एक उपन्यास<em> पूर्व vivo</emभ्रूण माउस हार्ट के लिए> संस्कृति विधि
Summary
माउस में विकास अध्ययन हमल के दौरान भ्रूण की पहुंच से प्रभावित कर रहे हैं. गर्भ की देर चरणों में भ्रूण दिल की दीर्घकालिक संस्कृति को बढ़ावा देने के लिए, हम excised दिल एक अर्द्ध ठोस, पतला Matrigel में सुसंस्कृत है जिसमें एक प्रोटोकॉल विकसित की है.
Abstract
माउस में विकास अध्ययन हमल के दौरान भ्रूण की पहुंच से प्रभावित कर रहे हैं. इस प्रकार, प्रोटोकॉल को अलग करने और ब्याज की संस्कृति व्यक्ति के अंगों दोनों के विकास में परिवर्तन दृश्यमान करने और अनुमति देने के लिए उपन्यास उपचार रणनीति का एक तरीका प्रदान करने के लिए आवश्यक हैं. गर्भ की देर चरणों में भ्रूण दिल की दीर्घकालिक संस्कृति को बढ़ावा देने के लिए, हम excised दिल एक अर्द्ध ठोस, पतला Matrigel में सुसंस्कृत है जिसमें एक प्रोटोकॉल विकसित की है. इस सब्सट्रेट तीन आयामी संरचना को बनाए रखने का समर्थन पर्याप्त प्रदान करता है, लेकिन निरंतर संकुचन अनुमति देने के लिए काफी लचीला है. संक्षेप में, दिल भ्रूण से excised और ठंड Matrigel के एक मिश्रण में रखा जाता है मध्यम विकास के साथ 1:1 पतला. पतला Matrigel solidifies के बाद, मध्यम विकास संस्कृति पकवान में जोड़ा जाता है. भ्रूण दिन 16.5 के रूप में देर के रूप में excised दिल चार दिनों के बाद विच्छेदन के लिए व्यवहार्य थे. कोरोनरी जाल का विश्लेषण इस विधि नहीं है पता चलता है किकोरोनरी संवहनी विकास को बाधित. इस प्रकार, हम भ्रूण दिल की दीर्घकालिक संस्कृति के लिए एक उपन्यास विधि प्रस्तुत करते हैं.
Introduction
हाल के वर्षों में, ट्रांसजेनिक माउस विकास हृदय दोष के अध्ययन के लिए प्रमुख मॉडल व्यवस्था की गई है. हालांकि, इस तरह zebrafish के रूप में अन्य मॉडल जीवों, माउस से अधिक महत्वपूर्ण लाभ है सिद्ध कर दिया है. Zebrafish के तीन प्रमुख लाभ भ्रूण के लिए उपयोग में आसानी के लिए, अंडे की बाहरी बिछाने रहे हैं, हृदय की विकास की आसान दृश्य की अनुमति देता है, जो भ्रूण के ऑप्टिकल पारदर्शिता,, और करने के लिए छोटे आणविक उपचार लागू करने में आसानी भ्रूण के विकास को व्यवस्थित करना 1. इस प्रकार, एक भ्रूण अंग के पूर्व गर्भाशय वृद्धि की अनुमति दी है कि एक संस्कृति तकनीक के विकास के कम से कम भाग में, सीमाओं वर्तमान में ट्रांसजेनिक चूहों में विकास की प्रक्रिया का अध्ययन शोधकर्ताओं द्वारा अनुभवी, बाईपास होगा.
पूर्व vivo हृदय संस्कृति प्रणालियों अलग कैसे के छोटे अणुओं और विश्लेषण के साथ इलाज के लिए अनुमति देते हैं कि लड़की और माउस भ्रूण दोनों में विकसित किया गया हैदिल की अलग क्षेत्रों 2-6 संवाद. पूरे माउस दिल संस्कृति के लिए, दिल भ्रूण को भ्रूण से ऊपर ले लिया (ई) उम्र के 12.5 कमाल 2,3,5 के साथ या बिना संस्कृति के माध्यम में रखा जा सकता है. इस तकनीक का उपयोग करना, भ्रूण दिल सफलतापूर्वक E13.5 की समानक लिए incubated किया गया है, और कमाल के साथ सुसंस्कृत दिल के रूप में लंबे समय से तीन दिन (E10.5 पर शुरू) 3 के रूप में बनाए रखा गया है. हालांकि, कोई पढ़ाई पुराने भ्रूण से दिल की सफल संस्कृति की सूचना दी है. इसी तरह, बचाव प्रयोगों संस्कृति के माध्यम से 2 से विश्व स्तर पर चिकित्सीय एजेंट को लागू करने के लिए सीमित कर दिया गया है.
दिल, excised एम्बेडेड, और एक vibratome का उपयोग sectioned रहे हैं जिसमें एक टुकड़ा संस्कृति प्रणाली, भी इस तरह E12.5 माउस दिल और हैम्बर्गर-हैमिल्टन चरण 36 (लगभग E16 माउस में) लड़की के दिल के रूप में दोनों युवा दिलों के लिए उपयोग किया गया है ऐसे प्रसवोत्तर और वयस्क माउस ज के रूप में 2,4,6, और बड़े दिल,earts और वयस्क मानव मन 7,8. भ्रूण विश्लेषण आम तौर पर 150 माइक्रोन मोटी वर्गों 2,4 का उपयोग किया है, वहीं खंड मोटाई ऑक्सीजन के अभाव 8 के सबूत के बिना एक महान के रूप में 500 माइक्रोन हो सकता है. ये टुकड़ा संस्कृतियों सबसे स्लाइस इस अवधि 9 भर सिकुड़ना बनाए रखने के साथ, संस्कृति में दो महीने के रूप में लंबे समय के रूप में बनाए रखा गया है. पृथक cardiomyocytes में पढ़ाई की तुलना में, इन टुकड़ा संस्कृतियों उनके पड़ोसी प्रकार की कोशिकाओं के साथ cardiomyocytes की सह संस्कृति की अनुमति और पूर्व vivo विश्लेषण के लिए एक उपयोगी तरीका प्रदान करते हैं. हालांकि, इन संस्कृतियों बस संस्कृति के माध्यम में एक दिल (जैसे एक vibratome पर सेक्शनिंग के लिए जीना दिल एम्बेड) रखने की तुलना में अधिक व्यापक सेट अप की आवश्यकता होती है, और किसी भी विश्लेषण स्पष्ट रूप से खंड के भीतर दिल के हिस्से तक सीमित है.
सीमाओं संवर्धन भ्रूण माउस दिल और ट्रांसजेनिक चूहों Ava है के धन के लिए ऊपर वर्णित देखते हुएअध्ययन के लिए ilable, हम वीवर द्वारा विकसित एक पूर्व vivo फेफड़ों संस्कृति व्यवस्था करने के लिए इसी तरह के एक पूर्व vivo माउस दिल संस्कृति प्रणाली विकसित की है, एट अल. 10 हमारी संस्कृति प्रणाली पूरे भ्रूण माउस दिल के भीतर remodeling के कोरोनरी परिसंचरण के दीर्घकालिक संस्कृति और दृश्य परमिट. इसके अलावा, Matrigel का उपयोग इस प्रकार चिकित्सीय एजेंट के साथ एक स्थानीय उपचार उपलब्ध कराने, मोती दिल के पास जगह में आयोजित होने के लिए अनुमति देता है. इन प्रयोगों ऐसे कोरोनरी धमनी गठन के रूप में एक प्रक्रिया पर किसी दिए गए उपचार के प्रभाव की तुलना करने के विभिन्न विकासात्मक समय बिंदुओं पर प्रदर्शन किया जा सकता है. छोटे अणुओं Matrigel के माध्यम से फैलाना सकती है, इस संस्कृति प्रणाली भी विशिष्ट सेल सेल संपर्कों कुछ विकास की प्रक्रिया के लिए आवश्यक या अन्य करने के लिए एक क्षेत्र से पैराक्राइन संकेत है कि क्या कर रहे हैं कि क्या यह निर्धारित करने के लिए एक दूसरे के निकट दिल की संस्कृति विच्छेदित क्षेत्रों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है आवश्यक.
इस संस्कृति प्रणालीअपेक्षाकृत सरल है और, टुकड़ा संस्कृति प्रणाली के विपरीत, मूल संस्कृति अभिकर्मकों और सबसे प्रयोगशालाओं में आसानी से उपलब्ध हैं कि सेट अप का उपयोग करता है. संक्षेप में, excised भ्रूण दिल एक अर्द्ध ठोस समर्थन प्रदान करता है जो पतला Matrigel में सुसंस्कृत हैं. यह समर्थन भी अनुबंध करने के लिए दिल की अनुमति है, जबकि दिल की तीन आयामी आकारिकी बनाए रखने के लिए पर्याप्त है. इस प्रणाली का प्रयोग, पुराने माउस भ्रूण (E14.5-E16.5) से पूरे दिल चार दिनों के लिए संस्कृति में बनाए रखा जा सकता है. पूरे कोरोनरी जाल टुकड़ा संस्कृतियों में विपरीत बनाए रखा है, तो दिल के विभिन्न क्षेत्रों से होती है कि किसी भी संकेत संकेत मौजूद रहना है. इसके अलावा, रहने कक्ष फ्लोरोसेंट रंगों रहते दिल के दृश्य की अनुमति Matrigel तर कर सकते हैं, और प्रोटीन संयुग्मित मोती एक स्थानीय संकेत स्रोत प्रदान करने के लिए दिल के पास रखा जा सकता है. साथ में, इन लाभों को इस तकनीक को गर्भावस्था के दूसरे सप्ताह से 8 वे सप्ताह का बढ़ता हुआ भ्रूण में विकास की प्रक्रिया के अध्ययन के लिए एक आदर्श विधि बनानेआईसी माउस दिल.
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्तमान संस्कृति प्रणाली भ्रूण माउस दिल के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण लाभ बन गया है. इस संस्कृति प्रणाली भी संस्कृति में चार दिनों के बाद, परिगलन की सीमित संकेत के साथ दौरे सिकुड़ना और कोरोनरी जाल, को बर?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम महत्वपूर्ण पांडुलिपि के पढ़ने और वित्तीय सहायता के लिए एनआईएच (अनुदान # R01HL061656) के लिए एंड्रिया Portbury धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| REAGENTS | |||
| Timed-pregnant mice | To be dissected at the embryonic stage of interest | ||
| PBS (1x) | |||
| DMEM | Cellgro | ||
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Growth factor-reduced Matrigel | BD Bioscience | 356231 | |
| Syto-16 | Invitrogen | S7578 | Used as directed in 13 |
| 24-well culture plate | Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| EQUIPMENT | |||
| Stereoscopic microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Cell culture incubator | Thermo | 3110 |
References
- Tu, S., Chi, N. C. Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects. Differentiation. 84, 4-16 (2012).
- Lavine, K. J., et al. Fibroblast growth factor signals regulate a wave of Hedgehog activation that is essential for coronary vascular development. Genes Dev. 20, 1651-1666 (2006).
- Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464, 549-553 (2010).
- Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation. Dev. Biol. 255, 334-349 (2003).
- Zhang, J., et al. The FGF-BMP signaling axis regulates outflow tract valve primordium formation by promoting cushion neural crest cell differentiation. Circ. Res. 107, 1209-1219 (2010).
- Pillekamp, F., et al. Establishment and characterization of a mouse embryonic heart slice preparation. Cellular Physiology and Biochemistry: international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 16, 127-132 (2005).
- Habeler, W., Peschanski, M., Monville, C. Organotypic heart slices for cell transplantation and physiological studies. Organogenesis. 5, 62-66 (2009).
- Janssen, P. M., Lehnart, S. E., Prestle, J., Hasenfuss, G. Preservation of contractile characteristics of human myocardium in multi-day cell culture. J. Mol. Cell Cardiol. 31, 1419-1427 (1999).
- Brandenburger, M., et al. Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium. Cardiovasc. Res. 93, 50-59 (2012).
- Weaver, M., Dunn, N. R., Hogan, B. L. Bmp4 and Fgf10 play opposing roles during lung bud morphogenesis. Development. , 127-2695 (2000).
- Viragh, S., Challice, C. E. The origin of the epicardium and the embryonic myocardial circulation in the mouse. Anat. Rec. 201, 157-168 (1981).
- Kirby, M. L. . Cardiac Development. , (2007).
- Arima, S., et al. Angiogenic morphogenesis driven by dynamic and heterogeneous collective endothelial cell movement. Development. 138, 4763-4776 (2011).
