Summary
Las propiedades paramagnéticas de hemozoína se utilizan para aislar las últimas etapas de
Abstract
A diferencia de otras especies de Plasmodium, P. falciparum pueden ser cultivados en el laboratorio, lo que facilita su estudio 1. Mientras que la parasitemia alcanzado puede alcanzar el límite de ≈ 40%, el investigador normalmente impide que el porcentaje en torno al 10%. En muchos casos es necesario aislar las células rojas de parásito que contienen la sangre (glóbulos rojos) de los no infectados, para enriquecer la cultura y proceder con un experimento dado.
Cuando P. falciparum infecta los eritrocitos, el parásito se degrada y se alimenta de hemoglobina 2, 3. Sin embargo, el parásito debe tratar con un resto hemo muy tóxico que contiene hierro 4, 5. El parásito elude su toxicidad mediante la transformación del hemo en un polímero de cristal inerte llamada haemozoin 6, 7. Esta molécula que contiene hierro se almacena en su vacuola alimentaria y el metal en él tiene un estado de oxidación que difiere de la de hemo 8. El estado férrico de hierro en el grupo hemoozoin le confiere una propiedad paramagnética ausente en los eritrocitos no infectados. Como el parásito invasor alcanza la madurez, el contenido de haemozoin 9 también aumenta, lo que confiere paramagnetismo aún más en las últimas etapas de P. falciparum en el interior de los eritrocitos.
En base a esta propiedad paramagnética, las últimas etapas de la P. falciparum infectados células rojas de la sangre pueden ser separadas haciendo pasar la cultura a través de una columna que contiene perlas magnéticas. Estas perlas se vuelven magnéticos cuando las columnas contienen se coloca en un soporte de imán. Eritrocitos infectados, debido a su paramagnetismo, entonces quedará atrapado en el interior de la columna, mientras que el flujo a través contendrá, en su mayor parte, los eritrocitos no infectados y aquellos que contienen etapas tempranas del parásito.
Aquí, se describe la metodología para enriquecer la población de parásitos en fase tardía con columnas magnéticas, lo que mantiene la viabilidad del parásito buena 10.Después de realizar este procedimiento, la cultura no unida puede ser devuelto a una incubadora para permitir que los parásitos restantes para continuar creciendo.
Protocol
Todas las etapas del protocolo, a excepción de centrifugaciones, debe llevarse a cabo dentro de una campana para mantener la muestra estéril.
1. Aislamiento en estadio tardío de P. falciparum-eritrocitos infectados
Todas las etapas tardías de Plasmodium eritrocitos infectados se pueden separar con esta metodología, ya hemozoína que confiere el paramagnetismo en el parásito, es un metabolito común al género. Una alta parasitemia (3-10%) en cultivo se recomienda para obtener mejores rendimientos con este protocolo, aunque una cultura típica contiene 2-4% de hematocrito (porcentaje en volumen de células rojas de la sangre) y 1-8% de parasitemia (porcentaje de infectados las células rojas de la sangre). Los parásitos pueden ser cultivados como se describe por Trager y Jansen 1.
- A simple, multi-parte de configuración debe estar montado para cada procedimiento de aislamiento de esquizontes. Para ello, las columnas LS, un separador magnético y un midiMACS MultiStand MACS de Miltenyi Biotec (Figura 1
- En un tubo separado (utilizar 50 ml cónicos largo), mezclar 23,2 ml de RPMI 1640 y 750 l de bicarbonato sódico al 7,5% para crear la solución de trabajo. Tienen tubos adicionales en la mano para recoger y desechar el flujo a través de la cultura parásito.
- Añadir 3 ml de la solución de trabajo a la columna para que se equilibren, y desechar el flujo a través de un tubo.
- Añadir 8 ml de la P. falciparum cultura a la columna, asegurándose de que tan pronto como la última parte de la solución de trabajo ha sido empujado fuera de la columna por la cultura, el tubo receptor se sustituye por el de recogida para comenzar la recuperación de la cultura no unido. Esto es necesario para evitar diluir el cultivo más allá.
- Una vez que el flujo de la cultura a través de la columna ha cesado, añadir 1 ml de la solución de trabajo para empujar los glóbulos rojos que quedan fuera de la columna.
- Etapa de lavado: Añadir otra ml 3 de la solución de trabajo a la columna y recoger el líquido que fluye en el "descarte" tubo a fin de evitar la dilución de la cultura que se guarda como de flujo a través en el otro tubo.
- La elución: Una vez que el 3 ml han pasado a través de la columna, separar este último del soporte y colocarlo en la parte superior de un tubo de 15 ml.
- Una vez más, añadir 3 ml de solución de trabajo a la columna. Este paso se eluye de los eritrocitos infectados con parásitos de etapa tardía que quedaron atrapados en las cuentas de la columna.
Nota: En este punto, y en función de la cantidad de parásitos necesario, iniciar otra ronda / s de recogida, obviamente, sujeto a los límites de la parasitemia en el cultivo original. La columna se puede reutilizar siempre y cuando el flujo mantiene un estado estacionario.
- La concentración de los parásitos recogidos: Se centrifuga el tubo de 15 ml que contiene el eluido durante 5 minutos a 150 xg, a temperatura ambientepara formar un sedimento oscuro de los eritrocitos parasitados.
- Eliminar el sobrenadante dejando suficiente líquido para tomar una pequeña muestra y determinar la concentración y el rendimiento total a través de microscopía (Ver paso 2).
- En este momento, si el aislamiento y la captura de los parásitos en fase tardía se realiza satisfactoriamente, incubar el cultivo recogido de nuevo con medio fresco.
- Diluir los parásitos recogidos en el volumen y la solución necesaria para los experimentos posteriores.
2. Pureza y Análisis de Rendimiento
- Comprobar la concentración de parásitos obtenidos mediante el uso de un hemocitómetro y recuento bajo un microscopio de luz. Para contar, añadir 10 l de la mezcla de los parásitos recogidos y medios de comunicación bajo el cubreobjetos del hemocitómetro. Contar el número de parásitos en los cuatro cuadrantes del hemocitómetro y se dividen por el número total 4. Multiplicar este número por 10 4 para obtener la concentración de e infectadarythrocytes por ml.
Notas: a) La concentración de la mezcla será decidido por el usuario en el momento de la resuspensión del sedimento, mediante la adición de más o menos medio. Una concentración de trabajo que se sugiere es de 5,5 x 10 4 schizontes por microlitro (esto normalmente se logra mediante la adición de 100-300 l de los parásitos recogidos). Si 20 l de esta concentración se añade a un volumen final de 100 l de mezcla de medios de comunicación y eritrocitos, una parasitemia de aproximadamente 1% en un cultivo típico hematocrito 4% se obtendrá. b) Contar en el hemocitómetro tiene que ser rápido, ya que los eritrocitos iniciar lisis como se seca la muestra dentro de la cámara. Eritrocitos infectados, que deben ser la mayoría, se mostrará una mancha oscura en el interior, lo que los diferencia de los no infectados.
- Realizar una Giemsa en capa fina tinción para evaluar la pureza de la recogida mediante la fijación de las diapositivas muy rápidamente en 10% de metanol, secado, y sumergiendo tdobladillo en una solución de 20% de tinción de Giemsa diluido con agua destilada. Teñir los portaobjetos durante 10 min, después de lo cual se puede secar por aire y se examina bajo el microscopio. Un parasitemia muy por encima de 70% deben ser alcanzables.
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Representative Results
En la Figura 2, el cultivo pasa a través de la columna magnética se muestra, antes (A) y después del procedimiento (B). Una a dos eritrocitos infectados se ven generalmente en un campo de aumento de 100X, como se muestra en la Figura 2, con las flechas apuntando a los eritrocitos infectados en la Figura 2A. En un procedimiento típico, a partir de un cultivo a 5% de parasitemia (Figura 2A), el rendimiento de este procedimiento generalmente produce eritrocitos con una parasitemia de 97%% -100 (Figura 2B). Enriquecimiento de la parasitemia en el orden de 20X es fácilmente alcanzable, y varias pasadas de la cultura a través de la columna puede lograr un alto rendimiento de P. falciparum en etapa tardía eritrocitos infectados, según sea necesario o deseado.
Figura 1.
Figura 2. A) Típica 5% sin sincronizar contenido parásito antes de enriquecimiento. Una muestra de 1 l de los parásitos recogidos mediante este procedimiento magnético, se tiñeron con Giemsa y puede visualizarse en un aumento de 100X. De una a tres eritrocitos infectados se ven normalmente en cualquier campo de alcance (marcada con flechas). B) Contenido del parásito después de enriquecimiento. Una muestra de 1 l de los parásitos recogidos mediante este procedimiento magnético se tiñeron con Giemsa y puede visualizarse en un aumento de 100X. La parasitemia es ahora 99%.
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Discussion
Los cultivos in vitro del parásito de la malaria P. falciparum presentan una parasitemia limitada, con más de la mitad de las células rojas de la sangre infectadas en el punto más alto de la proliferación de cultivo. Para la mayoría de los experimentos de investigación, es deseable para trabajar sólo con los eritrocitos infectados. Con este fin, una técnica de separación es necesario dividir el cultivo de acuerdo a la infección. Los métodos útiles incluyen el uso de estreptolisina O para permeabilizar y lisar los eritrocitos no infectados 11 y una serie de variaciones de centrifugaciones diferenciales que toman ventaja de la diferente densidad de los dos grupos. Algunos de estos métodos incluyen gelatina de flotación 12 y el uso de Plasmion 13 pero la sustancia más común utilizado para crear capas de diferentes densidades para atrapar las diferentes células rojas de la sangre es el gradiente de densidad de Percoll medio, que puede presentar una cierta toxicidad para los 14 parásitos.
Nos haha usado una técnica descrita por primera vez por Paul y analizado en profundidad por Trang 15, 16, basado en la propiedad de haemozoin paramagnético, un cristal inerte producido por la digestión de la hemoglobina por el parásito. Como se informó en otro lugar por nuestro grupo, este método no es invasivo y no parece afectar el parásito, como se indica por la normal después del tratamiento capacidad de invasión de los eritrocitos frescos, en comparación con las tasas de invasión de parásitos sometidos a enriquecimiento por Percoll centrifugación en gradiente de 10, 14, 17. Además de este beneficio, si el cultivo tiene un alto número de eritrocitos infectados, no puede haber más de una etapa de recogida, ya que la capacidad de unión de la columna puede no ser suficiente para contener todo el contenido parásito a la vez. Por lo tanto, el cultivo recogido se puede pasar a través de la columna varias veces hasta que los parásitos se recogen suficientes para un experimento dado subsiguiente.
La colección de P. falciparum párrafositios con el uso de perlas magnéticas es simple, rápido, y sólo requiere una centrífuga de sobremesa, a diferencia de las técnicas de centrifugación diferencial que necesitan una centrífuga de suelo grandes y costosos y que también requiere un manejo meticuloso de las muestras.
Algunas aplicaciones de enriquecimiento de cultivo son el uso de los parásitos en los ensayos de invasión donde está rigurosamente la parasitemia inicial controladas en todas las muestras, el uso de los parásitos recogidos para extraer hemozoína, el cristal inerte común a la familia de Plasmodium, el uso de una alta densidad de parásitos para prepararse para el análisis de microscopía y de la extracción de ADN de parásitos sólo cuando se mezclan con otras células sanguíneas. Esta última aplicación podría ser utilizado para analizar muestras clínicas para identificar genéticamente la cepa de malaria que están infectadas con y crea un plan terapéutico informado.
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Disclosures
No tenemos nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por el subsidio PRB-009 para CS y una beca doctoral a LC, de la Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología (SENACYT) de Panamá, Panamá.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 Hepes Modified | Sigma-Aldrich | R4130 | Supplemented with 10% human serum, 2% glucose, and 0.2% sodium bicarbonate |
| MidiMACS Separator | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-302 | |
| MACS MultiStand | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-303 | |
| LS Columns | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-401 | |
| Hemacytometer | Grafco | Grafco Neubauer Chamber | Can be found through many other suppliers |
References
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