Summary
Photothrombosis es una técnica rápida, mínimamente invasivo para la inducción de infarto pequeño y bien delimitado en áreas de interés de una manera altamente reproducible. Es especialmente adecuado para el estudio de las respuestas celulares y moleculares que subyacen a la plasticidad cerebral en ratones transgénicos.
Abstract
El modelo de carrera photothrombotic pretende inducir un daño isquémico dentro de un área cortical determinado a través de la foto-activación de un tinte sensible a la luz inyectada previamente. Después de la iluminación, el colorante se activa y produce oxígeno singlete que los componentes de daños de las membranas celulares endoteliales, con la agregación de plaquetas y la posterior formación de trombos, lo que finalmente determina la interrupción del flujo sanguíneo local. Este enfoque, propuesto inicialmente por Rosenblum y El-Sabban en 1977, fue mejorado más adelante por Watson en 1985 en cerebro de rata y establece la base del modelo actual. Además, el aumento de la disponibilidad de líneas de ratones transgénicos contribuyó a aumentar el interés en el modelo photothrombosis. En pocas palabras, un colorante fotosensible (Rosa de Bengala) se inyecta por vía intraperitoneal y entra en el torrente sanguíneo. Cuando está iluminado por una fuente de luz fría, el colorante se convierte en activa e induce daño endotelial con la activación plaquetaria y la trombosis, lo que resulta en localesla interrupción del flujo sanguíneo. La fuente de luz se puede aplicar en el cráneo intacto sin necesidad de craneotomía, que permite la orientación de cualquier área cortical de interés de una manera reproducible y no invasiva. El ratón se sutura y se deja despertar. La evaluación del daño isquémico se puede lograr rápidamente por cloruro de trifenil-tetrazolio o tinción con violeta de cresilo. Esta técnica produce infarto de pequeño tamaño y los límites bien delimitados, lo cual es muy ventajoso para la caracterización precisa celular o estudios funcionales. Además, es particularmente adecuado para el estudio de las respuestas celulares y moleculares que subyacen a la plasticidad cerebral en ratones transgénicos.
Introduction
A principios del siglo 21, el ictus isquémico es una enfermedad devastadora que representa la segunda causa de discapacidad a largo plazo 1 y la segunda causa de mortalidad en todo el mundo, en los que accidentes cerebrovasculares ocuparon alrededor de 5,7 millones de muertes en 2004 2. A pesar de los muchos esfuerzos que se pusieron en, todavía no existe un tratamiento eficaz para mejorar la recuperación funcional después del accidente cerebrovascular. Los modelos animales de accidente cerebrovascular son ampliamente utilizados en el campo de la investigación del accidente cerebrovascular, ya que permiten el modelado de la fisiopatología del daño isquémico y poner a prueba la eficacia de diferentes estrategias neuroprotectoras in vivo. La mayoría de estos modelos tienen por objeto inducir infartos extensos mediante la interrupción (temporal o permanentemente) el flujo de sangre dentro de la arteria cerebral media, mientras que se han desarrollado otros modelos para estudiar las lesiones de pequeño tamaño en áreas específicas, por lo general el motor y la corteza somatosensorial. Sin embargo, varios factores pueden contribuir a generar corriente alternaErtain grado de variabilidad en los estudios de accidente cerebrovascular experimental, incluyendo la cepa de ratón utilizado, la edad y el sexo de los animales incluidos en el estudio y, sobre todo, la técnica adoptó para inducir el daño isquémico. Con respecto a este último punto, la duración y la intensidad de la cirugía (es decir, la necesidad de una craneotomía), así como la habilidad quirúrgica requerida para el operador para inducir fiable una lesión isquémica son determinantes críticos para el éxito de e imparcial en el estudio in vivo accidente cerebrovascular .
El concepto de photothrombosis inicialmente fue propuesto por Rosenblum y El-Sabban en 1977 3 y se convirtió en famoso por su aplicación en cerebro de rata por Watson et al en 1985 4 en el que la técnica se mejoró en gran medida y establece la base de la corriente de modelo 3. - 6. El enfoque photothrombotic pretende inducir un infarto cortical a través de la foto-activación de un tinte sensible a la luz previamente entregada al sistema sanguíneo, quich da lugar a trombosis de los vasos locales en las áreas expuestas a la luz. Cuando el colorante de circulación se ilumina en la longitud de onda apropiada por una fuente de luz fría, se libera la energía a las moléculas de oxígeno, que a su vez generan una gran cantidad de productos de oxígeno singlete altamente reactivos. Estos intermedios de oxígeno inducen la peroxidación de la membrana celular endotelial, que conduce a la adhesión y agregación de plaquetas, y, finalmente, a la formación de trombos que determinan la interrupción de flujo local cerebral 7.
Photothrombosis es un modelo isquémico no canónica que no ocluir o romper una sola arteria como suele ocurrir en el accidente cerebrovascular humana, pero induce lesiones en los vasos más superficiales, lo que resulta en la interrupción selectiva del flujo sanguíneo en las áreas expuestas a la luz. Por esta razón, este enfoque puede ser adecuado para estudios celulares y moleculares de la plasticidad cortical. La ventaja principal de esta técnica reside en su simplicidad de ejecución.Por otra parte, photothrombosis se puede realizar fácilmente en aproximadamente cuarenta minutos por animal, incluida la espera de veinte minutos (3 min para la anestesia; 1 min a afeitar el cuero cabelludo; 3 a 5 min a colocar el animal en el aparato estereotáxico; 2 min para fregar la cuero cabelludo con una solución antiséptica, haga una incisión y limpiar el cráneo y de 2 a 4 minutos para colocar la fibra de luz fría, 1 min para inyectar la solución de rosa de Bengala, 5 min, espera para la difusión intraperitoneal, 15 min de la iluminación, y 5 min a limpiar la herida y suturar el animal). Además, no se necesita experiencia quirúrgica para llevar a cabo esta técnica ya que la lesión es inducida a través de simples iluminación del cráneo intacto. A diferencia de la oclusión arterial clásica, este método determina oclusiones selectivos de microvasos pial y intraparenquimatosa dentro de la zona irradiada y reduce la variabilidad entre las lesiones ya que ningún vaso colateral se deja para suministrar oxígeno en el área de orientación.
A pesar de su naturaleza particular, laacciones daños photothrombotic mecanismos esenciales que ocurre en el ictus cerebral. De manera similar a oclusión de la arteria en el accidente cerebrovascular humana, la agregación plaquetaria y la formación de coágulos determinan interrupción del flujo sanguíneo en el área irradiada 7. Del mismo modo, este modelo también comparte las respuestas inflamatorias esenciales como en la oclusión de la arteria cerebral media 8. Sin embargo, debido a los límites bien delimitada, la zona de penumbra, que corresponde a un área de metabolismo parcialmente conservado, es muy reducida o inexistente después de una lesión photothrombotic. Esta frontera clara puede facilitar el estudio de las respuestas celulares en el área cortical isquémica o intactos. Modelo de ratón Photothrombosis es particularmente adecuada para los estudios de accidente cerebrovascular en una variedad de animales transgénicos. De hecho los modelos clásicos no pueden caber a todas las cepas y los estudios de largo período en ratones C57BL / 6 cepa de ratón informó una alta relación de mortalidad que puede causar sesgo 9.
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Protocol
1. Pre-cirugía
- Pesar Rosa de Bengala en un tubo de 1,5 ml y se disuelven en solución salina estéril hasta alcanzar una concentración final de 15 mg / ml. Filtrar esterilizar a través de un filtro de 0,2 micras y almacenar en la oscuridad a temperatura ambiente hasta por dos meses.
- Esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos en autoclave. El área quirúrgica debe ser desinfectado menos de una hora antes de iniciar la cirugía.
- Registre el peso corporal del ratón para ajustar la dosis de Rosa de Bengala a inyectar. Hemos inyectado 10 l / g de peso del animal en ratones hembras CD1 12 semanas de edad en el presente protocolo. La cantidad de Rosa de Bengala necesario para producir el tamaño de la lesión cortical deseada se puede determinar fácilmente en un conjunto separado de experimentos preliminares mediante pruebas de diferentes dosis (típicamente 2 l / g, 5 l / g o 10 l / g de peso corporal). Tenga en cuenta que la cantidad de Rosa de Bengala a inyectar es altamente dependiente de las condiciones del experimento, en particular del tipo de fuente de luzutilizado y la duración de la exposición a la luz. En el presente estudio, 10 l / g (150 mg / g) se encontró dosis a ser necesario para inducir photothrombosis después de la exposición a la luz durante 15 min, mientras que otros grupos informaron de que, o bien 50 mg / g 6,8 y 100 mg / g 10 inyección intraperitoneal fue suficiente para inducir una lesión photothrombotic.
2. Procedimiento Anestesia
- Anestesiar a los ratones con isoflurano en una cámara de inducción transparente (3,5-4% para la inducción, 1,5-2% para el mantenimiento) en 50% (v / v) oxygen/50% (v / v) mezcla de gas de monóxido de dinitrógeno. Anestesia gaseosa permite una llamada rápida de los animales y el nivel de gas anestésico se puede ajustar fácilmente. Alternativamente, los ratones también pueden ser anestesiados por una mezcla de ketamina-xilazina.
- Cuando se alcanza la anestesia profunda, retire el animal anestesiado de la cámara de inducción, colóquelo en el marco estereotáxico y mantener la anestesia con una máscara facial. Ajuste el isoflurane dosis para lograr un nivel de anestesia adecuado. Monitorear la frecuencia respiratoria durante todo el procedimiento y asegúrese de que es constante (40-60 respiraciones por minuto).
- Usa pellizcos del dedo del pie con el fin de garantizar que el animal es profundamente anestesiados.
- Aplicar pomada para los ojos, con el fin de evitar que los ojos se sequen.
- Insertar suavemente la sonda rectal para controlar la temperatura a lo largo de los procedimientos quirúrgicos. Ajuste la almohadilla de calefacción controlado por retroalimentación asociado para el mantenimiento de la temperatura del cuerpo del ratón a 37 ± 0,5 ° C.
3. Cirugía para la iluminación de la zona de destino
- Afeitar el cuero cabelludo ratón con una rasuradora eléctrica.
- Asegure bien la cabeza e inserte las barras de oído en el meato externo. Tenga cuidado de no dañar los tímpanos.
- Desinfectar la piel en la superficie con golpes de 70% de etanol y betadine usando hisopos de algodón alterna.
- Utilice un bisturí para realizar una incisión a lo largo de la línea media del ojo leVel hasta el cuello. Aplicar retractores de la piel para mantener el cráneo expuesto.
- Retraer con suavidad el periostio de los bordes del cráneo con un bisturí y dejar secar la superficie del cráneo con hisopos de algodón estériles. Identificar el bregma y lambda. Coloca una micropipeta de vidrio sobre el bregma como punto de referencia, a continuación, pasar a las coordenadas de la zona de interés. La región de interés elegido para este artículo es más o menos en forma de rotundamente, centrada aproximadamente 2 mm lateral a la bregma, y que cubre un área de aproximadamente 30 mm 2, que incluye una gran parte de la corteza sensitivomotora de acuerdo con el atlas de cerebro de ratón por Franklin y Paxinos 11.
- Marque la posición de interés con los puntos de referencia y poner fibra óptica en estrecho contacto con la superficie del cráneo para evitar la dispersión de la luz pero preste atención a no ejercer presión sobre él. El área iluminada puede ser restringido mediante la aplicación en el cráneo de una máscara con una pequeña abertura o una tapa de la punta de la fibra óptica GUIde.
4. Rosa de Bengala inyección y activación
- Cargar la solución de Rosa de Bengala en una jeringa de 1 ml y calcular la cantidad a inyectar de acuerdo con una dosis de 10 l / g de peso corporal.
- Proceder a una inyección intraperitoneal lento.
- Deje que el tinte difuso y entrar en el torrente sanguíneo. Después de 5 minutos, encienda el iluminador de luz fría. Evite la iluminación del animal por cualquier otra fuente de luz. Utilizamos iluminador de fibra óptica de 150 W intensidad.
- Después de 15 min de la iluminación, deje de exposición a la luz y suturar la herida. Cinco minutos de iluminación que ya producen de miocardio y 10 min es probablemente suficiente para obtener un efecto máximo 12. Con el fin de minimizar la variabilidad, se elige para iluminar durante 15 minutos.
5. Sutura
- Retire los retractores piel y aplicar una solución salina estéril para evitar la deshidratación.
- Cierre de la herida utilizando needl corte inversae y de la seda o hilo de sutura de nylon.
- Interrupción de suministro de anestesia, retire con cuidado el ratón del aparato estereotáxico y lo puso en una almohadilla caliente precalentada hasta que esté completamente despierto, y luego devolverlo a su jaula. La temperatura del cuerpo se debe monitorizar cuidadosamente a través de los procedimientos para limitar la variabilidad en la extensión del infarto. De acuerdo con la concentración y la vía de administración, Rosa de Bengala todavía puede ser detectada en el torrente sanguíneo durante varias horas después de la inyección 13. Prefiero la manta de calefacción para el calentamiento de la lámpara para evitar daños secundarios potenciales (Rosa de Bengala absorción de longitud de onda en el espectro de color verde).
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Representative Results
Este protocolo va a producir una lesión cortical que ya es visible en la disección de la corteza a simple vista (Figuras 1A-1C). La lesión photothrombotic desarrolla en superficiales y profundas capas corticales en el que el tejido es suficientemente translúcido para permitir la foto-activación de la Rosa de Bengala. Medición de la extensión del infarto cerebral se puede realizar rápidamente mediante la tinción histológica con cloruro de trifenil-tetrazolio (TTC) en tejido fresco o por cresil violeta después de la fijación en paraformaldehído al 4% (PFA). Antes de la incubación TTC, el cerebro recién disecado se coloca en una máquina de cortar el cerebro y se secciona en rebanadas de 1 mm de espesor (Figura 1C). TTC las etiquetas de tejido intacto en rojo mientras que la región infartada aparece pálido, que permite una medición precisa de la zona del infarto (Figuras 1D-1E). La zona de la isquemia incompleta definido como zona de penumbra es muy reducida o inexistente de acuerdo con el tamaño de la lesión.
Del mismo modo, la tinción con violeta de cresilo permite la identificación de las zonas infartadas no teñidas en comparación con el tejido circundante púrpura-teñido. La proliferación reactiva y la infiltración de células (que se produce durante la primera semana después de la lesión) también pueden ser evaluados (Figuras 2A1-2A2), así como la aparición de una cicatriz glial (figuras 2B1-2B2). El control negativo se lleva a cabo mediante la realización de la misma cirugía y la inyección de colorante, pero sin la exposición a la fuente de luz fría. La lesión es reproducible en el tamaño y la ubicación en diferentes puntos de tiempo después de la lesión (Figuras 3A-3B). El área de infarto generalmente alcanza su tamaño máximo por 4 a 6 horas después de Rosa de Bengala de inyección 14 y, posteriormente, se reduce rápidamente a partir de 2 días a 4 días después de la photothrombosis. La irradiación se produce en las capas más superficiales, pero los grandes vasos en las capas corticales profundas también podría estar ocluido debido a lade compresión provocada por la lesión 7. Es importante investigar la reproducibilidad de la lesión antes del tratamiento debido a que la distribución de la microvasculatura cerebral pial puede variar entre animales de diferentes edades o cepa.
Figura 1. Aspecto macroscópico de la lesión photothrombotical en cerebro de ratón CD1 4 días después photothrombosis. AB. Vista lateral y frontal. El infarto superficial (puntas de flecha) aparece como una región blanca visible a simple vista. C. El cerebro se coloca en máquina de cortar cerebral y se seccionaron rápidamente en secciones de 1 mm de espesor. DF. Medición de la extensión del infarto cerebral se puede lograr mediante tinción con TTC . El tejido necrótico dentro de la lesión trombótica es el carácterzado por la ausencia de tinción. Rebanadas coronales del cerebro se ilustra en la AC se representan en la extensión rostral caudal de D a F.
Figura 2. Evolución temporal Representante de daños photothrombotic. Coronal secciones de adultos C57BL / 6 de cerebro de ratón se tiñeron por cresil violeta. A1, A2. 7 días después de la lesión un alto número de células se reúne en el límite del infarto. B1, B2. A los 30, el volumen de la lesión muy reducido y la cicatriz glial se está formando. A2 y B2 son una gran ampliación de la A1 y B1, respectivamente. Las barras de escala: A1, B1: 1 A2 mm; B2: 0,5 mm.
Figura 3. Aspecto macroscópico del cerebro a los 2, 4 y 16 días después de photothrombosis. A. microfotografías de cerebros PFA-perfundidos, preparado para su posterior análisis inmunohistoquímico. Se resalta el área infartada (línea de trazos). B. Comparación de la superficie a los 2, 4 y 16 días después de la lesión. n = 4 en cada grupo. * P <0,05 (Student t-test).
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Discussion
Las modificaciones y sustituciones
Debido a su pico de absorción a 562 nm, un láser de luz verde de una lámpara de arco de xenón filtrada fue elegido originalmente para irradiar el fotosensible Rosa de Bengala. Aunque excitación láser mediada todavía se usaba recently5, puede ser reemplazado por la lámpara de luz fría que también aseguran excitación colorante 10,15. Cold fibras ópticas de luz son más fáciles de manipular y menos caro que las fuentes de láser. Sin embargo, hay que hacer notar que los láseres se utilizan comúnmente para orientar las arteriolas superficiales individuales después de una craneotomía para un recipiente in vivo específica de coagulación 10.
Entrega de colorante sensible se realiza normalmente mediante inyección en vena de la cola, lo que requiere algún tipo de formación para la obtención de resultados homogéneos y reproducibles. Por el contrario, la inyección intraperitoneal es más fácil de realizar y Rosa de Bengala es detectable en la corriente sanguínea unos pocos minutos después de 13. Phototh eficaztrombosis se puede lograr mediante la excitación del colorante 5 min después de la inyección intraperitoneal 8, sin embargo alta dosis intraperitoneal de Rosa de Bengala en rata mostró que la concentración plasmática del colorante seguir aumentando incluso 60 min después de la administración 13. Inyección intravenosa de infusión de Rosa de Bengala puede aumentar la reproducibilidad de la lesión 13, sin embargo, esta forma de administración puede estar asociada a la hipotensión en el caso de la infusión se lleva a cabo demasiado rápidamente (<1,5 min) o a alta concentración de colorante 5. Para evitar las fluctuaciones en la presión arterial, otras sustancias fotosensibles tales como eritrosina B se pueden utilizar para producir oclusiones de los vasos, sin embargo esta molécula se considera menos eficiente que el Rosa de Bengala para el mismo rango de concentración 5.
Los pasos críticos
Diferentes factores afectan tamaño de la lesión y la profundidad, tales como la concentración del colorante sensible, la latencia entre el colorante injectiy en la iluminación, la intensidad de la fuente de luz, el diámetro de la superficie iluminada, la duración de la exposición y la temperatura del cuerpo durante y después de la cirugía. El ángulo de la fuente de luz en el cráneo también puede influir en la forma del infarto. Una serie de experimentos preliminares debe llevarse a cabo para probar la reproducibilidad y para determinar la cantidad mínima de colorante y tiempo de irradiación que producen una lesión que afecta selectivamente el área de destino y / u obtener déficit de comportamiento significativo.
Limitaciones de la técnica
Esta técnica fue desarrollada con el fin de imitar el movimiento humano mediante la inducción de la agregación plaquetaria tal como se observa durante la isquemia cerebral 4. Sin embargo el daño photothrombotic difiere ligeramente de ictus humano. En primer lugar, la trombosis se activa en gran número de vasos en la zona iluminada, mientras que accidente cerebrovascular es causado típicamente por la interrupción del flujo de sangre dentro de un solo terminal de la arteria. ComoEn consecuencia, algunas regiones del cerebro, cuyo metabolismo está sólo parcialmente con el apoyo de la arteria sufrir la interrupción del flujo sanguíneo son inicialmente menos afectada, ya que pueden recibir el suministro de sangre por las arterias colaterales y no someterse a la muerte celular necrótica. Al contrario, el límite bien definido producido por resultados photothrombosis en una penumbra muy limitada, que es el principal objetivo de los agentes neuroprotectores después de la isquemia. También, en un subconjunto de pacientes con accidente cerebrovascular, la reperfusión se produce espontáneamente y puede provocar daños secundarios (incluyendo la lesión por reperfusión). Para estudiar este aspecto particular de la isquemia, los modelos de oclusión transitoria son más apropiado.
El patrón de miocardio en sí muestra algunas características que difieren de derrame cerebral humano. MRI muestra un desarrollo simultáneo del miocardio isquémico y edema vasogénico en gran lesión photothrombotic que el desarrollo del infarto isquémico prevalece sobre el edema vasogénico en human accidente cerebrovascular 16. Por el contrario, photothrombosis puede no ser adecuada para el estudio de los estudios de agente anti-trombóticos, debido al hecho de que de miocardio photothrombotic también se produce después del bloqueo de las plaquetas o la inhibición de la vía de coagulación intrínseca 17. De hecho se ha sugerido que en condiciones peculiares de la coagulación de plaquetas no era necesario para la oclusión photothrombotic en el que la interrupción de la integridad endotelial podría inducir edema y de compresión asociada de los vasos circundantes. Por otra parte en el mismo análisis de resonancia magnética estudio no mostró modificación del tamaño del infarto después del bloqueo de la función plaquetaria o el agotamiento de las plaquetas 17.
Importancia con respecto a los métodos existentes
Numerosos modelos bien estandarizados de isquemia permanente y transitoria, focal y global, inducida mecánicamente o químicamente, se desarrollaron en los roedores con el fin de imitar estrechamente la fisiopatología derrame cerebral humano y para desarrop nuevas estrategias neuroprotectoras. El photothrombosis como se presenta aquí es un modelo de isquemia focal permanente que induce una lesión consistente carrera del tamaño deseado en cualquier sitio cortical o subcortical de una manera muy reproducibles y mínimamente invasiva. Este modelo presenta una alta tasa de supervivencia que que alcanzó 100% en nuestros experimentos (25 animales), mientras que estudios más amplios obtuvieron 98,4% 18. La lesión photothrombotic se puede personalizar con el fin de afectar a una función precisa de acuerdo con el área de orientación y recuperación del comportamiento puede ser evaluado por múltiples pruebas 6,19. Además, este enfoque no es mucho tiempo, unos pocos caro y se puede aprender rápidamente, ya que no es técnicamente exigente en comparación con otros modelos, incluyendo el modelo de filamento. Además, la oclusión de los vasos se logra mediante la inducción de la formación local de trombos que son estructuralmente similares a los observados en el accidente cerebrovascular humana. Sin embargo, el enfoque photothrombotic también fue adaptada para producing oclusiones de la arteria cerebral media 20. El modelo de lesión anillo se desarrolló más tarde con el fin de obtener una penumbra más grande. Se compone de una iluminación bajo la forma de un círculo, en el centro de la cual región cortical del tejido viable está rodeado por un tejido dañado circular y compartir las características bioquímicas y moleculares de la penumbra isquémica 21,22. Las variantes de la técnica también están disponibles para la realización de ictus en el cerebro en desarrollo 23 o en el tejido subcortical 24.
En conclusión, photothrombosis es un modelo fácil de realizar isquémico con alta reproducibilidad. Además, es adecuado para una serie de estudios experimentales accidente cerebrovascular, en particular para la evaluación de la plasticidad cortical en respuesta a la lesión cerebral, tanto a nivel celular y molecular.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Damos las gracias a Annalisa Buffo sugerencias interesantes y comentarios, y Maurizio Grassano, Marina Boido y Ermira Pajaj para el rodaje. Este trabajo fue financiado por el FP7-MC-214003-2 (Marie Curie Initial Training Network AXREGEN) y la Compagnia di San Paolo, proyecto gliarep.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions and chemicals | |||
| Rose Bengal | Sigma, Italy | 330000 | |
| Isoflurane Vet | Merial | 103120022 | |
| Betadine | Asta Medica | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Surgical material and equipment | |||
| Fluosorber Filter | Havard apparatus | 340415 | |
| 150W fiber optic illuminator | Photonic | PL3000 | |
| Temperature Controller for Plate TCAT-2DF | Havard apparatus | 727561 | |
| Stereotaxic Instrument | Stoelting | 51950 | |
| Operating microscope | Takagi | OM8 | |
| Heating pad | |||
| Oxygen and nitrogen gas | |||
| Surgery Tools | World precision instrument | Optic fiber taps and mask are custom-made | |
References
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