च संख्या है, वहाँ एक से अधिक संग्रह कदम हो सकता है, के बाद स्तंभ के बंधन क्षमता के लिए एक ही बार में सभी परजीवी सामग्री पकड़ के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता. इसलिए, संस्कृति एकत्र कॉलम के माध्यम से पारित किया जा सकता है कई बार जब तक पर्याप्त परजीवी एक दिया बाद में प्रयोग के लिए एकत्र कर रहे हैं.
पी. के संग्रह फाल्सीपेरम पैराचुंबकीय मोतियों के उपयोग के साथ साइटों सरल, तेज है, और केवल अंतर centrifugation तकनीक है कि एक बड़े और महंगा मंजिल अपकेंद्रित्र की जरूरत है और जो भी नमूने की सावधानीपूर्वक निपटने की आवश्यकता के विपरीत एक benchtop अपकेंद्रित्र, की आवश्यकता है.
संस्कृति के संवर्धन के कुछ अनुप्रयोगों के आक्रमण assays जहां शुरू पेरासाइटिमिया सभी नमूनों में कड़ाई से नियंत्रित किया जाता है में परजीवियों का उपयोग कर रहे हैं, एकत्र परजीवियों का उपयोग hemozoin, निष्क्रिय प्लाज्मोडियम परिवार के लिए आम क्रिस्टल निकालने के लिए, एक उच्च घनत्व का उपयोग परजीवी के माइक्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए तैयार करने के लिए, और केवल परजीवी के डीएनए की निकासी जब वे अन्य रक्त कोशिकाओं के साथ मिश्रित कर रहे हैं. यह पिछले आवेदन करने के लिए नैदानिक नमूनों का विश्लेषण करने के लिए आनुवंशिक रूप से मलेरिया के तनाव के साथ वे संक्रमित हैं की पहचान और एक सूचित चिकित्सकीय योजना बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
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Disclosures
हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
इस काम के द्वारा वित्त पोषित किया गया था अनुदान PRB-009 सीएस और नियंत्रण रेखा के लिए एक डॉक्टरेट Secretaria Nacional de Ciencia y (SENACYT) TECNOLOGIA, पनामा से छात्रवृत्ति के लिए.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 Hepes Modified | Sigma-Aldrich | R4130 | Supplemented with 10% human serum, 2% glucose, and 0.2% sodium bicarbonate |
| MidiMACS Separator | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-302 | |
| MACS MultiStand | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-303 | |
| LS Columns | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-401 | |
| Hemacytometer | Grafco | Grafco Neubauer Chamber | Can be found through many other suppliers |
References
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