Summary
وتستخدم خصائص ممغطس من هيموزوين لعزل المراحل المتأخرة من
Abstract
على عكس الأنواع الأخرى المتصورة، P. يمكن زرعها في المختبر المنجلية، مما يسهل دراستها 1. في حين أن تحقيق تطفلن الدم يمكن أن تصل إلى حد 40٪ ≈، المحقق يحتفظ عادة نسبة حوالي 10٪. في كثير من الحالات يكون من الضروري عزل الطفيلي التي تحتوي على خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) عن تلك غير مصاب، لإثراء الثقافة والمضي قدما في تجربة معينة.
عندما P. يصيب كرات الدم الحمراء المنجلية، ويحط الطفيلي يتغذى من الهيموغلوبين 2، 3. ومع ذلك، يجب أن الطفيلي التعامل مع شاردة الحديد سامة جدا هيم التي تحتوي على 4 و 5. الطفيلي يتملص سميته عن طريق تحويل هيم إلى البوليمر الكريستال خاملة دعا haemozoin 6 و 7. يتم تخزين هذا الجزيء التي تحتوي على الحديد في فجوة الغذائية والمعدنية في دولة لديها الأكسدة التي تختلف عن تلك الموجودة في هيم 8. الدولة الحديديك الحديد في هيمozoin يضفي عليه خاصية ممغطس غائبة في كرات الدم الحمراء غير المصابة. كما الطفيلي الغازية تصل إلى مرحلة النضج، ومضمون haemozoin يزيد أيضا 9، الذي يمنح المزيد من المغطسة على آخر مراحل P. داخل كرات الدم الحمراء المنجلية.
استنادا إلى هذه الخاصية ممغطس، أحدث مراحل P. ويمكن فصل الخلايا المنجلية المصابة الدم الحمراء عن طريق تمرير الثقافة من خلال عمود تحتوي على الخرز المغناطيسي. هذه الخرز المغناطيسي تصبح عندما يتم وضع الأعمدة التي تحتوي عليها على حامل المغناطيس. وبعد ذلك كرات الدم الحمراء المصابة، وذلك بسبب المغطسة بهم، أن المحاصرين داخل العمود، في حين أن التدفق من خلال ستتضمن، بالنسبة للجزء الاكبر، وكرات الدم الحمراء غير مصاب تلك المراحل المبكرة من المحتوية على الطفيلي.
هنا، نحن تصف منهجية لإثراء السكان من الطفيليات مرحلة متأخرة مع الأعمدة المغناطيسي، والذي يحافظ على بقاء الطفيليات جيدة 10.بعد تنفيذ هذا الإجراء، يمكن إرجاعها إلى ثقافة غير مرتبط حاضنة للسماح للطفيليات المتبقية لمواصلة النمو.
Protocol
جميع الخطوات من البروتوكول، باستثناء centrifugations، ينبغي القيام بها داخل غطاء للحفاظ على عينة معقمة.
1. في وقت متأخر من مرحلة عزل P. المنجلية المصابة تبدي الكريات الحمر
ويمكن فصل جميع المراحل المتأخرة من الكريات الحمراء المنجلية المصابة مع هذه المنهجية، منذ هيموزوين، الذي يمنح المغطسة على الطفيلي، هو المستقلب المشتركة بين جنس. ينصح تطفلن الدم عالية (3-10٪) في الثقافة للحصول على أفضل غلة مع هذا البروتوكول، على الرغم من أن الثقافة التقليدية وتحتوي على 2-4٪ الهيماتوكريت (نسبة حجم خلايا الدم الحمراء) وتطفلن الدم 1-8٪ (النسبة المئوية من المصابين خلايا الدم الحمراء). يمكن تربيتها الطفيليات كما وصفها Trager ويانسن 1.
- يجب أن يتم تجميعها A البسيطة، متعددة الأجزاء الإعداد لإجراء العزل كل المتقسمة. لهذا، والأعمدة LS، فاصل المغناطيسي MidiMACS وMultiStand MACS من بيوتيك Miltenyi (الشكل 1
- في أنبوب منفصل (استخدام 50 مل في جميع أنحاء conicals)، مزيج 23،2 مل من RPMI 1640 و 750 ميكرولتر من بيكربونات الصوديوم 7.5٪ لإنشاء حل العمل. لديك أنابيب إضافية على يد لنبذ وجمع التدفق من خلال ثقافة الطفيلي.
- أضف 3 مل من الحل إلى العمود العمل لتتوازن فيه، وتجاهل التدفق من خلال أنبوب إلى.
- إضافة 8 مل من P. ثقافة المنجلية إلى العمود، والتأكد من أن بمجرد أن الجزء الأخير من الحل تم عمل طردوا من العمود من قبل الثقافة، ويتم استبدال الأنبوب تلقي من جانب واحد لبدء جمع انتعاش ثقافة غير منضم. هذا ضروري لتجنب إضعاف الثقافة أكثر من ذلك.
- مرة واحدة في تدفق الثقافة من خلال العمود قد توقف، إضافة 1 مل من محلول العمل لدفع كرات الدم الحمراء المتبقية من العمود.
- غسل الخطوة: إضافة آخر مل 3 من محلول العمل إلى العمود وجمع السائل التي تصب في أنبوب "تجاهل" من أجل تجنب إضعاف الثقافة يتم حفظ والتدفق من خلال أنبوب في أخرى.
- شطف: مرة واحدة في 3 مل مرت من خلال العمود، فصل الأخير من الموقف ووضعه على رأس أنبوب 15 مل.
- مرة أخرى، أضف 3 مل من محلول العمل إلى العمود. هذه الخطوة elutes والكريات الحمراء المصابة بالطفيليات المرحلة المتأخرة التي تم المحاصرين في حبات من العمود.
ملاحظة: عند هذه النقطة، وهذا يتوقف على مقدار من الطفيليات المطلوبة، تبدأ جولة أخرى / ثانية من جمع وتخضع بشكل مباشر للحدود تطفلن الدم في الثقافة الأصلية. يمكن إعادة استخدامها العمود طالما تدفق يحافظ على حالة مستقرة.
- تركيز الطفيليات التي تم جمعها: الطرد المركزي في أنبوب 15 مل تحتوي على شطافة لمدة 5 دقائق في 150 XG في درجة حرارة الغرفةلتشكيل بيليه الظلام من الكريات الحمراء الطفيلي.
- إزالة طاف ترك ما يكفي من السوائل لأخذ عينة صغيرة جدا وتحديد تركيز والمحصول الكلي من خلال المجهر (راجع الخطوة 2 أدناه).
- في هذه اللحظة، إذا تم إنجاز العزلة والقبض على الطفيليات مرحلة متأخرة مرض، احتضان الثقافة جمعها مرة أخرى مع وسائل الإعلام الجديدة.
- يخفف من الطفيليات التي تم جمعها في حجم والحل اللازم لتجارب لاحقة.
2. النقاء وتحليل الربح الموزع
- تحقق من تركيز الطفيليات التي تم الحصول عليها باستخدام عدادة الكريات والفرز تحت المجهر الخفيفة. لحساب، إضافة 10 ميكرولتر من مزيج من الطفيليات التي تم جمعها وسائل الإعلام تحت غطاء زلة لعدادة الكريات. حساب عدد الطفيليات في الأرباع الأربعة من عدادة الكريات وتقسيم العدد الإجمالي بنسبة 4. مضاعفة هذا العدد بمقدار 10 4 للحصول على تركيز ه المصابةrythrocytes لكل مل.
ملاحظات: سيتم تحديد أ) تركيز المزيج من قبل المستخدم في لحظة resuspending بيليه، وذلك بإضافة أكثر أو أقل المتوسطة. A تركيز اقترح العمل هو 5.5 X 10 4 schizontes في ميكرولتر (ويتحقق هذا عادة عن طريق إضافة 100-300 ميكرولتر إلى جمع الطفيليات). إذا تم إضافة 20 ميكرولتر من هذا التركيز إلى وحدة تخزين النهائي من 100 ميكرولتر مزيج من وسائل الاعلام والكريات الحمراء، وتطفلن الدم من حوالي 1٪ في ثقافة نموذجية الهيماتوكريت 4٪ يمكن الحصول عليها. ب) في إطار العد عدادة الكريات يجب أن يكون سريعا، منذ بدء lysing الكريات الحمراء كما أن يجف عينة داخل الغرفة. والكريات الحمراء المصابة، التي ينبغي أن تكون الأغلبية، تظهر داخل بقعة داكنة، والتي تميزهم عن غير المصابة منها.
- تنفيذ طبقة رقيقة بالغيمزا وصمة عار لتقييم نقاء جمع عن طريق تحديد الشرائح بسرعة كبيرة في الميثانول بنسبة 10٪، والتجفيف لهم، وتخبط روصمة عار المخفف تنحنح في حل 20٪ من بالغيمزا مع الماء المقطر. وصمة عار الشرائح لمدة 10 دقيقة، وبعد ذلك يمكن أن تجفف الهواء من قبل وفحصها تحت المجهر. وينبغي أن يكون تطفلن الدم أعلى بكثير من 70٪ يمكن تحقيقه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في الشكل 2، يظهر الثقافة التي تمر عبر العمود المغناطيسي، قبل (A) وبعد العملية. (B) وينظر عادة واحد إلى اثنين الكريات الحمراء المصابة في حقل التكبير 100X كما هو مبين في الشكل 2، ويتجهان إلى الكريات الحمراء المصابة في الشكل 2A. في إجراء نموذجية، بدءا من الثقافة في تطفلن الدم 5٪ (الشكل 2A)، وأداء هذا الإجراء عادة ما تنتج كرات الدم الحمراء مع تطفلن الدم من 97٪ -100٪ (الشكل 2B). إثراء تطفلن الدم بناء على أمر من 20X يمكن تحقيقه بسهولة، ويمر العديد من الثقافة من خلال العمود قد يحقق عالية الإنتاج من P. المنجلية في وقت متأخر من مرحلة الكريات الحمراء المصابة، أو حسب الحاجة المطلوبة.
الشكل 1.
الشكل 2. A) نموذجي 5٪ غير المتزامنة محتوى الطفيلي قبل التخصيب. كانت ملطخة بالغيمزا A نموذج 1 ميكرولتر من الطفيليات التي تم جمعها من خلال هذا الإجراء المغناطيسي وينظر في التكبير 100X. وينظر عادة واحدة إلى ثلاث كرات الدم الحمراء المصابة في أي مجال معين من النطاق (يتسم مع سهم). B) الطفيلي المحتوى بعد التخصيب. اتسخت بالغيمزا A نموذج 1 ميكرولتر من الطفيليات التي تم جمعها من خلال هذا الإجراء المغناطيسي وينظر في التكبير 100X. تطفلن الدم الآن 99٪.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في الثقافات المختبر من الملاريا الطفيلية P. يحمل المنجلية تطفلن الدم محدودة، مع أكثر من نصف خلايا الدم الحمراء غير مصاب في أعلى نقطة انتشار الثقافة. معظم البحوث للتجارب، من المستحسن أن تعمل فقط مع الكريات الحمراء المصابة. تحقيقا لهذه الغاية، وهي تقنية الفصل ضروري لتقسيم الثقافة وفقا للعدوى. طرق مفيدة تشمل استخدام O ستربتوليزين لpermeabilize وينحل في كرات الدم الحمراء غير مصاب (11) وسلسلة من الاختلافات من الفرق التي centrifugations الاستفادة من الكثافة مختلفة من المجموعتين. بعض من هذه الأساليب تشمل تعويم الجيلاتين 12 و استخدام Plasmion 13 ولكن المادة الأكثر شيوعا التي تستخدم لخلق طبقات من كثافات مختلفة لاعتراض مختلفة خلايا الدم الحمراء هي وسيلة التدرج Percoll الكثافة، والذي قد يقدم بعض الطفيليات سمية إلى 14.
ونحن هالقد استخدمت تقنية وصف لأول مرة من قبل بول وتحليل مزيد من ترانج 15 و 16، على أساس الملكية ممغطس من haemozoin، بلورة الخاملة التي تنتجها هضم الهيموجلوبين من الطفيليات. كما ورد في مواضع أخرى من مجموعتنا، وهذه الطريقة غير الغازية و لا يبدو أنها تؤثر على الطفيلي، كما يدل على ذلك طبيعتها بعد المعاملة قدرة الكريات الحمراء الطازجة غزو، بالمقارنة مع معدلات غزو الطفيليات تعرض لتخصيب اليورانيوم بحلول Percoll التدرج الطرد المركزي 10، 14، 17. بالإضافة إلى هذا الاستحقاق، إذا كان لديه ثقافة عدد كبير من الكريات الحمراء المصابة، يمكن أن يكون هناك أكثر من خطوة واحدة جمع ومنذ قدرة ملزمة للعمود قد يكون غير كاف لاحتواء كافة المحتوى في وقت واحد الطفيلي. ولذلك، يمكن أن تنتقل ثقافة جمعها من خلال العمود عدة مرات حتى يتم جمع ما يكفي من الطفيليات لتجربة لاحقة معينة.
جمع P. الفقرة المنجليةمواقع باستخدام الخرز المغناطيسي هو بسيطة وسريعة، ويتطلب سوى الطرد المركزي الفوق، على عكس تقنيات الطرد المركزي المغاير التي تحتاج إلى أجهزة الطرد المركزي الطابق الكبيرة والمكلفة والتي تتطلب أيضا معالجة دقيقة للعينات.
بعض التطبيقات لتخصيب الثقافة هي استخدام الطفيليات في المقايسات غزو حيث يتم التحكم بدقة بدءا تطفلن الدم في جميع العينات، واستخدام الطفيليات التي تم جمعها لاستخراج هيموزوين، والكريستال خاملة المشتركة بين الأسرة المتصورة، واستخدام كثافة عالية من الطفيليات للتحضير لتحليل المجهر، واستخراج الحمض النووي من الطفيليات فقط عندما تكون مختلطة مع خلايا الدم الأخرى. ويمكن استخدام هذا التطبيق لتحليل مشاركة العينات السريرية لتحديد وراثيا سلالة من الملاريا مع أنهم مصابون وجعل خطة علاجية علم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدينا شيء في الكشف عنها.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل منحة PRB CS-009 لومنحة دراسية لشهادة الدكتوراه LC، من الاتحاد الوطني للبحوث والتكنولوجيا ذ Secretaría دي Ciencia (SENACYT)، بنما.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 Hepes Modified | Sigma-Aldrich | R4130 | Supplemented with 10% human serum, 2% glucose, and 0.2% sodium bicarbonate |
| MidiMACS Separator | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-302 | |
| MACS MultiStand | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-303 | |
| LS Columns | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-401 | |
| Hemacytometer | Grafco | Grafco Neubauer Chamber | Can be found through many other suppliers |
References
- Jensen, J. B., Trager, W. Plasmodium falciparum in culture: use of outdated erythrocytes and description of the candle jar method. J. Parasitology. 63 (5), 883-886 (1977).
- Guzman, I. Y., Francis, S. E., Oksman, A., Smith, C. E., Duffin, K. L., Goldberg, D. E. Order and specificity of the Plasmodium falciparum hemoglobin degradation pathway. J. Clin. Invest. 93, 1602-1608 (1994).
- Rosenthal, P. J., Meshnick, S. R. Hemoglobin catabolism and iron utilization by malaria parasites. Mol. Biochem. Parasitol. 83 (2), 131-139 (1996).
- Fitch, C. D., Chevli, R., Kanjananggulpan, P., Dutta, P., Chevli, K., Chou, A. C. Intracellular ferriprotoporphyrin IX is a lytic agent. Blood. 62 (6), 1165-1168 (1983).
- Hebbel, R. P., Eaton, J. W. Pathobiology of heme interaction with the erythrocyte membrane. Semin. Hematol. 26 (2), 136-149 (1989).
- Egan, T. J.
- Hempelmann, E., Marques, H. M. Analysis of malaria pigment from Plasmodium falciparum. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 32 (1), 25-30 (1994).
- Fitch, C. D., Kanjananggulpan, P. The state of ferriprotoporphyrin IX in malaria pigment. J. Biol. Chem. 262 (32), 15552-15555 (1987).
- Moore, L. R., Fujioka, H., Williams, P. S., Chalmers, J. J., Grimberg, B., Zimmerman, P. A., Zborowski, M. Hemoglobin degradation in malaria-infected erythrocytes determined from live cell magnetophoresis. FASEB J. 20 (6), 747-749 (2006).
- Spadafora, C., Gerena, L., Kopydlowski, K. M. Comparison of the in vitro invasive capabilities of Plasmodium falciparum schizonts isolated by Percoll gradient or using magnetic based separation. Malaria J. 10, 96 (2011).
- Jackson, K. E., Spielmann, T., Hanssen, E., Adisa, A., Separovic, F., Dixon, M. W., Trenholme, K. R., Hawthorne, P. L., Gardiner, D. L., Gilberger, T., Tilley, L. Selective permeabilization of the host cell membrane of Plasmodium falciparum-infected red blood cells with streptolysin O and equinatoxin II. Biochem. J. 403, 167-175 (2007).
- Goodyer, I. D., Johnson, J., Eisenthal, R., Hayes, D. J. Purification of mature-stage Plasmodium falciparum by gelatine flotation. Ann. Trop. Med. Parasitol. 88 (2), 209-211 (1994).
- Pasvol, G., Wilson, R. J., Smalley, M. E., Brown, J. Separation of viable schizont-infected red cells of Plasmodium falciparum from human blood. Ann. Trop. Med. Parasitol. 72, 87-88 (1978).
- Pertoft, H. Fractionation of cells and subcellular particles with Percoll. J. Biochem. Biophys. Methods. 44 (1-2), 1-30 (2000).
- Paul, F., Roath, S., Melville, D., Warhurst, D. C., Osisanya, J. O. S. Separation of malaria-infected erythrocytes from whole blood: use of a selective high-gradient magnetic separation technique. The Lancet. 318, 70-71 (1981).
- Trang, D. T., Huy, N. T., Kariu, T., Tajima, K., Kamei, K. One-step concentration of malarial parasite-infected red blood cells and removal of contaminating white blood cells. Malar. J. 3, 7 (2004).
- Nillni, E. A., Londner, M. V., Spira, D. T. A simple method for separation of uninfected erythrocytes from those infected with Plasmodium berghei and for isolation of artificially released parasites. Z. Parasitenkd. 64, 279-284 (1981).
