Summary
Hemozoin bir paramanyetik özelliklerinin geç aşamalarında izole etmek için kullanılırlar
Abstract
Diğer Plasmodium türlerin aksine, P. falciparum onun çalışma 1 kolaylaştırır laboratuar, kültüre edilebilir. Elde parazitemi ≈% 40 sınırına ulaşabilir olsa da, araştırmacı genellikle yaklaşık% 10 oranda tutar. Pek çok durumda, kültür zenginleştirmek ve belirli bir deney ile devam etmek için enfekte olmamış olanlardan parazit içeren kırmızı kan hücrelerinin (eritrositler), izole etmek için gereklidir.
Zaman P. falciparum eritrosit bozar, parazit düşürür ve hemoglobin 2, 3 beslenir. Ancak, parazitin bir çok toksik demir içeren haem parçası 4, 5 ile ilgilenmek zorundadır. Parazit haemozoin 6, 7 olarak adlandırılan bir inert kristal polimer içine haem dönüştürerek kendi toksisite eludes. Bu demir içeren moleküller, gıda vakuol içinde depolanır ve bir metal haem 8 biri farklı bir oksidasyon durumuna sahiptir. Haem demir ferrik durumuozoin bu bulaşmamış eritrosit eksik olan paramanyetik özellikte bahşeder. Işgalci parazit olgunluğa ulaşır gibi haemozoin içeriği de P. son aşamalarında daha paramanyetizma ihsan, 9 da artar eritrosit içindeki falciparum.
Bu paramanyetik özelliği, P. son aşamalarında dayanarak falciparum enfekte-kırmızı kan hücreleri manyetik boncuklar ihtiva eden bir sütun içinden geçen kültür tarafından ayrılabilir. Bunları içeren sütunlar bir mıknatıs tutucu üzerine konulduğunda Bu boncuklar manyetik hale gelir. Flow-through içerecektir iken onların paramanyetizma nedeniyle Enfekte RBCs, sonra çoğunlukla, enfekte olmamış eritrosit ve parazit içerenler erken aşamalarında için, sütun içine hapsolmuş edilecektir.
Burada, biz iyi parazit canlılığı 10 korur manyetik sütunlar ile geç evre parazitlerin nüfusu zenginleştirmek için metodoloji açıklanmaktadır.Bu yordamı gerçekleştirdikten sonra, bekâr kültürü kalan parazitler büyümeye devam sağlamak için bir inkübatör iade edilebilir.
Protocol
Protokolünün tüm adımları, centrifugations hariç, örnek steril tutmak için bir başlık içinde yapılmalıdır.
1. P. Geç Evre İzolasyonu falciparum-enfekte Eritrositler
Parazit paramanyetizma bahşeder hemozoin, cins için ortak bir metabolit olduğundan Plasmodium enfekte eritrositlerin tüm evrelerinde, bu metodoloji ile ayrılabilir. Tipik bir kültür% 2-4 hematokrit (kırmızı kan hücrelerinin hacminin yüzdesi) ve% 1-8 parazitemi (enfekte yüzdesi içerecektir ancak kültürde yüksek parazitemi (% 3-10), bu protokol ile daha iyi verim almak için tavsiye edilir kırmızı kan hücreleri). Trager ve Jansen 1 tarafından açıklandığı gibi parazitler yetiştirilebilir.
- Basit, çok parçalı kurulum her schizont izolasyon prosedürü için monte edilmelidir. Bunun için, LS kolonlar, bir manyetik MidiMACS Ayırıcı ve Miltenyi Biotec bir MACS MultiStand (Şekil 1
- Ayrı bir tüp içinde (genelinde 50 ml conicals kullanın), RPMI 1640 23.2 ml ve iş çözümü oluşturmak için% 7.5 sodyum bikarbonat 750 ul karıştırın. Atılması için ise ek borular var ve akan toplama parazit kültür.
- Bunu dengelemek için sütun çalışma çözeltisinin 3 ml ekleyin ve akan bir tüp içine atın.
- P. 8 mL sütun falciparum kültürü, en kısa sürede çalışma çözeltisinin son bölümü olarak kültür ile sütun dışarı itilmiş olan emin, alıcı tüp bağsız kültür iyileşme başlatmak için bir toplama ile değiştirilir. Bu, daha fazla kültür seyreltilmesi önlemek için gereklidir.
- Sütunu boyunca kültür akış bittikten sonra, sütunun geri kalan eritrositler dışarı itmek için çalışma çözeltisinin 1 ml eklemek.
- Adım Yıkama: kolon için çalışma çözeltisi başka bir 3 ml ilave edilir ve diğer tüp içinde akan olarak kaydedilmiş olan kültür seyreltilmesi önlemek için "ıskarta" tüp içine akan sıvı toplamak.
- Elüsyon: 3 ml kolonundan geçirilir sonra, stand ikinci çıkarın ve 15 ml tüp üstüne yerleştirin.
- Yine, sütun için çalışma çözelti 3 ml eklenir. Bu adım sütun boncuk mahsur kalmışlardı geç evre parazit ile enfekte eritrositler elutes.
Not: bu noktada, ve gereken parazitlerin miktarına bağlı olarak, orijinal kültür içinde parazitemi sınırları belli tabi toplama başka yuvarlak / lar, başlar. Akışını istikrarlı bir devlet korur gibi sütun sürece yeniden kullanılabilir.
- Toplanan parazitlerin konsantrasyonu: Oda sıcaklığında 150 x g'de 5 dakika boyunca elüsyon içeren 15 ml'lik santrifüjparazitlenmiş eritrositten karanlık bir pelet oluşturur.
- Çok küçük bir örnek almak ve (aşağıya bakınız adım 2) mikroskopi ile konsantrasyonu ve toplam verim belirlemek için yeterli sıvı bırakarak Süpernatantı.
- Geç evre parazit izolasyonu ve yakalama biçimde gerçekleştirilir, bu noktada, taze medya ile tekrar toplanan kültür inkübe edin.
- Müteakip deneyler için gerekli hacim ve çözelti içinde toplanmış parazit seyreltilir.
2. Saflık ve Verim Analizi
- Hemasitometre kullanarak ve bir ışık mikroskobu altında sayılarak elde edilen parazitlerin konsantrasyonu doğrulayın. Saymak için, hemasitometre bir kapak kayma altında toplanan parazit ve medya karışımı 10 ul ekleyin. Hemasitometre dört kadran parazit sayısını sayın ve 4 ile toplam sayısını bölün. Enfekte e konsantrasyonu elde etmek için 10 4 ile bu sayı çarpmaml başına rythrocytes.
Notlar: karışımı a) konsantrasyon daha fazla veya daha az orta ekleyerek, pelet resuspending yapıldığı andaki kullanıcı tarafından belirlenecektir. Önerilen bir çalışma konsantrasyonu ul başına 5,5 X 10 4 schizontes (bu genellikle toplanan parazitler 100-300 ul ekleyerek elde edilir) 'dir. Bu konsantrasyon 20 ul ortam ve eritrositler, tipik bir% 4 hematokrit kültür içinde yaklaşık% 1 arasında bir parazitemi 100 ul karışım nihai hacmi eklenmiş ise elde edilecektir. b) hemasitometre altında Sayma eritrositler odasının içindeki örnek kurudukça parçalama başından beri, hızlı olmak zorunda. Çoğunluk olmalı Enfekte eritrositler, non-enfekte olanlardan onları ayıran bir karanlık nokta içinde gösterecektir.
- İnce tabaka Giemsa,% 10 metanol içinde çok hızlı bir şekilde slaytlar sabitleme onları kurutma, ve t daldırarak toplama saflığını belirlemek için leke gerçekleştirmeGiemsa bir% 20 çözelti halinde kenar damıtık su ile seyreltilmiştir leke. Onlar hava ile kurutulur ve mikroskop altında incelenebilir sonra 10 dakika için slaytlar Leke. De% 70 üzerinde bir parazitemi ulaşılabilir olmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 2'de, manyetik sütun içinden geçen kültür önce gösterilmiştir (A) ve işlemden sonra (B). Şekil 2A oklar ile enfekte eritrositleri işaret ile, Şekil 2 'de gösterildiği gibi bir veya iki enfekte eritrositler genellikle bir 100X büyütme alan üzerinde görülür. Tipik bir prosedürde asitleştirme,% 5 parazitemi (Şekil 2A) bir kültür ile başlayarak, bu işlemin performansı genellikle% 97 ile% 100 (Şekil 2B) olan bir parazitemi eritrositler üretir. 20X mertebesinde parazitemi zenginleştirilmesi kolaylıkla ulaşılabilir olması, ve kolon boyunca kültür birkaç geçer P., yüksek bir verim elde edebilir falciparum geç evre-enfekte eritrositler, gerektiğinde veya arzu.
Şekil 1.
Şekil 2. A) Tipik% 5 zenginleştirme öncesi parazit içeriği eşitlenmemiş. Bu manyetik prosedürü aracılığıyla toplanan parazitlerin A 1 mikrolitre numune Giemsa lekeli ve 100X büyütmede izlendi. Bir ila üç enfekte eritrositlerin genellikle kapsam Herhangi bir alanda (oklarla işaretli) zenginleştirme sonrası. B) Parazit içeriği görülür. Bu manyetik prosedürü yoluyla toplanan parazitlerin A 1 mikrolitre numune Giemsa lekeli ve 100X büyütmede görülüyor. Parazitemi şimdi% 99'dur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sıtma paraziti P. in vitro kültürlerde falciparum kültürü daha fazla olan en yüksek çoğalma noktada enfekte olmamış kırmızı kan hücrelerinin yarısından, sınırlı parazitemi sergiler. En çok araştırma deneyleri için, enfekte olmuş eritrositler ile birlikte çalışmak için sadece arzu edilir. Bu amaçla, bir ayırma tekniği, enfeksiyon göre kültür bölmek için gereklidir. Yararlı yöntemler enfekte olmamış eritrositler 11 ve iki grupların farklı yoğunluk yararlanmak diferansiyel centrifugations varyasyonları bir dizi geçirgenliği ve lyze için streptolisin O kullanımını içerir. Bu yöntemlerden bazıları jelatin flotasyon 12 ve Plasmion 13 kullanımda ama farklı kırmızı kan hücreleri yakalamak için çeşitli yoğunluklarda katmanları parazitler 14 bazı toksisite sunabilir yoğunluk gradiyenti orta Percoll, bir oluşturmak için kullanılan en yaygın madde içerir.
Biz have birinci Paul tarif edilen ve ayrıca haemozoin, parazit ile hemoglobin sindirimi ile üretilen bir atıl kristal paramanyetik özelliği baz alınarak Trang 15, 16 ile analiz bir teknik kullanılır. Grubumuz tarafından bildirilen başka bir yerde gibi, bu yöntem non-invaziv ve gibi işlem sonrası taze eritrositlerin invazyon yeteneği gibi Percoll tarafından zenginleştirme tabi parazitlerin istilası oranları karşılaştırıldığında normal belirtilen parazit etkiler görünmüyor gradient santrifüj 10, 14, 17. Kültür enfekte eritrosit yüksek bir sayı olup olmadığını sütun bağlama kapasitesi bir kerede bütün parazit içerik tutmak için yeterli olmayabilir, çünkü bu yarar ek olarak, fazla bir toplama aşaması olabilir. Yeterince parazitlerinin, belirli bir sonraki deney için toplanana kadar Bu nedenle elde edilen kültür kolon boyunca birkaç kez geçirilebilir.
P. koleksiyonu falciparum paramanyetik boncuk kullanımı ile site hızlı, basit ve bir geniş ve pahalı bir taban santrifüj gerekir ve ayrıca numunelerin dikkatli bir şekilde gerekli olan diferansiyel santrifüjleme tekniklerinde olduğu gibi sadece bir tezgah üstü santrifüj gerektirir.
Kültür zenginleştirme bazı uygulamalarında, başlangıç parazitemi titizlikle bütün örneklerde kontrol edilir istila deneylerde parazit kullanımı vardır; toplanmış parazitlerin kullanımı hemozoin, Plasmodium aile için ortak atıl kristal elde etmek için, bir şekilde yoğunluğu yüksek kullanımını Parazitlerin mikroskop analizi için hazırlamak üzere, ve diğer kan hücreleri ile karıştırılır sadece parazit DNA'nın elde edilmesi. Bu son uygulama genetik onlar bulaşmış sıtma zorlanma tespit ve bilinçli bir tedavi planı yapmak için klinik örneklerin analiz etmek için kullanılır olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Biz ifşa etmek başka bir şey var.
Acknowledgments
Bu çalışma tarafından finanse edildi hibe SORUN-009 CS ve Secretaria Nacional de Ciencia y Tecnología (SENACYT), Panama LC doktora bursu için.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 Hepes Modified | Sigma-Aldrich | R4130 | Supplemented with 10% human serum, 2% glucose, and 0.2% sodium bicarbonate |
| MidiMACS Separator | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-302 | |
| MACS MultiStand | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-303 | |
| LS Columns | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-401 | |
| Hemacytometer | Grafco | Grafco Neubauer Chamber | Can be found through many other suppliers |
References
- Jensen, J. B., Trager, W. Plasmodium falciparum in culture: use of outdated erythrocytes and description of the candle jar method. J. Parasitology. 63 (5), 883-886 (1977).
- Guzman, I. Y., Francis, S. E., Oksman, A., Smith, C. E., Duffin, K. L., Goldberg, D. E. Order and specificity of the Plasmodium falciparum hemoglobin degradation pathway. J. Clin. Invest. 93, 1602-1608 (1994).
- Rosenthal, P. J., Meshnick, S. R. Hemoglobin catabolism and iron utilization by malaria parasites. Mol. Biochem. Parasitol. 83 (2), 131-139 (1996).
- Fitch, C. D., Chevli, R., Kanjananggulpan, P., Dutta, P., Chevli, K., Chou, A. C. Intracellular ferriprotoporphyrin IX is a lytic agent. Blood. 62 (6), 1165-1168 (1983).
- Hebbel, R. P., Eaton, J. W. Pathobiology of heme interaction with the erythrocyte membrane. Semin. Hematol. 26 (2), 136-149 (1989).
- Egan, T. J.
- Hempelmann, E., Marques, H. M. Analysis of malaria pigment from Plasmodium falciparum. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 32 (1), 25-30 (1994).
- Fitch, C. D., Kanjananggulpan, P. The state of ferriprotoporphyrin IX in malaria pigment. J. Biol. Chem. 262 (32), 15552-15555 (1987).
- Moore, L. R., Fujioka, H., Williams, P. S., Chalmers, J. J., Grimberg, B., Zimmerman, P. A., Zborowski, M. Hemoglobin degradation in malaria-infected erythrocytes determined from live cell magnetophoresis. FASEB J. 20 (6), 747-749 (2006).
- Spadafora, C., Gerena, L., Kopydlowski, K. M. Comparison of the in vitro invasive capabilities of Plasmodium falciparum schizonts isolated by Percoll gradient or using magnetic based separation. Malaria J. 10, 96 (2011).
- Jackson, K. E., Spielmann, T., Hanssen, E., Adisa, A., Separovic, F., Dixon, M. W., Trenholme, K. R., Hawthorne, P. L., Gardiner, D. L., Gilberger, T., Tilley, L. Selective permeabilization of the host cell membrane of Plasmodium falciparum-infected red blood cells with streptolysin O and equinatoxin II. Biochem. J. 403, 167-175 (2007).
- Goodyer, I. D., Johnson, J., Eisenthal, R., Hayes, D. J. Purification of mature-stage Plasmodium falciparum by gelatine flotation. Ann. Trop. Med. Parasitol. 88 (2), 209-211 (1994).
- Pasvol, G., Wilson, R. J., Smalley, M. E., Brown, J. Separation of viable schizont-infected red cells of Plasmodium falciparum from human blood. Ann. Trop. Med. Parasitol. 72, 87-88 (1978).
- Pertoft, H. Fractionation of cells and subcellular particles with Percoll. J. Biochem. Biophys. Methods. 44 (1-2), 1-30 (2000).
- Paul, F., Roath, S., Melville, D., Warhurst, D. C., Osisanya, J. O. S. Separation of malaria-infected erythrocytes from whole blood: use of a selective high-gradient magnetic separation technique. The Lancet. 318, 70-71 (1981).
- Trang, D. T., Huy, N. T., Kariu, T., Tajima, K., Kamei, K. One-step concentration of malarial parasite-infected red blood cells and removal of contaminating white blood cells. Malar. J. 3, 7 (2004).
- Nillni, E. A., Londner, M. V., Spira, D. T. A simple method for separation of uninfected erythrocytes from those infected with Plasmodium berghei and for isolation of artificially released parasites. Z. Parasitenkd. 64, 279-284 (1981).
