Summary
De paramagnetische eigenschappen van hemozoin gebruikt in latere stadia van isolaat
Abstract
In tegenstelling tot andere soorten Plasmodium, P. falciparum kunnen worden gekweekt in het laboratorium, dat de studie 1 vergemakkelijkt. Terwijl de behaalde parasitemie bereikt u de ≈ 40%-grens, de onderzoeker houdt meestal het percentage op ongeveer 10%. In veel gevallen moet de parasiet bevattende rode bloedcellen (RBC's) van de geïnfecteerde die, isoleren de te verrijken met een bepaald experiment gaan.
Toen P. falciparum infecteert de erytrocyten, de parasiet degradeert en voert uit hemoglobine 2, 3. Wel moet de parasiet maken met een zeer giftige ijzerhoudende haem groep 4, 5. De parasiet ontsnapt toxiciteit door het transformeren van de haem in een inert kristalpolymeer genoemd haemozoin 6, 7. Dit ijzerhoudende molecule opgeslagen in de vacuole voedsel en metaal in een oxidatieve toestand heeft die verschilt van die in haem 8. De ferri toestand van ijzer in de haemozoin haar een paramagnetische eigenschap afwezig is in niet-geïnfecteerde erythrocyten. Als de binnenvallende parasiet volwassen is, de inhoud van haemozoin verhoogt ook 9, die nog meer paramagnetisme schenkt de laatste stadia van de P. falciparum in de erytrocyt.
Op basis van deze paramagnetische eigendom, de laatste stadia van de P. falciparum geïnfecteerde rode bloedcellen worden gescheiden door het passeren van de cultuur door een kolom met magnetische korrels. Deze kralen magnetisch worden wanneer de kolommen met hen op een magneethouder. Geïnfecteerde erytrocyten, vanwege hun paramagnetisme, wordt dan ingesloten in de kolom, terwijl de doorstroom bevat, voor het grootste deel, geïnfecteerde erytrocyten en die welke vroege stadia van de parasiet.
Hier beschrijven we de methodologie voor de bevolking van laat stadium parasieten verrijken met magnetische kolommen, die een goede parasiet levensvatbaarheid 10 onderhoudt.Nadat deze procedure kan de losse cultuur worden teruggestuurd naar een incubator om de resterende parasieten blijven groeien.
Protocol
Alle stappen van het protocol, behalve centrifugeren, worden uitgevoerd in een kap om het monster steriel.
1. Late Stage Isolatie van P. falciparum geïnfecteerde erythrocyten
Alle late stadia van Plasmodium-geïnfecteerde erythrocyten kunnen worden gescheiden met deze methode, aangezien hemozoin die paramagnetisme verleent de parasiet, een gemeenschappelijke metaboliet het genus. Een hoge parasitemie (3-10%) in cultuur wordt aanbevolen om betere opbrengsten te krijgen met dit protocol, maar een typische cultuur 2-4% hematocriet (volumepercentage van rode bloedcellen) en 1-8% parasitemie (percentage geïnfecteerde bevatten rode bloedcellen). Parasieten kunnen worden gekweekt zoals beschreven door Trager en Jansen 1.
- Een eenvoudige, multi-part setup moet worden gemonteerd voor elke schizont isolatie procedure. Hiervoor LS kolommen, een magnetische MidiMACS Separator en een MACS MultiStand van Miltenyi Biotec (figuur 1
- In een afzonderlijke buis (gebruik in 50 ml conicals), meng 23,2 ml van RPMI 1640 en 750 ul van 7,5% natriumbicarbonaat het werk oplossing. Hebben extra buizen bij de hand voor het teruggooien en het verzamelen van de doorstroming van de parasiet cultuur.
- 3 ml van de oplossing werken de kolom te equilibreren en gooi de doorstroming in een buis.
- Voeg 8 ml P. falciparum cultuur naar kolom zorgen dat zodra het laatste deel van het werk oplossing is geduwd uit de kolom door de cultuur wordt de ontvangende buis vervangen door een verzameling tot herstel van de vrije cultuur beginnen. Dit is noodzakelijk om verdunnen de cultuur verder.
- Zodra de stroom van de cultuur door de kolom is beëindigd, voeg 1 ml van de oplossing werken de resterende RBC duwen van de kolom.
- Wasstap: Voeg een 3 ml van de oplossing werken de kolom en verzamel de stromende vloeistof in de "ontdoen" tube om te voorkomen verdunnen cultuur opgeslagen als doorstroom in de andere buis.
- Elutie: Wanneer de 3 ml zijn door de kolom geleid, deze loslaten van de stand en op een 15 ml buisje.
- Nogmaals, 3 ml werk oplossing op de kolom. Deze stap elueert de erytrocyten geïnfecteerd met parasieten late die werden opgesloten in de kralen van de kolom.
Opmerking: Op dit punt, afhankelijk van de hoeveelheid vereiste parasieten, een ander rond / s bezit, uiteraard binnen de grenzen van de parasitemie in de oorspronkelijke cultuur. De kolom kan worden gebruikt zolang de stroming onderhoudt een steady state.
- Concentratie van de verzamelde parasieten: Centrifugeer de 15 ml buis met het eluaat gedurende 5 min bij 150 xg bij kamertemperatuureen donkere pellet vormen van geparasiteerde erytrocyten.
- Verwijder het supernatant met genoeg vloeistof een zeer klein monster te nemen en de concentratie en de totale opbrengst door microscopie bepalen (zie stap 2).
- Op dit moment, als de isolatie en vastleggen van late parasieten naar tevredenheid uitgevoerd, opnieuw geïncubeerd de verzamelde cultuur met vers medium.
- Verdun de verzamelde parasieten in het volume en oplossing nodig voor verdere experimenten.
2. Zuiverheid en opbrengst Analyse
- Controleer de concentratie van parasieten verkregen door een hemocytometer en tellen onder een lichtmicroscoop. Te tellen, voeg 10 ul van de mix van de verzamelde parasieten en de media onder het deksel slip van de hemocytometer. Tel het aantal parasieten in de vier kwadranten van het hemocytometer en verdeel het totale aantal met 4. Vermenigvuldig dat met 10 4 om de concentratie van geïnfecteerde e verkrijgenrythrocytes per ml.
Opmerkingen: a) De concentratie van het mengsel wordt bepaald door de gebruiker op het moment van resuspenderen van het pellet, door meer of minder medium. Voorgestelde werkconcentratie 5,5 X 10 4 schizonten per ul (dit wordt typisch bereikt door toevoeging 100-300 pi de verzamelde parasieten). Als 20 ul van deze concentratie wordt toegevoegd aan een eindvolume van 100 pi mix van media en erytrocyten, een parasitemie van ongeveer 1% in een typisch 4% hematocriet cultuur worden verkregen. b) tellen onder hemocytometer moet snel, aangezien de erytrocyten start lyseren het monster droogt binnen de kamer. Geïnfecteerde erythrocyten, die moet de meerderheid zijn, zal een donkere vlek binnen, die hen ten opzichte van niet-besmette dieren.
- Voer een dunne laag Giemsa kleuring om de zuiverheid van de collectie beoordelen door vaststelling van de slides zeer snel in 10% methanol, drogen, en onderdompelen tzoom in een 20% oplossing van Giemsa kleuring verdund met gedestilleerd water. Vlekken op de dia gedurende 10 min, waarna ze worden gedroogd door lucht en onder de microscoop onderzocht. Een parasitemie ruim boven de 70% haalbaar moeten zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In figuur 2 is de cultuur door het magnetische kolom weergegeven, voor (A) en na de procedure (B). Een tot twee geïnfecteerde erythrocyten worden meestal gezien op een 100X vergroting veld zoals getoond in figuur 2 met de pijlen om geïnfecteerde erythrocyten in figuur 2A. In een typische procedure, beginnend met een cultuur op 5% parasitemie (figuur 2A), het uitvoeren van deze procedure produceert gewoonlijk erythrocyten met een parasitemie van 97% -100% (Figuur 2B). Verrijking van parasitemie in de orde van 20X eenvoudig haalbaar en verschillende doorgangen van de cultuur door de kolom kunnen een hoge opbrengst van P. falciparum laat stadium geïnfecteerde erytrocyten, indien nodig of gewenst.
Figuur 1.
Figuur 2. A) Typische 5% niet-gesynchroniseerde parasiet inhoud voordat verrijking. Een 1 pl monster van de parasieten verzameld via deze magnetische procedure werd Giemsa gekleurd en bekeken op 100X vergroting. Een tot drie geïnfecteerde erythrocyten worden meestal gezien in een bepaalde sector scope (aangegeven met pijlen). B) Parasite inhoud na verrijking. Een 1 pl monster van de verzamelde parasieten via deze magnetische procedure wordt Giemsa gekleurd en bekeken op 100X vergroting. Parasitemie is nu 99%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vitro culturen van de malariaparasiet P. falciparum vertonen een beperkte parasitemie, meer dan de helft van de geïnfecteerde rode bloedcellen op het hoogste punt van proliferatie cultuur. Voor de meeste onderzoek experimenten is het wenselijk om alleen met de geïnfecteerde erythrocyten. Daartoe een scheidingstechniek moet de cultuur splitsen naar infectie. Bruikbare methoden omvatten het gebruik van streptolysine O te permeabiliseren en Lyze de geïnfecteerde RBC 11 en een reeks variaties differentiële centrifugeringen die gebruik maken van verschillende dichtheid van de twee groepen. Sommige van deze methoden omvatten gelatine flotatie 12 en het gebruik van Plasmion 13 maar de meest gebruikte stof gebruikt om lagen van verschillende dichtheden te creëren aan de verschillende rode bloedcellen te vangen wordt de dichtheidsgradiënt medium Percoll dat enige toxiciteit kunnen aan de parasieten 14.
We have gebruikt een techniek eerst beschreven door Paul en verder geanalyseerd door Trang 15, 16, gebaseerd op de eigenschap van paramagnetische haemozoin een inert kristal geproduceerd door de digestie van hemoglobine door de parasiet. Zoals elders gerapporteerd door onze groep, deze methode is niet-invasief en lijkt niet de parasiet, zoals aangegeven door de normale nabehandeling vermogen van invasie van erytrocyten verse als in vergelijking met de prijzen van parasieten invasie onderworpen aan verrijking door Percoll beïnvloeden gradiëntcentrifugering 10, 14, 17. Naast dit voordeel, als de cultuur een groot aantal geïnfecteerde erythrocyten, kunnen er meerdere verzamelingen stap omdat de bindingscapaciteit van de kolom kan niet voldoende om alle inhoud parasiet houden in een keer. Daarom kan de verzamelde cultuur worden door de kolom herhaaldelijk totdat voldoende parasieten worden verzameld voor een bepaald volgende experiment.
De collectie van P. falciparum parasites met het gebruik van magnetische kralen is eenvoudig, snel, en vereist slechts een benchtop centrifuge, in tegenstelling tot de differentiële centrifugatie technieken die een grote en kostbare vloer centrifuge vereisen en ook vereist een nauwkeurige behandeling van de monsters.
Sommige toepassingen van cultuurverrijking zijn het gebruik van de parasieten in invasie assays waar het begin parasitemie strikt geregeld in alle monsters, het gebruik van de verzamelde parasieten hemozoin het inerte kristal welke de Plasmodium familie extraheren, gebruik van een hoge dichtheid van parasieten te bereiden voor microscopie analyse en de winning van DNA van slechts parasieten wanneer zij gemengd met andere bloedcellen. Deze laatste toepassing kan worden gebruikt om klinische monsters te analyseren genetisch identificeren stam van malaria ze besmet zijn met een weloverwogen en therapeutische plan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
We hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door subsidie PRB-009 CS en een doctoraatsbeurs naar LC, van de Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología (SENACYT), Panama.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 Hepes Modified | Sigma-Aldrich | R4130 | Supplemented with 10% human serum, 2% glucose, and 0.2% sodium bicarbonate |
| MidiMACS Separator | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-302 | |
| MACS MultiStand | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-303 | |
| LS Columns | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-401 | |
| Hemacytometer | Grafco | Grafco Neubauer Chamber | Can be found through many other suppliers |
References
- Jensen, J. B., Trager, W. Plasmodium falciparum in culture: use of outdated erythrocytes and description of the candle jar method. J. Parasitology. 63 (5), 883-886 (1977).
- Guzman, I. Y., Francis, S. E., Oksman, A., Smith, C. E., Duffin, K. L., Goldberg, D. E. Order and specificity of the Plasmodium falciparum hemoglobin degradation pathway. J. Clin. Invest. 93, 1602-1608 (1994).
- Rosenthal, P. J., Meshnick, S. R. Hemoglobin catabolism and iron utilization by malaria parasites. Mol. Biochem. Parasitol. 83 (2), 131-139 (1996).
- Fitch, C. D., Chevli, R., Kanjananggulpan, P., Dutta, P., Chevli, K., Chou, A. C. Intracellular ferriprotoporphyrin IX is a lytic agent. Blood. 62 (6), 1165-1168 (1983).
- Hebbel, R. P., Eaton, J. W. Pathobiology of heme interaction with the erythrocyte membrane. Semin. Hematol. 26 (2), 136-149 (1989).
- Egan, T. J.
- Hempelmann, E., Marques, H. M. Analysis of malaria pigment from Plasmodium falciparum. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 32 (1), 25-30 (1994).
- Fitch, C. D., Kanjananggulpan, P. The state of ferriprotoporphyrin IX in malaria pigment. J. Biol. Chem. 262 (32), 15552-15555 (1987).
- Moore, L. R., Fujioka, H., Williams, P. S., Chalmers, J. J., Grimberg, B., Zimmerman, P. A., Zborowski, M. Hemoglobin degradation in malaria-infected erythrocytes determined from live cell magnetophoresis. FASEB J. 20 (6), 747-749 (2006).
- Spadafora, C., Gerena, L., Kopydlowski, K. M. Comparison of the in vitro invasive capabilities of Plasmodium falciparum schizonts isolated by Percoll gradient or using magnetic based separation. Malaria J. 10, 96 (2011).
- Jackson, K. E., Spielmann, T., Hanssen, E., Adisa, A., Separovic, F., Dixon, M. W., Trenholme, K. R., Hawthorne, P. L., Gardiner, D. L., Gilberger, T., Tilley, L. Selective permeabilization of the host cell membrane of Plasmodium falciparum-infected red blood cells with streptolysin O and equinatoxin II. Biochem. J. 403, 167-175 (2007).
- Goodyer, I. D., Johnson, J., Eisenthal, R., Hayes, D. J. Purification of mature-stage Plasmodium falciparum by gelatine flotation. Ann. Trop. Med. Parasitol. 88 (2), 209-211 (1994).
- Pasvol, G., Wilson, R. J., Smalley, M. E., Brown, J. Separation of viable schizont-infected red cells of Plasmodium falciparum from human blood. Ann. Trop. Med. Parasitol. 72, 87-88 (1978).
- Pertoft, H. Fractionation of cells and subcellular particles with Percoll. J. Biochem. Biophys. Methods. 44 (1-2), 1-30 (2000).
- Paul, F., Roath, S., Melville, D., Warhurst, D. C., Osisanya, J. O. S. Separation of malaria-infected erythrocytes from whole blood: use of a selective high-gradient magnetic separation technique. The Lancet. 318, 70-71 (1981).
- Trang, D. T., Huy, N. T., Kariu, T., Tajima, K., Kamei, K. One-step concentration of malarial parasite-infected red blood cells and removal of contaminating white blood cells. Malar. J. 3, 7 (2004).
- Nillni, E. A., Londner, M. V., Spira, D. T. A simple method for separation of uninfected erythrocytes from those infected with Plasmodium berghei and for isolation of artificially released parasites. Z. Parasitenkd. 64, 279-284 (1981).
