Yeni Bir<em> Ex vivo</emEmbriyonik Fare Kalp için> Kültür Yöntemi
Summary
Fare gelişim çalışmaları gebelik sırasında embriyonun erişilememesi tarafından engellenmektedir. Gebeliğin son aşamalarında embriyonik kalbin uzun vadeli bir kültür teşvik etmek için, eksize kalp, yarı-katı, seyreltik Matrigel kültüre edildiği bir protokolü geliştirilmiştir.
Abstract
Fare gelişim çalışmaları gebelik sırasında embriyonun erişilememesi tarafından engellenmektedir. Bu nedenle, protokoller izole etmek ve ilgi kültürü, tek tek organların hem de geliştirme değişiklikler ve görselleştirmek sağlayan yeni tedavi stratejileri için bir yöntem sağlamak üzere gereklidir. Gebeliğin son aşamalarında embriyonik kalbin uzun vadeli bir kültür teşvik etmek için, eksize kalp, yarı-katı, seyreltik Matrigel kültüre edildiği bir protokolü geliştirilmiştir. Bu yüzey üç boyutlu yapısını korumak için yeterli destek sağlar, ancak devam eden daralma izin verecek kadar esnektir. Kısaca, kalpler embriyo çıkarıldı ve soğuk Matrigel karışımı yerleştirilir büyüme ortamı ile 1:01 seyreltilmiştir. Seyreltilmiş Matrigel katılaşmasından sonra, büyüme ortamı kültür tabağına ilave edilir. Embriyonik gün 16,5 gibi geç çıkarıldı Kalpler dört gün sonrası diseksiyon için geçerli idi. Koroner pleksus Analiz Bu yöntem, etmediğini göstermektedirkoroner damar gelişimi bozabilir. Böylece, embriyonik kalplerin uzun dönemli kültür için yeni bir yöntem sunmaktadır.
Introduction
Son yıllarda, transgenik fare gelişimi kalp kusurları eğitim için baskın model sistem olmuştur. Ancak, Zebra balığı gibi diğer model organizmalar, fare üzerinde önemli avantajlara sahip kanıtlanmıştır. Zebra balığı üç ana avantajları embriyoların erişim kolaylığı için, yumurta dış döşeme olan, kalp gelişim kolay görüntüleme sağlayan embriyoların optik şeffaflık, ve küçük moleküler tedaviler uygulama kolaylığı embriyo gelişimi modüle 1. Böylece, bir embriyonik organı eski rahimde büyüme izin veren bir kültür tekniği gelişimi, en azından kısmen, sınırlama anda transgenik farenin gelişim süreçleri çalışan araştırmacılar tarafından yaşanan, etkisiz hale getirebilir.
Ex vivo kültür sistemleri kardiyak dif ne kadar küçük moleküller ve analiz ile muamele izin piliç ve fare embriyo hem de geliştirilmiştirKalbin lara bölgelerinde 2-6 iletişim. Bütün fare kalbinde bir kültür için, kalpler embriyonik için embriyolarından alınmış (E) yaş 12.5 sallanan 2,3,5 olan veya olmayan kültür ortamı içinde yerleştirilebilir. Bu tekniği kullanarak, embriyonik kalpleri başarıyla E13.5 en denklik için inkübe edilmiş ve sallanan ile kültür kalpleri sürece üç gün (E10.5 başlayarak) 3 olarak muhafaza edilmiş. Ancak, hiçbir çalışma eski embriyolardan kalplerin başarılı kültür bildirdin. Aynı şekilde, kurtarma deneyler, kültür ortamı 2 ile genel olarak terapötik ajanı uygulayarak sınırlı olmuştur.
Kalpler, eksize gömülü ve bir vibratome kullanarak kesitli edildiği bir dilim kültür sistemi, aynı zamanda E12.5 fare kalpleri ve Hamburger-Hamilton aşamasında 36 (yaklaşık E16 fare) civciv kalpleri her iki genç kalpler, için kullanılmıştır Bu doğum sonrası ve yetişkin fare saat olarak 2,4,6, ve eski kalpler,earts ve yetişkin insan kalpleri 7,8. Embriyonik analizleri genellikle 150 mikron kalınlığında kesitler 2,4 kullanılan olsa da, kesit kalınlığı oksijen yoksunluğu 8 kanıtı olmadan büyük 500 olarak mikron olabilir. Bu dilim kültürleri en dilimleri bu dönemde 9 boyunca kasılma bakımı ile, kültür iki ay sürece devam edilmiştir. Izole kardiyomiyositlerde çalışmalar ile karşılaştırıldığında, bu dilim kültürler komşu hücre tipleri ile kardiyomiyositlerinin ko-kültür izin ve ex vivo analizi için yararlı bir yöntem sağlar. Bununla birlikte, bu kültürler sadece kültür ortamı içinde bir kalp (örneğin, bir vibratome üzerinde kesit için canlı kalp gömme) yerleştirerek daha ayrıntılı bir set-up gerektirir ve herhangi bir analiz açıkça bölüm içindeki kalbin kısmı ile sınırlıdır.
Sınırlamaları kültür embriyonik fare kalpleri ve transgenik farelerin ava zenginliği için yukarıda açıklanan verilençalışma için ilable, biz Weaver tarafından geliştirilen bir ex vivo akciğer kültür sistemi benzer bir ex vivo fare kalp kültür sistemi geliştirdi, ve ark. 10. Bizim kültür sistemi bütün embriyonik fare kalplerinde yeniden koroner dolaşım uzun süreli kültür ve görselleştirme izin verir. Buna ek olarak, Matrigel kullanımı, böylece terapötik maddeler ile bir lokal tedavi sağlayan, boncuk kalp yakın bir yerde tutulabilir sağlar. Bu deneyler, örneğin koroner arter oluşumu gibi bir proses ile ilgili belirli bir tedavinin etkisini karşılaştırmak için farklı gelişimsel zaman noktalarında gerçekleştirilebilir. Küçük moleküllerin Matrigel difüzyonuna olduğundan, bu kültür sistemi, aynı zamanda belirli bir hücre-hücre temas bazı gelişim süreçleri için gerekli ya da başka bir bölgeden parakrin sinyal olup olmadığını olup olmadığını belirlemek için birbirlerine yakın kalp kültürü parçalara bölgeleri için kullanılabilir gerekli değildir.
Bu kültür sisteminispeten basit ve kesit kültürü sisteminden farklı olarak, temel kültür çoğu laboratuar reaktifler ve hazır olan set-up kullanır. Kısaca, kalpler kesilen embriyonik bir yarı-katı bir destek içerir, seyreltik Matrigel kültürlenmiştir. Bu destek, kalbin büzülmesine izin verirken, kalbin üç boyutlu morfolojisi korumak için yeterlidir. Bu sistemi kullanarak, eski bir fare embriyoları (E14.5-E16.5) gelen bütün kalpleri dört gün için kültür korunabilir. Tüm koroner pleksus dilim kültürlerde farklı, tutulan, bu nedenle kalbin farklı bölgelerinden meydana gelen sinyal ipuçları mevcut kalır. Ayrıca, canlı hücre floresan boyalar canlı kalbin görüntülenmesi izin vermek için, Matrigel nüfuz edebilir, ve protein ile konjüge boncuk lokalize bir sinyal kaynağı sağlamak için kalp yakın yerleştirilebilir. Birlikte, bu avantajları bu teknik embriyo gelişim süreçlerini incelemek için ideal bir yöntem yapmakic fare kalp.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mevcut kültür sistemi embriyonik fare kalp çalışmalar için önemli avantajlar teşkil etmektedir. Bu kültür sistemi bile kültüründe dört gün sonra, nekroz sınırlı işaretleri ile miyokardiyal kasılma ve koroner pleksus, korur. Bundan başka, yan-katı matris kültürü sırasında yerinde kaplanmış boncuklar tutmak için, aynı zamanda sözleşmesi esneklik sağlayan ve geliştirme sırasında kalbin üç boyutlu morfolojisi korumak için yeterli destek sağlar. Bu destek rağmen, bu matris, canlı ka…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz kritik yazının okuma ve finansman desteği için NIH (hibe # R01HL061656) için Andrea Portbury teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| REAGENTS | |||
| Timed-pregnant mice | To be dissected at the embryonic stage of interest | ||
| PBS (1x) | |||
| DMEM | Cellgro | ||
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Growth factor-reduced Matrigel | BD Bioscience | 356231 | |
| Syto-16 | Invitrogen | S7578 | Used as directed in 13 |
| 24-well culture plate | Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| EQUIPMENT | |||
| Stereoscopic microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Cell culture incubator | Thermo | 3110 |
References
- Tu, S., Chi, N. C. Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects. Differentiation. 84, 4-16 (2012).
- Lavine, K. J., et al. Fibroblast growth factor signals regulate a wave of Hedgehog activation that is essential for coronary vascular development. Genes Dev. 20, 1651-1666 (2006).
- Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464, 549-553 (2010).
- Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation. Dev. Biol. 255, 334-349 (2003).
- Zhang, J., et al. The FGF-BMP signaling axis regulates outflow tract valve primordium formation by promoting cushion neural crest cell differentiation. Circ. Res. 107, 1209-1219 (2010).
- Pillekamp, F., et al. Establishment and characterization of a mouse embryonic heart slice preparation. Cellular Physiology and Biochemistry: international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 16, 127-132 (2005).
- Habeler, W., Peschanski, M., Monville, C. Organotypic heart slices for cell transplantation and physiological studies. Organogenesis. 5, 62-66 (2009).
- Janssen, P. M., Lehnart, S. E., Prestle, J., Hasenfuss, G. Preservation of contractile characteristics of human myocardium in multi-day cell culture. J. Mol. Cell Cardiol. 31, 1419-1427 (1999).
- Brandenburger, M., et al. Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium. Cardiovasc. Res. 93, 50-59 (2012).
- Weaver, M., Dunn, N. R., Hogan, B. L. Bmp4 and Fgf10 play opposing roles during lung bud morphogenesis. Development. , 127-2695 (2000).
- Viragh, S., Challice, C. E. The origin of the epicardium and the embryonic myocardial circulation in the mouse. Anat. Rec. 201, 157-168 (1981).
- Kirby, M. L. . Cardiac Development. , (2007).
- Arima, S., et al. Angiogenic morphogenesis driven by dynamic and heterogeneous collective endothelial cell movement. Development. 138, 4763-4776 (2011).
