Summary
Photothrombosis هو وسيلة سريعة وتقنية الحد الأدنى الغازية لإحداث احتشاء الصغيرة وكذلك بفواصل في المجالات ذات الاهتمام بطريقة استنساخه للغاية. انها مناسبة خاصة لدراسة الاستجابات الخلوية والجزيئية الكامنة وراء اللدونة الدماغ في الفئران المعدلة وراثيا.
Abstract
ويهدف نموذج السكتة الدماغية photothrombotic للحث على الأضرار الدماغية داخل منطقة القشرية يعطى عن طريق الصور تفعيل صبغة حساسة للضوء حقن سابقا. بعد إضاءة، يتم تنشيط الصبغة وينتج الأكسجين القميص أن مكونات أضرار من أغشية الخلايا البطانية، مع تراكم الصفائح الدموية وتكوين الجلطات اللاحقة، والذي يحدد في نهاية المطاف انقطاع تدفق الدم المحلية. تم تحسين هذا النهج، اقترح في البداية من قبل روزنبلوم وش الصبان في عام 1977، في وقت لاحق من قبل واطسون في عام 1985 في دماغ الفئران وتعيين أساس النموذج الحالي. أيضا، ساهمت زيادة توافر خطوط الماوس المعدلة وراثيا أخرى لرفع الفائدة على نموذج photothrombosis. لفترة وجيزة، يتم حقن صبغة حساس (روز البنغال) الغشاء البريتونى ويدخل مجرى الدم. عندما تضاء بواسطة مصدر ضوء بارد، يصبح صبغ تنشيط ويدفع الضرر البطانية مع تنشيط الصفائح الدموية وتخثر الدم، مما أدى إلى المحليةتدفق انقطاع الدم. يمكن تطبيقها مصدر الضوء على الجمجمة سليمة مع عدم وجود الحاجة من حج القحف، والذي يسمح استهداف أي منطقة القشرية ذات الاهتمام بطريقة متكررة وغير الغازية. ثم يتم خياطة الماوس وسمح ليستيقظ. تقييم الأضرار الدماغية يمكن أن يتحقق بسرعة عن طريق كلوريد ثلاثي فينيل-تترازوليوم أو الكريزيل تلطيخ البنفسجي. هذه التقنية تنتج احتشاء من صغر حجمها وحدودها جيدا محدد، وهو أمر مفيد للغاية لتوصيف خلية دقيقة أو دراسات وظيفية. وعلاوة على ذلك، انها مناسبة خاصة لدراسة الاستجابات الخلوية والجزيئية الكامنة وراء اللدونة الدماغ في الفئران المعدلة وراثيا.
Introduction
في بداية القرن 21th، السكتة الدماغية هو اضطراب المدمر الذي يمثل السبب الثاني للإعاقة على المدى الطويل (1) والسبب الثاني للوفيات في جميع أنحاء العالم، والتي تمثل في السكتة الدماغية لحوالي 5،7 مليون حالة وفاة في عام 2004 2. على الرغم من الجهود العديدة التي وضعت في، لا يوجد حتى الآن علاج فعال المتاحة لتحسين الانتعاش وظيفية بعد السكتة الدماغية. وتستخدم النماذج الحيوانية من السكتة الدماغية على نطاق واسع في مجال البحث السكتة الدماغية لأنها تسمح النمذجة من الفيزيولوجيا المرضية لنقص تروية الضرر واختبار فعالية استراتيجيات اعصاب مختلفة في الجسم الحي. معظم هذه النماذج تهدف للحث على احتشاء اسعة النطاق عن طريق قطع (مؤقتا أو بشكل دائم) تدفق الدم داخل الشريان الدماغي الأوسط، في حين تم تطوير نماذج أخرى لدراسة آفات صغيرة الحجم في مجالات محددة، وعادة المحرك والقشور الحسية الجسدية. ومع ذلك، قد العديد من العوامل التي تساهم في توليد التيار المتردددرجة ertain من التباين في الدراسات التجريبية السكتة الدماغية، بما في ذلك السلالة الماوس المستخدمة، والعمر والجنس من الحيوانات التي شملتها الدراسة، وقبل كل شيء، اعتمدت تقنية للحث على الأضرار الدماغية. فيما يتعلق بهذه النقطة الأخيرة، ومدة والغازية من عملية جراحية (أي الحاجة إلى حج القحف) فضلا عن مهارة الجراحية اللازمة للمشغل للحث موثوق آفة الدماغية هي العوامل الحاسمة لنجاح وغير متحيزة في الدراسة المجراة السكتة الدماغية .
مفهوم photothrombosis واقترح في البداية من قبل روزنبلوم وش الصبان في عام 1977 3 وأصبحت مشهورة من خلال تطبيقه في دماغ الفئران من قبل واتسون وآخرون في عام 1985 في 4 والتي تم تحسين تقنية إلى حد كبير وتعيين أساس النموذج الحالي 3 - 6. ويهدف النهج photothrombotic للحث على احتشاء القشرية من خلال الصورة تفعيل صبغة حساسة للضوء تسليمها مسبقا في نظام الدم، WHالتراث الثقافي غير المادي يؤدي إلى تخثر الأوعية المحلية في المناطق المعرضة للضوء. عندما يضيء الصبغة المنتشرة في الطول الموجي المناسب من مصدر ضوء بارد، فإنه يطلق الطاقة إلى جزيئات الأكسجين، والتي بدورها تولد كمية كبيرة من الأكسجين شديدة التفاعل منتجات القميص. هذه وسيطة الأكسجين لحث الخلية البطانية بيروكسيد الغشاء، مما يؤدي إلى التصاق الصفائح الدموية وتجميعها، وفي نهاية المطاف إلى تشكيل الجلطة الدموية التي تحدد محلية انقطاع تدفق الدماغي 7.
Photothrombosis هو نموذج الدماغية غير المقبول أن لا تسد الشريان أو كسر واحد فقط كما يحدث عادة في السكتة الدماغية الإنسان، ولكن يحرض الآفات في الأوعية أكثر سطحية، والذي ينتج في انقطاع الانتقائي لتدفق الدم في المناطق المعرضة للضوء. لهذا السبب، قد تكون مناسبة هذا النهج للدراسات الخلوية والجزيئية من اللدونة القشرية. والميزة الرئيسية لهذه التقنية تكمن في بساطته التنفيذ.وعلاوة على ذلك، photothrombosis لا يمكن أن يؤديها بسهولة في ما يقرب من أربعين دقيقة لكل حيوان، بما في ذلك الانتظار عشرين دقيقة (3 دقائق للتخدير؛ 1 دقيقة حلق فروة الرأس؛ 3-5 دقيقة إلى وضع الحيوان على جهاز التجسيمي؛ 2 دقيقة لتنظيف فروة الرأس بمحلول مطهر، وجعل شق وتنظيف الجمجمة؛ 2-4 دقيقة لوضع الألياف الباردة الخفيفة؛ 1 دقيقة لحقن محلول البنغال روز؛ 5 مين الانتظار لنشرها داخل الصفاق؛ 15 دقيقة من الإضاءة؛ و 5 دقائق لل تنظيف الجرح وخياطة الحيوان). وعلاوة على ذلك، ليس هناك حاجة إلى الخبرة الجراحية لأداء هذه التقنية كما هو فعل الآفة من خلال إضاءة بسيطة من الجمجمة سليمة. على عكس انسداد الشرايين الكلاسيكية، ويحدد هذا الأسلوب الانتقائي للانسداد microvessels حنوني وintraparenchymal داخل المنطقة المعرضة للإشعاع ويقلل من التباين بين الآفات كما هو ترك أي سفينة ضمانات لتوريد الأكسجين في المنطقة المستهدفة.
على الرغم من طبيعته وجه الخصوص،أسهم الضرر photothrombotic الآليات الأساسية التي تحدث في الدماغ السكتة الدماغية. وبالمثل لانسداد شريان في المخ البشري، تراكم الصفائح الدموية وتكوين جلطة تحديد انقطاع تدفق الدم في المنطقة المعرضة للإشعاع 7. وبالمثل، وأسهم هذا النموذج أيضا الاستجابات الالتهابية الأساسية كما هو الحال في وسط انسداد الشريان الدماغي 8. ومع ذلك، ونظرا للحدود جيدا ترسيم الرف القاري، والمنطقة الناقص، والتي تتطابق مع مساحة التمثيل الغذائي الحفاظ جزئيا، يتم تخفيض جدا أو منعدمة بعد الآفة photothrombotic. وهذا يمكن أن الحدود واضحة تيسير دراسة الاستجابات الخلوية داخل الدماغية أو سليمة المنطقة القشرية. نموذج الفأر Photothrombosis هو مناسبة خاصة للدراسات السكتة الدماغية في مجموعة متنوعة من الحيوانات المعدلة وراثيا. في الواقع النماذج الكلاسيكية لا يمكن أن يصلح لجميع السلالات والدراسات فترة طويلة في C57BL / 6 اشتكوا من ضغوط الماوس نسبة الوفيات العالية التي يمكن أن تسبب التحيز 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. بعد الجراحة قبل
- زن روز البنغال في أنبوب 1.5 مل وتذوب في محلول ملحي معقم حتى التوصل إلى تركيز النهائي من 15 ملغ / مل. فلتر تعقيم من خلال مرشح ميكرون 0.2 وتخزينه في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة أقصاها شهران.
- تعقيم جميع الأدوات الجراحية بواسطة التعقيم. يجب تعقيم منطقة العمليات الجراحية أقل من ساعة واحدة قبل الشروع في عملية جراحية.
- تسجيل وزن الجسم الماوس لضبط جرعة من روز البنغال ليتم حقنه. نحن حقن 10 ميكرولتر / غرام من وزن الحيوان في الإناث CD1 الفئران 12 أسابيع من العمر في هذا البروتوكول. كمية روز البنغال اللازمة لإنتاج المطلوب القشرية حجم الآفة يمكن تحديد بسهولة في مجموعة منفصلة من التجارب الأولية عن طريق اختبار جرعات مختلفة (عادة 2 ميكرولتر / ز، 5 ميكرولتر / ز أو 10 ميكرولتر / غرام من وزن الجسم). لاحظ أن كمية روز البنغال ليتم حقنه تعتمد بشكل كبير على ظروف التجربة، ولا سيما نوع من مصدر الضوءالمستخدمة ومدة التعرض للضوء. في هذه الدراسة، و 10 ميكرولتر / ز (150 ميكروغرام / غرام) تم العثور على جرعة ضروريا للحث على photothrombosis عند التعرض للضوء لمدة 15 دقيقة، في حين أفادت جماعات آخرون أن إما 50 ميكروغرام / غرام 6،8 و 100 ميكروغرام / غرام وكان 10 حقن داخل الصفاق كافية لإحداث آفة photothrombotic.
2. إجراء التخدير
- تخدير الفئران مع isoflurane وفي غرفة تحريض شفافة (3.5-4٪ لتحريض، 1.5-2٪ للحفاظ على) في 50٪ (V / V) oxygen/50٪ (V / V) ثنائي النتروجين أول أكسيد خليط الغاز. التخدير الغازية يسمح أعقاب سريعة حتى من الحيوانات ومستوى غاز مخدر يمكن تعديلها بسهولة. بدلا من ذلك، يمكن أيضا أن يكون تخدير الفئران بواسطة خليط الكيتامين-زيلازين.
- عندما يتم التوصل إلى عمق التخدير، وإزالة تخدير الحيوان من غرفة الاستقراء، وضعه في الإطار التجسيمي والحفاظ على التخدير باستخدام قناع الوجه. ضبط isofluraشمال شرق الجرعة إلى تحقيق مستوى التخدير الكافي. رصد معدل التنفس في جميع أنحاء الداخلي والتأكد من أنها ثابت (40 - 60 نفسا في الدقيقة).
- استخدام القرصات اصبع القدم من أجل ضمان هذا الحيوان هو مخدرة بعمق.
- تطبيق مرهم العين، من أجل منع العينين من الجفاف.
- إدراج بلطف التحقيق المستقيم لرصد درجات الحرارة في جميع أنحاء العمليات الجراحية. تعيين يرتبط بها من لوحة التدفئة التي تسيطر عليها ردود فعل للحفاظ على درجة حرارة الجسم الماوس عند 37 ± 0.5 درجة مئوية.
3. عملية جراحية لإضاءة المنطقة المستهدفة
- حلق فروة الرأس الفأر مع الحلاقة الكهربائية.
- تأمين بحزم الرأس وإدراج أشرطة الأذن في الصماخ الخارجي. يجب الحرص على عدم تلف طبلة الأذن.
- تطهير الجلد على سطح بالتناوب مع الضربات الشديدة من الايثانول 70٪ وبتدين باستخدام قطعة قطن.
- استخدام مشرط لجعل شق على طول خط الوسط من جنيه العينفيل وصولا الى الرقبة. تطبيق الكامشات الجلد للحفاظ على الجمجمة عرضة للخطر.
- سحب بلطف periostium إلى حواف الجمجمة مع مشرط، والسماح للسطح الجمجمة الجافة باستخدام قطعة قطن معقمة. تحديد و bregma امدا. وضع micropipette الزجاج على bregma كنقطة مرجعية، ثم نقله إلى إحداثيات المنطقة اهتمامك. منطقة الفائدة الذي تم اختياره لهذا المقال هو تقريبا على شكل بشدة، تركزت حوالي 2 مم الوحشي على bregma، وتغطي مساحة قدرها حوالي 30 مم 2، والذي يتضمن جزءا كبيرا من القشرة الحسية وفقا لمخ الفأر أطلس من قبل فرانكلين و Paxinos 11.
- جعل الموقف في المصالح مع النقاط المرجعية ووضع الألياف البصرية في اتصال وثيق مع سطح الجمجمة لتجنب تشتت الضوء ولكن الاهتمام لا لممارسة الضغوط عليها. المنطقة المضاءة يمكن تقييد من خلال تطبيق على الجمجمة قناع مع فتحة صغيرة أو قبعة في غيض من الألياف البصرية واجهة المستخدم الرسوميةدي.
4. روز البنغال وحقن التنشيط
- تحميل حل البنغال روز في 1 مل حقنة وحساب المبلغ ليتم حقنه وفقا لجرعة من 10 ميكرولتر / غرام من وزن الجسم.
- انتقل إلى حقنة داخل الصفاق بطيئة.
- دع منتشر صبغ وتدخل مجرى الدم. بعد 5 دقائق، والتبديل على إضاءة الضوء البارد. تجنب الإضاءة من الحيوان من قبل أي مصدر آخر للضوء. استخدمنا إضاءة الألياف البصرية من 150 W كثافة.
- بعد 15 دقيقة من إضاءة، والتوقف عن التعرض للضوء وخياطة الجرح. خمس دقائق من الإضاءة تنتج بالفعل احتشاء و 10 دقيقة ومن المرجح كاف للحصول على تأثير القصوى 12. من أجل تقليل التباين، ونختار لإلقاء الضوء لمدة 15 دقيقة.
5. خياطة
- إزالة الكامشات الجلد وتطبيق محلول ملحي معقم لتجنب الجفاف.
- قرب الجرح باستخدام عكس القطع needl له والحرير أو النايلون خيوط الجروح.
- يقطع تسليم التخدير، وإزالة بعناية الماوس من جهاز التجسيمي ووضعها على وسادة التدفئة قبل تحسنت حتى يكون مستيقظا تماما، ثم إعادته إلى قفصه. وينبغي رصد درجة حرارة الجسم بعناية في جميع أنحاء إجراءات للحد من التقلبات في تمديد احتشاء. وفقا لتركيز وطريقة التعاطي، وردة لا يزال من الممكن الكشف عن البنغال في مجرى الدم لعدة ساعات بعد الحقن 13. يفضل بطانية التدفئة إلى مصباح الاحترار لتجنب الأضرار المحتملة الثانوي (روز البنغال امتصاص الطول الموجي هو في الطيف الأخضر).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
سوف يشكل هذا البروتوكول تنتج الآفة القشرية التي هي بالفعل واضحة على تشريح من القشرة للعين المجردة (أرقام 1A-1C). الآفة photothrombotic يتطور في الطبقات القشرية سطحي وعميق في الأنسجة التي هي شفافة بما فيه الكفاية للسماح الصور تفعيل روز البنغال. قياس مدى احتشاء دماغي لا يمكن أن يؤديها بسرعة عن طريق تلطيخ النسيجية مع كلوريد ثلاثي فينيل-تترازوليوم (TTC) على الأنسجة الطازجة أو البنفسجي الكريزيل بعد التثبيت في بارافورمالدهيد 4٪ (PFA). قبل TTC الحضانة، يتم وضع الدماغ تشريح طازجة في تقطيع اللحم الدماغ ومقطوع إلى شرائح سميكة 1 مم (الشكل 1C). TTC تسميات أنسجة سليمة في حين يبدو أحمر المنطقة احتشاء شاحب، والتي تسمح للقياس الدقيق للمنطقة احتشاء (أرقام 1D-1E). منطقة نقص التروية غير مكتملة تعرف بأنها غبش يتم تخفيض جدا أو منعدمة وفقا لحجم الآفة.
وبالمثل، فإن تلطيخ البنفسجي الكريزيل يسمح بتحديد المناطق احتشاء غير ملوثين بالمقارنة مع الأنسجة المحيطة الأرجواني الملون. ويمكن أيضا انتشار رد الفعل وتسلل خلية (الذي يحدث خلال الأسبوع الأول بعد الآفة) أن يقسم (الشكلان 2A1-2A2)، فضلا عن ظهور ندبة الدبقية (أرقام 2B1-2B2). ويتم مراقبة سلبية من قبل يؤدون نفس الجراحة وحقن الصبغة، ولكن من دون التعرض لمصدر ضوء بارد. الآفة غير قابلة للتكرار في حجم وموقع في نقاط زمنية مختلفة بعد الآفة (أرقام 3A-3B). منطقة احتشاء يصل حجمها الأقصى عموما من 4 إلى 6 ساعة بعد روز البنغال حقن 14 وبعد ذلك يقلل سريعا من 2 إلى 4 أيام أيام آخر photothrombosis. يحدث التشعيع في طبقات أكثر سطحية، ولكن يمكن أيضا أن المغطي السفن الكبيرة في الطبقات القشرية العميقة بسببضغط اثارته الآفة 7. فمن المهم للتحقيق في استنساخ الآفة قبل العلاج لأن توزيع الدماغ حنوني الأوعية الدموية الدقيقة يمكن أن تختلف بين الحيوانات من العمر أو سلالة مختلفة.
الشكل 1. مظهر Macroscopical من آفة photothrombotical في مخ الفأر CD1 بعد 4 أيام photothrombosis. AB. عرض الجانبي والأمامي. يظهر احتشاء سطحية (النصال) كمنطقة بيضاء مرئية للعين المجردة. C. يتم وضع الدماغ في تقطيع اللحم الدماغ ومقطوع بسرعة الى 1 ملم أبواب سميكة. DF. قياس مدى احتشاء الدماغ يمكن أن يتحقق عن طريق TTC تلطيخ . الأنسجة نخرية داخل الآفة الخثاري هو حرفأوتوماتيكية بواسطة غياب تلطيخ. يتم تمثيل شرائح الاكليلية من الدماغ هو موضح في AC في منقاري إلى تمديد الذيلية من D إلى F.
الشكل 2. التطور الزمني ممثل الضرر photothrombotic. كانت ملطخة أقسام الاكليل من الكبار C57BL / 6 الماوس الدماغ عن طريق البنفسجي الكريزيل. A1، A2. بعد 7 أيام إصابة عدد كبير من الخلايا تجمع على الحدود احتشاء. B1، B2. في 30، وحجم الآفة تخفيض للغاية وندبة الدبقية يتشكل. A2 و B2 هي تضخم عالية من A1 و B1 على التوالي. أشرطة النطاق: A1، B1: 1 مم؛ A2 B2: 0.5 مم.
الشكل (3). مظهر العيانية من الدماغ في 2 و 4 و 16 أيام بعد photothrombosis. A. Microphotographs من العقول PFA-perfused، أعدت لمزيد من التحليل immunohistological. يتم تمييز منطقة احتشاء (خط متقطع). B. مقارنة بين مساحة السطح في 2 و 4 و 16 أيام بعد الآفة. ن = 4 في كل مجموعة. * P <0.05 (اختبار t للطالب).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
التعديلات والتبديلات
بسبب ذروة امتصاصه في 562 نانومتر، ليزر الضوء الأخضر من مصباح قوس الزينون تصفيتها تم اختياره أصلا لأشرق على حساس روز البنغال. على الرغم من الإثارة ليزر بوساطة كانت لا تزال تستخدم recently5، ويمكن أن تحل محلها مصباح ضوء الباردة التي تضمن أيضا الإثارة صبغ 10،15. الألياف البصرية ضوء الباردة هي أسهل للتلاعب وأقل تكلفة من مصادر الليزر. ومع ذلك، يجب أن يكون لاحظت أن أشعة الليزر تستخدم عادة لاستهداف الشرايين السطحية الفردية بعد حج القحف لفي الجسم الحي السفينة محددة تخثر 10.
تسليم صبغة حساسة ويتم إنجاز عادة عن طريق حقن الوريد الذيل، الأمر الذي يتطلب بعض التدريب للحصول على نتائج متجانسة وقابلة للتكرار. على النقيض من ذلك، حقن داخل الصفاق هو أسهل لأداء وروز البنغال قابلا للاكتشاف في مجرى الدم بعد بضع دقائق 13. phototh فعالةلا يمكن أن يتحقق بواسطة rombosis مثيرة الصبغة 5 دقائق بعد الحقن داخل الصفاق 8، جرعة داخل الصفاق لكن ارتفاع روز البنغال في الفئران أظهرت أن تركيز البلازما من الصبغة تستمر في الزيادة حتى 60 دقيقة بعد تناوله 13. الحقن في الوريد غرست من روز البنغال يمكن أن تزيد من استنساخ الآفة 13، ولكن هذه الطريقة في الإدارة يمكن أن تكون مرتبطة إلى انخفاض ضغط الدم في حالة يتم تنفيذ التسريب بسرعة كبيرة (<1.5 دقيقة) أو في تركيز صبغ عالية 5. لتجنب التقلبات في ضغط الدم، وغيرها من المواد حساس مثل إريثروزين B يمكن استخدامها لإنتاج السفن انسداد، ومع ذلك يعتبر هذا الجزيء أقل كفاءة من روز البنغال لنفس نطاق التركيز 5.
الخطوات الحاسمة
عوامل مختلفة تؤثر على حجم الآفة وعمق مثل تركيز الصبغة الحساسة، الكمون بين صبغ injectiعلى والإضاءة، وشدة من مصدر الضوء، وقطره من سطح المستنير، ومدة التعرض ودرجة حرارة الجسم أثناء وبعد الجراحة. يمكن للزاوية مصدر الضوء على الجمجمة تؤثر أيضا على شكل احتشاء. وينبغي إجراء سلسلة من التجارب الأولية لاختبار استنساخ وتحديد الحد الأدنى من صبغ والوقت التشعيع التي تنتج الآفة التي تؤثر بشكل انتقائي المنطقة المستهدفة و / أو الحصول على العجز السلوكية ذو معنى.
القيود المفروضة على تقنية
وقد تم تطوير هذه التقنية من أجل تقليد السكتة الدماغية الإنسان عن طريق إحداث تراكم الصفائح الدموية كما لوحظ خلال الدماغي نقص تروية 4. ومع ذلك الضرر photothrombotic يختلف قليلا من السكتة الدماغية البشرية. بادئ ذي بدء، يتم تشغيل تجلط الدم في عدد كبير من السفن في المنطقة المضاءة، في حين ويتسبب عادة السكتة الدماغية عن طريق انقطاع تدفق الدم داخل الشريان محطة واحدة. كمالذلك، بعض المناطق من الدماغ، الذي يدعم جزئيا فقط عن طريق الشريان تمر انقطاع تدفق الدم الأيض في البداية أقل تأثرا لأنها قد تتلقى امدادات الدم عن طريق الشرايين وضمانات لا تخضع موت الخلايا نخرية. في المقابل جاءت حدود واضحة المعالم التي تنتجها النتائج photothrombosis في غبش محدودة جدا، وهذا هو الهدف الرئيسي من وكلاء اعصاب بعد نقص التروية. أيضا، في مجموعة فرعية من مرضى السكتة الدماغية، ويحدث بشكل عفوي وضخه قد تثير الأضرار الثانوية (بما في ذلك الاصابة ضخه). لدراسة هذا الجانب بالذات من نقص التروية، ونماذج انسداد عابر هي أكثر ملاءمة.
هذا النمط من احتشاء نفسها يعرض بعض الخصائص التي تختلف عن السكتة الدماغية البشرية. يظهر التصوير بالرنين المغناطيسي التنمية المتزامنة لاحتشاء الدماغية وذمة وعائية المنشأ في آفة photothrombotic كبير في حين تطور احتشاء الدماغية وذمة وعائية المنشأ يسود في هومان السكتة الدماغية 16. وعلى العكس، photothrombosis قد لا تكون كافية لدراسة دراسات عامل مضاد للالمتخثرة يرجع ذلك إلى حقيقة أن يحدث احتشاء photothrombotic أيضا بعد عرقلة من الصفائح الدموية أو تثبيط تجلط الدم الجوهرية مسار 17. وبالفعل فقد قيل أنه في ظروف غريبة على تجلط الدم الصفائح الدموية لم يكن من الضروري إطباق photothrombotic التي تعطل سلامة البطانية شأنها أن تحفز وذمة وضغط المرتبطة بها في الأوعية المحيطة بها. وعلاوة على ذلك في نفس الدراسة تحليل التصوير بالرنين المغناطيسي لم يظهر التعديل من حجم احتشاء بعد حصار وظيفة الصفائح الدموية أو نقص في الصفيحات 17.
أهمية فيما يتعلق بأساليب القائمة
نماذج عديدة لمعايير ثابتة من نقص التروية دائم، عابر، التنسيق والعالمية، التي يسببها ميكانيكيا أو كيميائيا، وقد وضعت في القوارض من أجل تقليد عن كثب الفيزيولوجيا المرضية السكتة الدماغية البشرية ول develoع استراتيجيات اعصاب جديدة. وphotothrombosis كما قدم هنا هو نموذج من نقص التروية التنسيق الدائم الذي يدفع باستمرار اصابة السكتة الدماغية من الحجم المطلوب في أي موقع القشرية وتحت القشرية بطريقة استنساخه جدا وبأقل تدخل جراحي. هذا النموذج يظهر معدل البقاء على قيد الحياة العالية التي وصلت إلى 100٪ في تجاربنا (25 حيوانات) في حين حصل دراسات أكثر شمولا 98.4٪ 18. يمكن تخصيص الآفة photothrombotic من أجل تؤثر على وظيفة محددة وفقا للمنطقة المستهدفة والاستجمام السلوكية يمكن تقييمها عن طريق اختبارات متعددة 6،19. وعلاوة على ذلك هذه الطريقة ليست مضيعة للوقت، قليلة مكلفة ويمكن تعلمها بسرعة كما أنها لا تتطلب من الناحية الفنية بالمقارنة مع الموديلات الأخرى، بما في ذلك نموذج خيوط. بالإضافة إلى ذلك يتم تحقيق انسداد الأوعية عن طريق حفز تشكيل المحلية من الجلطات التي تشبه هيكليا لتلك التي لوحظت في السكتة الدماغية البشرية. ومع ذلك، تم تعديل نهج photothrombotic أيضا للعلاقات العامةانسداد العامة oducing من الشريان الدماغي الأوسط 20. تم تطوير نموذج الآفة حلقة في وقت لاحق من أجل الحصول على شبه الظل أكبر. وهو يتكون من الإضاءة تحت شكل دائرة، في وسط والتي تحيط المنطقة القشرية من الأنسجة قابلة للحياة من قبل الأنسجة التالفة دائرية وتبادل الخصائص البيوكيميائية والجزيئية من غبش الدماغية 21،22. المتغيرات من تقنية متوفرة لأداء السكتة الدماغية في الدماغ النامية 23 أو في الأنسجة تحت القشرية 24 أيضا.
في الختام، photothrombosis هو وسيلة سهلة لأداء نموذج الدماغية مع استنساخ عالية. وعلاوة على ذلك، فهي مناسبة لعدد من الدراسات التجريبية السكتة الدماغية، وخاصة لتقييم اللدونة القشرية استجابة لإصابات الدماغ، على المستويين الخلوي والجزيئي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر أناليزا بوفو للحصول على اقتراحات بصيرة والتعليقات، وماوريتسيو Grassano، مارينا Boido وإرميرا Pajaj لاطلاق النار. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل FP7-MC-214003-2 (ماري كوري الأولية تدريب شبكة AXREGEN) وكمبانيا دي سان باولو، مشروع gliarep.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions and chemicals | |||
| Rose Bengal | Sigma, Italy | 330000 | |
| Isoflurane Vet | Merial | 103120022 | |
| Betadine | Asta Medica | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Surgical material and equipment | |||
| Fluosorber Filter | Havard apparatus | 340415 | |
| 150W fiber optic illuminator | Photonic | PL3000 | |
| Temperature Controller for Plate TCAT-2DF | Havard apparatus | 727561 | |
| Stereotaxic Instrument | Stoelting | 51950 | |
| Operating microscope | Takagi | OM8 | |
| Heating pad | |||
| Oxygen and nitrogen gas | |||
| Surgery Tools | World precision instrument | Optic fiber taps and mask are custom-made | |
References
- Lopez, A. D., Mathers, C. D., Ezzati, M., Jamison, D. T., Murray, C. J. Global and regional burden of disease and risk factors. Lancet. 367, 1747-1757 (2001).
- Mathers, C. D., Boerma, T., Ma Fat, D. Global and regional causes of death. Br. Med. Bull. 92, 7-32 (2009).
- Rosenblum, W. I., El-Sabban, F. Platelet aggregation in the cerebral microcirculation: effect of aspirin and other agents. Circ. Res. 40, 320-328 (1977).
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Ann. Neurol. 17, 497-504 (1985).
- Bergeron, M. Inducing photochemical cortical lesions in rat brain. Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 9, Unit 9 16 (2003).
- Lee, J. K., et al. Photochemically induced cerebral ischemia in a mouse model. Surg. Neurol. 67, 620-625 (2007).
- Dietrich, W. D., Watson, B. D., Busto, R., Ginsberg, M. D., Bethea, J. R. Photochemically induced cerebral infarction. I. Early microvascular alterations. Acta Neuropathol. 72, 315-325 (1987).
- Schroeter, M., Jander, S., Stoll, G. Non-invasive induction of focal cerebral ischemia in mice by photothrombosis of cortical microvessels: characterization of inflammatory responses. J. Neurosci. Methods. 117, 43-49 (2002).
- Kitagawa, K., et al. Cerebral ischemia after bilateral carotid artery occlusion and intraluminal suture occlusion in mice: evaluation of the patency of the posterior communicating artery. J. Cereb. Blood Flow Metab. 18, 570-579 (1998).
- Sigler, A., Goroshkov, A., Murphy, T. H. Hardware and methodology for targeting single brain arterioles for photothrombotic stroke on an upright microscope. J. Neurosci. Methods. 170, 35-44 (2008).
- Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , 1st, Academic Press. New York. (1997).
- Piao, M. S., Lee, J. K., Jang, J. W., Kim, S. H., Kim, H. S. A mouse model of photochemically induced spinal cord injury. J. Korean Neurosurg. Soc. 46, 479-483 (2009).
- Silva, V. M., Corson, N., Elder, A., Oberdorster, G. The rat ear vein model for investigating in vivo thrombogenicity of ultrafine particles (UFP). Toxicol. Sci. 85, 983-989 (2005).
- Watson, B. D., Prado, R., Dietrich, W. D., Ginsberg, M. D., Green, B. A. Photochemically induced spinal cord injury in the rat. Brain Res. 367, 296-300 (1986).
- Van Reempts, J., Van Deuren, B., Van de Ven, M., Cornelissen, F., Borgers, M. Flunarizine reduces cerebral infarct size after photochemically induced thrombosis in spontaneously hypertensive rats. Stroke. 18, 1113-1119 (1987).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2, 396-409 (2005).
- Kleinschnitz, C., et al. Blocking of platelets or intrinsic coagulation pathway-driven thrombosis does not prevent cerebral infarctions induced by photothrombosis. Stroke. 39, 1262-1268 (2008).
- Porritt, M. J., et al. Photothrombosis-induced infarction of the mouse cerebral cortex is not affected by the Nrf2-activator sulforaphane. PLoS One. 7, e41090 (2012).
- Baskin, Y. K., Dietrich, W. D., Green, E. J. Two effective behavioral tasks for evaluating sensorimotor dysfunction following traumatic brain injury in mice. J. Neurosci Methods. 129, 87-93 (2003).
- Markgraf, C. G., et al. Comparative histopathologic consequences of photothrombotic occlusion of the distal middle cerebral artery in Sprague-Dawley and Wistar rats. Stroke. 24, 286-292 (1993).
- Wester, P., Watson, B. D., Prado, R., Dietrich, W. D. A photothrombotic 'ring' model of rat stroke-in-evolution displaying putative penumbral inversion. Stroke. 26, 444-450 (1995).
- Hu, X., Wester, P., Brannstrom, T., Watson, B. D., Gu, W. Progressive and reproducible focal cortical ischemia with or without late spontaneous reperfusion generated by a ring-shaped, laser-driven photothrombotic lesion in rats. Brain Res. Brain Res. Protoc. 7, 76-85 (2001).
- Maxwell, K. A., Dyck, R. H. Induction of reproducible focal ischemic lesions in neonatal mice by photothrombosis. Dev. Neurosci. 27, 121-126 (2005).
- Kuroiwa, T., et al. Development of a rat model of photothrombotic ischemia and infarction within the caudoputamen. Stroke. 40, 248-253 (2009).
