Summary
Fare gelişim çalışmaları gebelik sırasında embriyonun erişilememesi tarafından engellenmektedir. Gebeliğin son aşamalarında embriyonik kalbin uzun vadeli bir kültür teşvik etmek için, eksize kalp, yarı-katı, seyreltik Matrigel kültüre edildiği bir protokolü geliştirilmiştir.
Abstract
Fare gelişim çalışmaları gebelik sırasında embriyonun erişilememesi tarafından engellenmektedir. Bu nedenle, protokoller izole etmek ve ilgi kültürü, tek tek organların hem de geliştirme değişiklikler ve görselleştirmek sağlayan yeni tedavi stratejileri için bir yöntem sağlamak üzere gereklidir. Gebeliğin son aşamalarında embriyonik kalbin uzun vadeli bir kültür teşvik etmek için, eksize kalp, yarı-katı, seyreltik Matrigel kültüre edildiği bir protokolü geliştirilmiştir. Bu yüzey üç boyutlu yapısını korumak için yeterli destek sağlar, ancak devam eden daralma izin verecek kadar esnektir. Kısaca, kalpler embriyo çıkarıldı ve soğuk Matrigel karışımı yerleştirilir büyüme ortamı ile 1:01 seyreltilmiştir. Seyreltilmiş Matrigel katılaşmasından sonra, büyüme ortamı kültür tabağına ilave edilir. Embriyonik gün 16,5 gibi geç çıkarıldı Kalpler dört gün sonrası diseksiyon için geçerli idi. Koroner pleksus Analiz Bu yöntem, etmediğini göstermektedirkoroner damar gelişimi bozabilir. Böylece, embriyonik kalplerin uzun dönemli kültür için yeni bir yöntem sunmaktadır.
Introduction
Son yıllarda, transgenik fare gelişimi kalp kusurları eğitim için baskın model sistem olmuştur. Ancak, Zebra balığı gibi diğer model organizmalar, fare üzerinde önemli avantajlara sahip kanıtlanmıştır. Zebra balığı üç ana avantajları embriyoların erişim kolaylığı için, yumurta dış döşeme olan, kalp gelişim kolay görüntüleme sağlayan embriyoların optik şeffaflık, ve küçük moleküler tedaviler uygulama kolaylığı embriyo gelişimi modüle 1. Böylece, bir embriyonik organı eski rahimde büyüme izin veren bir kültür tekniği gelişimi, en azından kısmen, sınırlama anda transgenik farenin gelişim süreçleri çalışan araştırmacılar tarafından yaşanan, etkisiz hale getirebilir.
Ex vivo kültür sistemleri kardiyak dif ne kadar küçük moleküller ve analiz ile muamele izin piliç ve fare embriyo hem de geliştirilmiştirKalbin lara bölgelerinde 2-6 iletişim. Bütün fare kalbinde bir kültür için, kalpler embriyonik için embriyolarından alınmış (E) yaş 12.5 sallanan 2,3,5 olan veya olmayan kültür ortamı içinde yerleştirilebilir. Bu tekniği kullanarak, embriyonik kalpleri başarıyla E13.5 en denklik için inkübe edilmiş ve sallanan ile kültür kalpleri sürece üç gün (E10.5 başlayarak) 3 olarak muhafaza edilmiş. Ancak, hiçbir çalışma eski embriyolardan kalplerin başarılı kültür bildirdin. Aynı şekilde, kurtarma deneyler, kültür ortamı 2 ile genel olarak terapötik ajanı uygulayarak sınırlı olmuştur.
Kalpler, eksize gömülü ve bir vibratome kullanarak kesitli edildiği bir dilim kültür sistemi, aynı zamanda E12.5 fare kalpleri ve Hamburger-Hamilton aşamasında 36 (yaklaşık E16 fare) civciv kalpleri her iki genç kalpler, için kullanılmıştır Bu doğum sonrası ve yetişkin fare saat olarak 2,4,6, ve eski kalpler,earts ve yetişkin insan kalpleri 7,8. Embriyonik analizleri genellikle 150 mikron kalınlığında kesitler 2,4 kullanılan olsa da, kesit kalınlığı oksijen yoksunluğu 8 kanıtı olmadan büyük 500 olarak mikron olabilir. Bu dilim kültürleri en dilimleri bu dönemde 9 boyunca kasılma bakımı ile, kültür iki ay sürece devam edilmiştir. Izole kardiyomiyositlerde çalışmalar ile karşılaştırıldığında, bu dilim kültürler komşu hücre tipleri ile kardiyomiyositlerinin ko-kültür izin ve ex vivo analizi için yararlı bir yöntem sağlar. Bununla birlikte, bu kültürler sadece kültür ortamı içinde bir kalp (örneğin, bir vibratome üzerinde kesit için canlı kalp gömme) yerleştirerek daha ayrıntılı bir set-up gerektirir ve herhangi bir analiz açıkça bölüm içindeki kalbin kısmı ile sınırlıdır.
Sınırlamaları kültür embriyonik fare kalpleri ve transgenik farelerin ava zenginliği için yukarıda açıklanan verilençalışma için ilable, biz Weaver tarafından geliştirilen bir ex vivo akciğer kültür sistemi benzer bir ex vivo fare kalp kültür sistemi geliştirdi, ve ark. 10. Bizim kültür sistemi bütün embriyonik fare kalplerinde yeniden koroner dolaşım uzun süreli kültür ve görselleştirme izin verir. Buna ek olarak, Matrigel kullanımı, böylece terapötik maddeler ile bir lokal tedavi sağlayan, boncuk kalp yakın bir yerde tutulabilir sağlar. Bu deneyler, örneğin koroner arter oluşumu gibi bir proses ile ilgili belirli bir tedavinin etkisini karşılaştırmak için farklı gelişimsel zaman noktalarında gerçekleştirilebilir. Küçük moleküllerin Matrigel difüzyonuna olduğundan, bu kültür sistemi, aynı zamanda belirli bir hücre-hücre temas bazı gelişim süreçleri için gerekli ya da başka bir bölgeden parakrin sinyal olup olmadığını olup olmadığını belirlemek için birbirlerine yakın kalp kültürü parçalara bölgeleri için kullanılabilir gerekli değildir.
Bu kültür sisteminispeten basit ve kesit kültürü sisteminden farklı olarak, temel kültür çoğu laboratuar reaktifler ve hazır olan set-up kullanır. Kısaca, kalpler kesilen embriyonik bir yarı-katı bir destek içerir, seyreltik Matrigel kültürlenmiştir. Bu destek, kalbin büzülmesine izin verirken, kalbin üç boyutlu morfolojisi korumak için yeterlidir. Bu sistemi kullanarak, eski bir fare embriyoları (E14.5-E16.5) gelen bütün kalpleri dört gün için kültür korunabilir. Tüm koroner pleksus dilim kültürlerde farklı, tutulan, bu nedenle kalbin farklı bölgelerinden meydana gelen sinyal ipuçları mevcut kalır. Ayrıca, canlı hücre floresan boyalar canlı kalbin görüntülenmesi izin vermek için, Matrigel nüfuz edebilir, ve protein ile konjüge boncuk lokalize bir sinyal kaynağı sağlamak için kalp yakın yerleştirilebilir. Birlikte, bu avantajları bu teknik embriyo gelişim süreçlerini incelemek için ideal bir yöntem yapmakic fare kalp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Embriyonik Kalpler eksize
- Onaylanmış bir ötenazi tekniği kullanarak istenen embriyonik gün bir zamanlı hamile fare Euthanize. Tüm deneyler Chapel Hill'deki North Carolina Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır.
- Liberal diseksiyon önce% 70 etanol ile kadın sprey. Uterin boynuz almak ve tüketim için dişinin karın boşluğuna açın.
- Soğuk 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ve gerektiğinde durulama içeren bir Petri kabındaki uterin horn yerleştirin. Ekli embriyonik kesesi ortaya çıkarmak için orta hat üzerinden uterin horn açın kesin.
- Bir embriyonik kese açık kesin ve bir embriyo almak. Soğuk PBS ile ikinci bir Petri tabağına yerleştirin embriyo. Buz rahim boynuz ile Petri kabı dönün.
- Göğüs duvarı erişimi artırmak için embriyo başını kesmek. Genotiplendirme gerekli ise, çıkarın ve buz üzerinde yerleştirilen bir Eppendorf tüp kuyruk kaydedin.
- Ilesırtında embriyo, kalp ve akciğer görselleştirmek için göğüs duvarı açın kesti. Sahne bağlı olarak, göğüs duvarı şeffaf olabilir.
- Dikkatlice forseps kullanarak kalp kaldırın ve aşağıdaki damarları kesti. Daha sonra, kalp boşaltmak için büyük damarların üzerinde kesti. Gerekirse, yabancı dokuları çıkarın.
- Soğuk PBS ile doldurulmuş, 24 kuyulu bir çanak iyi birinin kalp koyun ve buz üzerine kabı yerleştirin.
- Kalpleri tüm embriyolardan eksize edilmiştir kadar önceki adımları tekrarlayın.
2. Kültür Kurulum
- Laminar bir başlık olarak, 1:1 oranında soğuk Matrigel ve istenen kültür ortamı (Dulbecco'nun Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM), örneğin,% 10 fetal sığır serumu (FBS)) birleştirir. Ön ısıtma kültür ortamı yok.
- Buz, aynı zamanda buz üzerinde muhafaza edilir ve bir 24-çukurlu kültür çanağı bir kuyuya seyreltilmiş bir çözelti pipetle 500-1.000 ul seyreltilmiş Matrigel üzerinde tutulması.
- Kaputu, dikkatli almak ve eksize yerMatrigel içeren kültür çanak bir de kalp buz üzerinde kültür çanak tutarken.
- Gömülü kalp yönü önemli ise: Liberal% 70 etanol ile ters bir mikroskop ve çevresindeki alan sprey. Kaputu, ise hala buz üzerinde Matrigel içeren kültür plaka bir kuyuda eksize kalp yerleştirin. Daha sonra, bir mikroskop plaka yerleştirin ve hızlı bir şekilde yönlendirmek eksize kalp Matrigel katılaşmaya başlar.
- Bir nemlendirilmiş 37 ° C inkübatör (% 5 CO2) içinde kültür tabağına yerleştirin ve Matrigel yaklaşık 30 dakika boyunca katılaşmasını sağlar.
- Iyi bir kalp içeren her 1 ml önceden ısıtılmış kültür ortamı ekleyin.
- Kalpler en az dört gün boyunca kültür kalabilir. Kültür ortamı her iki günde bir değiştirilmesi tavsiye edilir.
3. Tespit ve Görselleştirme
- Arzu edildiği takdirde, canlı kalp görselleştirmek için (örneğin SYTO-16), bir floresan boya canlı hücre ekleyin. Fotoğraf olacakbu gömülü edildiği konumuna dayalı görünür kalbin tarafına sınırlı.
- Sonrası kültür analizleri (örneğin tüm montaj görüntüleme veya kesit) yapılacak ise, kültür ortamı çıkarın ve soğuk% 4 formaldehit ile değiştirin. 30 dakika boyunca buz üzerinde tabağına yerleştirin.
- Soğuk formaldehit ve buz Matrigel dağılması teşvik sonra, taze formaldehit ile (ve Matrigel) fiksatif yerine ve 4 gece kalpleri ° C düzeltmek
- 4 ° C kadar daha analizler de tampon (örneğin PBS veya Tris) ve mağaza ile kalpleri yıkayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu tekniği kullanarak, kalp üç boyutlu morfoloji korur ve canlı kalır, olarak devam kasılmalar (Film 1) ile gösterilir. Bu kasılmalar ventrikül daha kulakçıklar sürekli olarak daha belirgindir. Kültür ardından, kupa sabit ve işlenmiş özel işaretleyici ifade veya yapıları incelemek için immünhistokimya veya histoloji biri için. Şekil 1A sabit, 24 saat süre ile kültüre olan bir embriyonik fare kalp ventriküller ve büyük arterlerin taban gösterir ve için işlenebilir endotel etiketlemek için immünhistokimya. Bu konfokal mikroskop koroner damar utero (Şekil 1B) muhafaza bir nispeten yaşlı embriyo eksize bir kalp gibi görünür olduğunu göstermektedir. Ancak, kalp kültürlü ex vivo olarak koroner damar rahimde devam edildi kalbinde daha küçük görünür yapmak. Her iki kalplerinde, inciventriküllerin e uçlar dokuya antikorların daha iyi erişim sağlamak için uzaklaştırılmıştır.
4 d E16.5 ve kültürlü ex vivo olarak eksize kalplerin hematoksilen ve eozin (H & E) analizi gösteriyor ki büyük arterlerin duvarları (Şekil 2A) ve ventriküler ve interventriküler septum miyokard (Şekil 2B) dahil olmak üzere genel morfolojisi, kalp bozulmadan kalır. Dolaşım olmamasına rağmen, koroner ostiumunun (Şekil 2A) görülür. Bununla birlikte, DNA fragmantasyonu, H & E (Şekil 2A, 2B) ve DAPI (veri gösterilmemiştir) her iki gözlenen kompakt, miyosit ve büyük damarların etrafında belirgindir. Ex vivo kültür kalbi hala atıyor olsa da, intrauterin (Şekil 2C, 2D) gelişmiş bir E18.5 embriyo bir kalp ile karşılaştırıldığında daha fazla, miyokard daha az yoğundur. Bu nedenle, sınırlama uzunluğu vardırzamanı ya da aşaması hangi Bu kalpleri muhafaza edilebilir.
Bu teknik aynı zamanda kültür floresan kalplerinde kültür sırasında etiketlemek için kullanılabilir. Bu durumda, kalpler bir endotel spesifik floresan boya ile inkübe edildikten sonra, 48 saat boyunca kültürlenir. Bu örnek olarak, görselleştirme kalbin yönlendirme ve doku (Şekil 3A, 3B) opaklık göre sınırlıdır. Ancak, ventriküler miyokard ile sonraki histolojik bölümleri bu floresan molekülü ventrikül (Şekil 3C, 3D) içinde alt-epikardiyal damarların etiketlemek için dış hücre katmanları nüfuz edebilir onaylamak ve bu floresan boya (Şekil 3D) iso-lektin ile colocalizes.
Şekil 1. Geliştirme, ex vivo koşullarında normal görünür. (A) kültüründe 24 saat sonra, E14.5 embriyolardan ex vivo kalpleri, düzeltildi bir endotel işaretleyici (yeşil) ile etiketli, temizlenir ve konfokal mikroskobu ile görüntülenmiş. Pulmoner arter (PA), aort (AO), ve kalp tabanı gösterilmiştir. (B) 'in utero geliştirilen E15.5 embriyolar eksize Kalpler benzer şekilde işlenmiştir. Ölçek çubuğu, 100 mikron.
Şekil 2. Morfoloji ağır ex vivo kültür içinde muhafaza edilir. (A, B) Kalpler 4 gün boyunca E16.5 embriyoları ve ex vivo kültürlenmiş eksize edildi. Kalpler hematoksilen ve eozin (H & E) ile daha sonra kesitli ve lekeli. Aort (Ao) ve pulmoner arter (PA) uyum gösteren (A) enine bölüm. Koroner ostiumunun (ok başı) biri görülebilir. Miyokard suryuvarlama aort kontrol (C) daha az yoğun olduğu ve bazı nükleer parçalanma (ok) da mevcut. (B) ventrikül ve interventriküler septum (IVS) ve kompakt miyokard genel morfolojisi normal görünüyor, ancak miyokard kontrol (D) daha az yoğun olduğu ve bazı nükleer parçalanma (ok) IVS belirgindir. (C, D) Karşılaştırma için, frontal H & bir E18.5 kalpten E-lekeli bölümleri gösterilmiştir. (C) koroner ostium Ao (ok başı) bitişik görülmektedir. (D) septum iyi tanımlanmıştır. Ölçek çubuğu, 70 mikron.
Şekil 3, ikinci. Ex vivo kalplerinde floresan kültürü içinde 48 saat sonra, kültür sırasında. (A, B) etiketlenebilir, ex vivo kalplerE16.5 embriyolar, 1 saat boyunca 16 SYTO (yeşil) ile inkübe edildi, ve floresan inkübasyondan sonra, 48 saat kadar geç gözlenebilir. (C, D), bu floresans dondurulmuş kesit boyunca muhafaza edildi ve subepikardiyal epitel hücrelerinde olabilir ventriküler miyokard içinde. D ise, ventriküler miyokardın içindeki bölümü (kırmızı) izo-lektin ile birlikte-etiketlendi. Iso-lektin ortak etiketleri yeşil SYTO 16-pozitif hücreler (oklar) ve aynı zamanda SYTO 16 ile boyandı değildi miyokard içinde gemiler etiketler. AB, 4x büyütme, CD ölçek çubuğu, 120 mikron.
Film 1. 30 saat ex vivo kültür sonra, bir E14.5 embriyo eksize bir kalp kulakçıklar ve karıncıklar arasında tutarlı kasılma ve kalp pili gösterir. filmi görmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mevcut kültür sistemi embriyonik fare kalp çalışmalar için önemli avantajlar teşkil etmektedir. Bu kültür sistemi bile kültüründe dört gün sonra, nekroz sınırlı işaretleri ile miyokardiyal kasılma ve koroner pleksus, korur. Bundan başka, yan-katı matris kültürü sırasında yerinde kaplanmış boncuklar tutmak için, aynı zamanda sözleşmesi esneklik sağlayan ve geliştirme sırasında kalbin üç boyutlu morfolojisi korumak için yeterli destek sağlar. Bu destek rağmen, bu matris, canlı kalbin floresan analizi sağlayan, örneğin SYTO 16 gibi floresan boyalar için geçirgendir.
Dilim kültür yöntemleri kılcal hareket ile 7 arasındaki oksijen sağlamak için bir hava-sıvı arayüzü gözenekli bir zar üzerinde, koroner pleksus olan bölümünü içeren, kalp bölümüne yerleştirin. Buna karşılık, önceki bütün kalp kültür yöntemleri fonksiyonel bir koroner vasculat önce embriyonik yaş için sallanan ve sınırlı çalışmalar güveniyorure 2,3,5 gereklidir. Koroner pleksus bir hava-sıvı arayüzü ek karmaşıklık olmadan oluşturulabilir sonra mevcut tekniği kullanarak, ancak, kalpler kolaylıkla kültürlenebilir.
Geç embriyonik kalpler (örn. E16.5) kültürde uzun bir süre sonra nekrotik olacağı endişeleri rağmen, sadece sınırlı nekroz kültürü dört günde (yani, doğum sonrası 1. günde kalp eşdeğer) sonra gözlemlenmiştir. Orijinal protokolü olarak embriyonik akciğer tomurcukları kullanılarak gerçekleştirilir, 10 daha önce aşamalı embriyolardan nekroz değil, aynı zamanda kullanılan akciğer Min. Bu nedenle, nekroz önce embriyonik zaman noktalarında çalışmalar kısıtlayarak önlenebilir.
Bu ex vivo kültür sistemi kısıtları var. Kültür içinde iki günden sonra epikardiyum başlar matrisine yayılması, ve dört gün içinde, epikardiyum kültür tabağına bağlanır. Çünkü epikardiyal akıbet does görselleştirme etkilemez, ancak, bu konuda epikardiyal çalışmalara birincil öneme sahip olabilir. Böylece, kendi akıbet koroner pleksus üzerinde olumsuz etkileri olduğu görünmüyor; aşamalarında (E14.5-E16.5), epikarda kalbi 11 kapsayan ve gelişmekte olan pleksus 12 sinyal sağladığı uzun zamandan beri var burada analiz. Ayrıca, kültür kalpleri kendi utero meslektaşları gibi büyük büyüyen durdurmak için görünür. Başka bir sınırlama embriyonik fare kalp Zebra balığı embriyo gibi şeffaf olmasıdır. Herhangi bir canlı görselleştirme böylece kalbin dış katmanlar üzerinde görülebilir ne ile sınırlıdır. Ancak, canlı endotel işaretleyici yeterince koroner pleksus bazı etiket için kalp nüfuz ve kültür görülebilir olabilir.
Bu kısıtlamalara rağmen, bu ex vivo kültür yöntemi bir dizi uygulamalar için yararlı olacağını tahmin ediyoruz. Transgenik farelerin çeşitli çizgiler o arabary floresan etiketli hücre tipleri kolayca zaman atlamalı görüntüleme kullanarak geliştirme farklı yönlerini değerlendirmek için kullanılabilir. Ayrıca, küçük molekül bileşikleri ile embriyonik kalpleri ex vivo tedavi, klinik kullanımda yeni ya da zaten, gerçekleştirmek için kolay ve ilaç tedavileri insanlarda nasıl uygulandığını taklit olup.
Sonuç olarak, biz embriyonik fare kalp için bir ex vivo kültür yöntemi adapte var. Bu teknik geliştirme sırasında, örneğin karaciğer veya böbrek aksi ulaşılmaz organları, kolay erişim sağlayacak ve bu organların manipülasyon ve canlı analiz için izin verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Biz kritik yazının okuma ve finansman desteği için NIH (hibe # R01HL061656) için Andrea Portbury teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Timed-pregnant mice | To be dissected at the embryonic stage of interest | ||
| PBS (1x) | |||
| DMEM | Cellgro | ||
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Growth factor-reduced Matrigel | BD Bioscience | 356231 | |
| Syto-16 | Invitrogen | S7578 | Used as directed in 13 |
| 24-well culture plate | Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| EQUIPMENT | |||
| Stereoscopic microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Cell culture incubator | Thermo | 3110 | |
References
- Tu, S., Chi, N. C. Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects. Differentiation. 84, 4-16 (2012).
- Lavine, K. J., et al. Fibroblast growth factor signals regulate a wave of Hedgehog activation that is essential for coronary vascular development. Genes Dev. 20, 1651-1666 (2006).
- Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464, 549-553 (2010).
- Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation. Dev. Biol. 255, 334-349 (2003).
- Zhang, J., et al. The FGF-BMP signaling axis regulates outflow tract valve primordium formation by promoting cushion neural crest cell differentiation. Circ. Res. 107, 1209-1219 (2010).
- Pillekamp, F., et al. Establishment and characterization of a mouse embryonic heart slice preparation. Cellular Physiology and Biochemistry: international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 16, 127-132 (2005).
- Habeler, W., Peschanski, M., Monville, C. Organotypic heart slices for cell transplantation and physiological studies. Organogenesis. 5, 62-66 (2009).
- Janssen, P. M., Lehnart, S. E., Prestle, J., Hasenfuss, G. Preservation of contractile characteristics of human myocardium in multi-day cell culture. J. Mol. Cell Cardiol. 31, 1419-1427 (1999).
- Brandenburger, M., et al. Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium. Cardiovasc. Res. 93, 50-59 (2012).
- Weaver, M., Dunn, N. R., Hogan, B. L. Bmp4 and Fgf10 play opposing roles during lung bud morphogenesis. Development. , 127-2695 (2000).
- Viragh, S., Challice, C. E. The origin of the epicardium and the embryonic myocardial circulation in the mouse. Anat. Rec. 201, 157-168 (1981).
- Kirby, M. L. Cardiac Development. , Oxford University Press. (2007).
- Arima, S., et al. Angiogenic morphogenesis driven by dynamic and heterogeneous collective endothelial cell movement. Development. 138, 4763-4776 (2011).
