Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

Fototrombotisch Ischemie: Een minimaal invasieve en Reproduceerbaar Fotochemisch corticale laesie Model voor Mouse Stroke Studies

doi: 10.3791/50370 Published: June 9, 2013

Summary

Photothrombosis is een snelle, minimaal-invasieve techniek voor het induceren van kleine en goed afgebakende infarct in gebieden die van belang zijn in zeer reproduceerbare wijze. Het is bijzonder geschikt voor het bestuderen van cellulaire en moleculaire respons onderliggende hersenplasticiteit in transgene muizen.

Abstract

De fototrombotisch takt model beoogt een ischemische schade binnen een bepaalde corticale gebied door middel van foto-activatie van een eerder ingespoten lichtgevoelige kleurstof induceren. Na belichting wordt de kleurstof geactiveerd en produceert singlet zuurstof schade onderdelen van endotheliale celmembranen, gevolgd bloedplaatjesaggregatie en trombi formatie, die uiteindelijk bepaalt de onderbreking van lokale doorbloeding. Deze aanpak, die aanvankelijk door Rosenblum en El-Sabban voorgesteld in 1977, werd later verbeterd door Watson in 1985 in de hersenen van de rat en stel de basis van het huidige model. Ook de toegenomen beschikbaarheid van transgene muis lijnen verder bijgedragen aan de rente op de photothrombosis model te verhogen. In het kort wordt een fotogevoelige kleurstof (Rose Bengal) intraperitoneaal geïnjecteerd en in de bloedsomloop. Wanneer verlicht door een koude lichtbron, de kleurstof wordt geactiveerd en induceert endotheliale schade met bloedplaatjes activering en trombose, wat resulteert in lokaledoorbloeding onderbreking. De lichtbron kan worden toegepast op de intacte schedel zonder de noodzaak van craniotomie, waardoor targeting van een corticaal gebied van belang in een reproduceerbare en niet-invasieve manier. De muis wordt vervolgens gehecht en toegestaan ​​om wakker te worden. De evaluatie van ischemische schade kan opgezet worden door trifenyl-tetrazoliumchloride of cresyl violet kleuring. Deze techniek levert infarct van kleine en goed afgebakende grenzen, hetgeen zeer voordelig voor nauwkeurige cel karakterisering en functionele studies. Verder is het bijzonder geschikt voor het bestuderen van cellulaire en moleculaire respons onderliggende hersenplasticiteit in transgene muizen.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Aan het begin van de 21e eeuw, ischemische beroerte is een verwoestende aandoening die de tweede oorzaak van langdurige invaliditeit 1 en de tweede oorzaak van sterfte wereldwijd, waarbij beroerte goed voor ongeveer 5,7 miljoen doden in 2004 2 vertegenwoordigt. Ondanks de vele inspanningen die in zijn gebracht, is er nog steeds geen effectieve behandeling beschikbaar functioneel herstel na een beroerte te verbeteren. Diermodellen van beroerte veel gebruikt op het gebied van slagonderzoek als zij toestaan ​​modellering van de pathofysiologie van ischemische schade en testen van de effectiviteit van verschillende neuroprotectieve strategieën in vivo. De meeste van deze modellen gericht op uitgebreide infarcten veroorzaken door het onderbreken (tijdelijk of permanent) van de bloedstroom in de arteria cerebri media, terwijl andere modellen werden ontwikkeld om letsels van kleine omvang studeren in specifieke gebieden, meestal de motor en somatosensorische cortex. Echter kunnen verscheidene factoren bijdragen aan ac genererenepaalde mate van variabiliteit in de experimentele beroerte studies, waaronder de muis gebruikte stam, de leeftijd en het geslacht van de dieren in de studie en vooral de techniek aangenomen om de ischemische schade veroorzaken. Wat dit laatste punt, de duur en de invasiviteit van de operatie (de noodzaak van een craniotomie) en de chirurgische vaardigheid vereist om de exploitant betrouwbaar induceren een ischemische laesie zijn bepalend voor een succesvolle en onpartijdige in vivo studie stroke .

Het concept van photothrombosis werd aanvankelijk door Rosenblum en El-Sabban voorgesteld in 1977 3 en werd bekend door zijn toepassing in hersenen van de rat door Watson et al. in 1985 4, waarin de techniek werd grotendeels verbeterd en stel de basis van het huidige model 3. - 6. De fototrombotisch aanpak heeft tot doel een corticaal infarct veroorzaken via de foto-activatie van een lichtgevoelige kleurstof eerder geleverde in bloed-systeem, which leidt tot plaatselijke vat trombose in de gebieden die zijn blootgesteld aan het licht. Wanneer de circulerende kleurstof verlicht de geschikte golflengte door een koude lichtbron, komt er energie zuurstofmoleculen, die op zijn beurt genereert een grote hoeveelheid zeer reactieve singlet zuurstof producten. Deze zuurstofradicalen induceren endotheelcellen membraan peroxidatie, waardoor bloedplaatjes adhesie en aggregatie, en uiteindelijk de vorming van trombi die lokale cerebrale te onderbreken 7 bepalen.

Photothrombosis is een niet-canonieke ischemische model dat niet afsluiten of breken op een slagader zoals meestal gebeurt in humane beroerte, maar induceert laesies in meer oppervlakkige vaten, waardoor selectieve onderbreking van de bloedstroom in het gebied blootgesteld aan licht. Daarom kan deze benadering geschikt voor cellulaire en moleculaire studies van corticale plasticiteit. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ligt in haar eenvoud van uitvoering.Bovendien kan photothrombosis gemakkelijk worden uitgevoerd in ongeveer veertig minuten per dier, met inbegrip van twintig minuten wachten (3 min voor anesthesie; 1 min op de hoofdhuid scheren; 3 tot 5 minuten om het dier te leggen op de stereotaxische apparaat, 2 min naar het schrobben hoofdhuid met antiseptische oplossing, maken een incisie en reinig de schedel; 2 tot 4 min naar het koude licht vezel te plaatsen; 1 min naar het Bengaals oplossing te injecteren; 5 min-wachten voor intraperitoneale diffusie, 15 min van verlichting, en 5 min naar Reinig de wond en hechtdraad het dier). Voorts werd geen enkele chirurgische kennis om deze techniek presteren als de laesie wordt veroorzaakt door eenvoudige verlichting van de intacte schedel. In tegenstelling tot de klassieke arteriële occlusie, deze methode bepaalt selectieve afsluitingen van pial en intraparenchymateuze microvessels binnen het bestraalde gebied en vermindert de variabiliteit onder laesies als er geen onderpand schip wordt overgelaten aan zuurstof in het doelgebied.

Ondanks zijn bijzondere aard, defototrombotisch schade aandelen essentiële mechanismen die zich in de hersenen een beroerte. Net arteria in menselijke beroerte, bloedplaatjesaggregatie en thrombusvorming bepalen onderbreking van de bloedstroom in het bestraalde gebied 7. Ook dit model deelt ook essentieel ontstekingsreacties zoals in midden cerebrale slagader occlusie 8. Vanwege de goed afgebakende grenzen, de bijschaduw zone, die overeenkomt met een gebied van gedeeltelijk behouden metabolisme, zeer beperkte of onbestaande na fototrombotisch laesie. Deze duidelijke grens kan de studie van cellulaire reacties binnen ischemische of intacte corticale gebied te vergemakkelijken. Photothrombosis muismodel is bijzonder geschikt voor slag studies in verschillende transgene dieren. Inderdaad klassieke modellen kunnen niet geschikt om alle spanningen en een lange periode onderzoeken in C57BL / 6 muizenstam meldde een hoge mortaliteit verhouding die vooringenomenheid 9 kan veroorzaken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Pre-operatie

  1. Weeg Rose Bengal in een 1,5 ml buis en opgelost in steriele zoutoplossing tot aan een uiteindelijke concentratie van 15 mg / ml. Filter steriliseer door een 0,2 urn filter en opslaan in het donker bij kamertemperatuur tot twee maanden.
  2. Steriliseren alle chirurgische instrumenten in de autoclaaf. De chirurgische gebied moet minder dan een uur worden opgeschoond alvorens de operatie.
  3. Noteer het lichaamsgewicht van de muis om de dosis van Rose Bengal in te spuiten passen. We geïnjecteerd 10 ul / g dier gewicht in vrouwelijke CD1 muizen 12 weken oud in het huidige protocol. De hoeveelheid van Rose Bengal nodig het gewenste corticale laesie grootte kan gemakkelijk worden bepaald in een afzonderlijke reeks voorlopige experimenten door het testen van verschillende doseringen (gewoonlijk 2 gl / g, 5 gl / g of 10 ul / g lichaamsgewicht). Merk op dat de hoeveelheid van Rose Bengal in te spuiten is sterk afhankelijk van de experimentele omstandigheden, met name het type lichtbrongebruikt en de duur van blootstelling aan licht. In de onderhavige studie, 10 pl / g (150 ug / g) dosis bleek noodzakelijk photothrombosis induceren bij blootstelling aan licht gedurende 15 min, terwijl andere groepen gemeld dat hetzij 50 ug / g 6,8 en 100 ug / g 10 intraperitoneale injectie was voldoende voor het induceren van een fototrombotisch laesie.

2. Anesthesie Procedure

  1. Verdoven muizen met isofluraan in een transparante inductie kamer (3.5-4% voor inductie, 1,5-2% voor handhaving) in 50% (v / v) oxygen/50% (v / v) distikstofmonoxide gasmengsel. Gasvormige anesthesie maakt een snelle wake-up van de dieren en de mate van verdoving gas kan eenvoudig worden aangepast. Als alternatief kunnen muizen ook verdoofd door een ketamine-xylazine mengsel.
  2. Bij diepe anesthesie wordt bereikt, verwijdert het verdoofde dier uit de inductie kamer, plaats het in het stereotaxisch frame en onderhouden van anesthesie met behulp van een gezichtsmasker. Pas de isoflurane dosis om een ​​voldoende anesthesie niveau te bereiken. Bewaken de ademhalingsfrequentie tijdens de gehele procedure en zorg ervoor dat het constant (40 - 60 ademhalingen per minuut).
  3. Gebruik teen knijpt om ervoor te zorgen het dier is diep verdoofd.
  4. Toepassen oogzalf, om de ogen niet uitdrogen.
  5. Steek de rectale sonde om de temperatuur tijdens de gehele chirurgische procedures. Stel de bijbehorende feedback-gestuurde verwarming pad voor het behoud van de muis lichaamstemperatuur op 37 ± 0,5 ° C.

3. Chirurgie voor verlichting van het doelgebied

  1. Scheer de muis hoofdhuid met een elektrisch scheerapparaat.
  2. Stevig vast het hoofd en steek het oor bars in de externe gehoorgang. Wees voorzichtig niet te beschadigen trommelvliezen.
  3. Ontsmet de huid op het oppervlak met afwisselend jat van 70% ethanol en betadine behulp van wattenstaafjes.
  4. Gebruik een scalpel een incisie te maken langs de middellijn van het oog leVel naar de nek. Solliciteer huid retractors de schedel bloot te houden.
  5. De periostium zachtjes trekken aan de randen van de schedel met een scalpel en laat de schedel oppervlak droog met steriele wattenstaafjes. Identificeer de bregma en lambda. Plaats een glas micropipet op de bregma als referentiepunt, dan verplaatsen naar de coördinaten van uw regio van belang. Het interessegebied gekozen voor dit artikel is ongeveer ronduit gevormd, bij benadering 2 mm lateraal van de bregma en met een oppervlakte van ongeveer 30 mm2, die een groot deel van de sensorimotorische cortex omvat volgens muizenhersenen atlas door Franklin en Paxinos 11.
  6. Markeer de positie van de rente met referentiepunten en zet een optische vezel in nauw contact met de schedel oppervlak om lichtverstrooiing te voorkomen, maar let niet om druk uit te oefenen op het. Het verlichte oppervlak kan worden beperkt door het toepassen van op de schedel van een masker met een kleine opening of een kapje aan het uiteinde van de optische vezel guide.

4. Bengaals Injection en Activering

  1. Laad de Bengaals oplossing in een 1 ml spuit en berekenen het bedrag dat wordt geïnjecteerd volgens een dosis van 10 ul / g lichaamsgewicht.
  2. Overgaan tot een langzame intraperitoneale injectie.
  3. Laat de kleurstof diffuus en in de bloedsomloop. Na 5 minuten, schakelt het koude licht verlichting. Vermijd verlichting van het dier door een andere bron van licht. We gebruikten glasvezel hulplicht van 150 W intensiteit.
  4. Na 15 min van verlichting, stop blootstelling aan licht en hechten van de wond. Vijf minuten van de verlichting al produceren infarct en 10 min waarschijnlijk voldoende om een maximaal effect te verkrijgen 12. Om variabiliteit te minimaliseren, we kiezen voor de verlichting gedurende 15 minuten.

5. Hechtdraad

  1. Verwijder de huid verwijdert en de toepassing steriele zoutoplossing om uitdroging te voorkomen.
  2. Close-up van de wond met behulp van omgekeerde snijden needle en zijde of nylon hechtdraad.
  3. Interrupt anesthesietoediening, verwijder voorzichtig de muis uit de stereotaxische apparaat en zet het op een voorverwarmde verwarming pad totdat het volledig wakker, dan terug naar zijn kooi. De lichaamstemperatuur zorgvuldig gehele procedures worden gevolgd om de variabiliteit in de infarct extensie beperken. Afhankelijk van de concentratie en de wijze van toediening, Rose Bengal nog worden gedetecteerd in het bloed gedurende enkele uren na injectie 13. Liever de verwarming deken om de aarde lamp om potentiële secundaire schade (Bengaals absorptiegolflengte is in het groene spectrum) te vermijden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dit protocol is een corticale laesie die is al zichtbaar na dissectie van de cortex met het blote oog (Figuren 1A-1C) produceren. De fototrombotisch laesie ontwikkelt zich in oppervlakkige en diepe corticale lagen waarbij het weefsel voldoende doorzichtig om foto-activatie van de Bengaals toestaan. Meting van de omvang van herseninfarct kan snel worden uitgevoerd door histologische kleuring met trifenyl-tetrazoliumchloride (TTC) in vers weefsel of cresylviolet na fixatie in 4% paraformaldehyde (PFA). Voordat TTC incubatie wordt de vers ontleed hersenen gepositioneerd in een brein snijmachine en coupes in 1 mm dikke plakken (figuur 1C). TTC labels intact weefsel in het rood terwijl het infarct gebied verschijnt bleek, dat een nauwkeurige meting van het infarct gebied (figuur 1D-1E) mogelijk maakt. De zone van onvolledige ischemie gedefinieerd penumbra zeer beperkte of onbestaande volgens de grootte van de laesie.

Ook de cresylviolet kleuring maakt de identificatie van ongekleurde geïnfarceerde gebied in vergelijking met de paarse bevlekte omringende weefsel. De reactieve proliferatie en infiltratie (die tijdens de eerste week na de laesie) kan worden beoordeeld (Figuren 2A1-2A2), alsook de verschijning van een gliale litteken (Figuur 2B1-2B2). De negatieve controle wordt uitgevoerd door het uitvoeren van dezelfde operatie en inktinjectie, maar zonder blootstelling aan de koude lichtbron. De laesie is reproduceerbaar in grootte en locatie op verschillende tijdstippen na de laesie (Figuren 3A-3B). Het infarct gebied over het algemeen bereikt zijn maximale grootte van 4 tot 6 uur na de Bengaals-injectie 14 en vervolgens vermindert snel van 2 dagen tot 4 dagen na photothrombosis. De bestraling vindt plaats in de meer oppervlakkige lagen, maar grote schepen in de diepe corticale lagen kan ook worden afgesloten door decompressie veroorzaakt door de laesie 7. Het is belangrijk om de reproduceerbaarheid van de laesie te onderzoeken voor de behandeling vanwege de verdeling van hersenen pial capillairen kan variëren tussen dieren van verschillende leeftijd of stam.

Figuur 1
Figuur 1. Macroscopische uiterlijk van photothrombotical laesie in CD1 muizenhersenen 4 dagen na photothrombosis. AB. Laterale en vooraanzicht. De oppervlakkige infarct (pijlpunten) verschijnt als een wit gebied met het blote oog. C. De hersenen snel gepositioneerd hersenen snijmachine en deelbaar in 1 mm dikke secties. DF. Meting van de omvang van herseninfarct kan door TTC kleuring . Necrotisch weefsel binnen de trombotische laesie karakterseerd door de afwezigheid van kleuring. Coronale plakjes van de hersenen getoond in AC worden in rostraal van caudale uitbreiding van D naar F.

Figuur 2
Figuur 2. Vertegenwoordiger temporele evolutie van fototrombotisch schade. Coronale secties van volwassen C57BL / 6 muizen hersenen werden gekleurd door cresylviolet. A1, A2. 7 dagen na verwonding een groot aantal cellen verzamelt op infarct grens. B1, B2. Op 30, de laesie volume sterk verminderd en gliale litteken vormt. A2 en B2 zijn hoge vergroting van A1 en B1 resp. Schaalbalken: A1, B1: 1 mm; A2 B2: 0.5 mm.

Figuur 3
Figuur 3. Macroscopische uiterlijk van de hersenen op 2, 4 en 16 dagen na photothrombosis. A. microfoto van PFA-geperfundeerde hersenen, voorbereid voor verdere immunohistologische analyse. Het geïnfarceerde gebied wordt gemarkeerd (streeplijn). B. Vergelijking van het oppervlak op 2, 4 en 16 dagen na de laesie. n = 4 in elke groep. * P <0,05 (Student's t-test).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Wijzigingen en vervangingen

Vanwege de absorptie piek bij 562 nm, werd een groen licht laser uit een gefilterde xenon booglamp oorspronkelijk gekozen om de lichtgevoelige Bengaals bestralen. Hoewel laser-gemedieerde excitatie werd nog gebruikt recently5, kan het worden vervangen door koud licht lamp die er ook voor zorgen kleurstof excitatie 10,15. Koud licht optische vezels zijn gemakkelijker te manipuleren en minder duur dan laserbronnen. Er moet opgemerkt worden dat lasers algemeen worden gebruikt voor individuele oppervlakte-arteriolen richten na craniotomie een in vivo-specifieke stolling vat 10.

Levering van gevoelige kleurstof wordt meestal bereikt door staartaderinjectie, die een opleiding voor het verkrijgen van homogene en reproduceerbare resultaten vereist. Daarentegen intraperitoneale injectie is makkelijker uit te voeren en Rose Bengal detecteerbaar in het bloed een paar minuten na 13. Effectieve photothrombosis kan worden bereikt door het exciteren van het kleurstof 5 minuten na intraperitoneale injectie 8 echter hoge intraperitoneale dosis van Rose Bengal in ratten toonden aan dat plasma concentratie van de kleurstof blijft, zelfs 60 minuten na toediening 13 verhogen. Geïnfundeerd intraveneuze injectie van Rose Bengal kan de reproduceerbaarheid van de laesie 13, maar deze manier van toediening kan worden gekoppeld tot hypotensie bij de infusie te snel (<1,5 min) of in hoge kleurstofconcentratie 5 uitgevoerd. Voor het vermijden bloeddrukafwijkingen kunnen andere lichtgevoelige stoffen zoals Erythrosine B worden gebruikt om schepen occlusies produceren, maar dit molecuul als minder efficiënt dan Bengaals voor hetzelfde concentratiebereik 5.

Kritische stappen

Verschillende factoren hebben invloed laesie grootte en diepte, zoals de concentratie van de kleurstof, de latency tussen de kleurstof injectieop en belichting, de intensiteit van de lichtbron, de diameter van de verlichte oppervlak, de blootstellingsduur en de lichaamstemperatuur tijdens en na de operatie. De hoek van de lichtbron op de schedel kan ook invloed op de vorm van het infarct. Een reeks inleidende experimenten moeten worden uitgevoerd om de reproduceerbaarheid te testen en om de minimale hoeveelheid kleurstof en bestraling tijdstip waarop een laesie die selectief het doelgebied en / of het verkrijgen van significative gedragsproblemen tekort produceren bepalen.

Beperkingen van de techniek

Deze techniek werd ontwikkeld om de menselijke beroerte na te bootsen door het induceren van bloedplaatjesaggregatie zoals waargenomen tijdens cerebrale ischemie 4. Echter fototrombotisch schade enigszins afwijkt van de menselijke beroerte. Allereerst wordt veroorzaakt trombose in groot aantal vaartuigen in het verlichte gebied, terwijl beroerte wordt meestal veroorzaakt door onderbreking van de bloedstroom in een slagader terminal. AlsBijgevolg bepaalde gebieden van de hersenen, waarvan het metabolisme wordt slechts gedeeltelijk ondersteund door de slagader ondergaan de bloedstroom onderbreking initieel minder beïnvloed zij bloedtoevoer kan ontvangen door collaterale arteriën en geen necrotische celdood ondergaan. Aan het tegendeel het goed gedefinieerde grens geproduceerd door photothrombosis resulteert in een zeer beperkt halfschaduw, dat is het belangrijkste doel van de post-ischemie neuroprotectieve agenten. Ook in een subgroep van patiënten met een beroerte, reperfusie spontaan en kan secundaire schade (met inbegrip van de reperfusieverwonding) uitlokken. Om dit aspect van de studie ischemie, voorbijgaande occlusie modellen zijn geschikt.

Het patroon van de infarct zelf toont enkele kenmerken die verschillen van de menselijke beroerte. MRI toont een gelijktijdige ontwikkeling van het ischemisch infarct en vasogeen oedeem in grote fototrombotisch laesie dat de ontwikkeling van het ischemisch infarct prevaleert boven vasogeen oedeem in Human slag 16. Omgekeerd kunnen photothrombosis niet geschikt voor de studie van anti-trombotische middel studies omdat dat fototrombotisch infarct optreedt ook na blokkering van bloedplaatjes of remming van de intrinsieke coagulatie route 17. Inderdaad is gesuggereerd dat de bloedplaatjes stremmen bijzondere voorwaarden om fototrombotisch occlusie waarbij verstoring van het endotheel integriteit oedeem en bijkomende samendrukking van de omliggende vaten zou induceren niet. Bovendien in dezelfde studie MRI analyse geeft modificatie van de infarctgrootte vertonen na blokkade van bloedplaatjesfunctie of uitputting van bloedplaatjes 17.

Belang met betrekking tot bestaande methoden

Tal van goed gestandaardiseerde modellen van permanente, tijdelijke, focale en globale ischemie, mechanisch of chemisch geïnduceerde, werden ontwikkeld in knaagdieren, om na te bootsen de menselijke beroerte pathofysiologie en ontwikp nieuwe neuroprotectieve strategieën. De photothrombosis zoals hier gepresenteerd is een model van permanente focale ischemie die consequent induceert een beroerte letsel van de gewenste grootte in elke corticale of subcorticale site in een zeer reproduceerbare en minimaal invasieve manier. Dit model toont een hoog overlevingspercentage dat die 100% in onze experimenten bereikt (25 dieren), terwijl meer uitgebreide studies verkregen 98.4% 18. De fototrombotisch laesie kan worden aangepast om een precieze functie beïnvloeden volgens het doelgebied en gedragsmatige herstel kan worden beoordeeld door meerdere tests 6,19. Deze aanpak is tijdrovend, kostbaar en weinig kunnen snel worden geleerd het is technisch veeleisend, in tegenstelling tot andere modellen, zoals de gloeidraad model. Bovendien is de vatafsluiting wordt bereikt door het induceren van de plaatselijke vorming van trombi die structureel vergelijkbaar met die waargenomen in menselijke beroerte. Echter, werd de fototrombotisch aanpak ook aangepast voor producing occlusie van de middelste cerebrale slagader 20. De ring laesie model werd later ontwikkeld om een ​​grotere penumbra verkrijgen. Het bestaat uit een belichting onder de vorm van een cirkel, in het midden waarvan corticale regio levende weefsel is omgeven door een cirkelvormige beschadigd weefsel en delen van de biochemische en moleculaire kenmerken van de ischemische penumbra 21,22. Varianten van de techniek zijn ook beschikbaar voor het uitvoeren van een beroerte in de ontwikkelende hersenen 23 of subcorticale weefsel 24.

Concluderend photothrombosis is een eenvoudig te ischemische model voeren met een hoge reproduceerbaarheid. Bovendien is het geschikt voor een aantal experimentele beroerte studies, met name voor de evaluatie van corticale plasticiteit in reactie op hersenletsel, zowel op cellulair en moleculair niveau.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgments

Wij danken Annalisa Buffo voor inzichtelijke suggesties en opmerkingen, en Maurizio Grassano, Marina Boido en Ermira Pajaj voor de schietpartij. Dit werk werd gefinancierd door KP7-MC-214003-2 (Marie Curie Initial Training Network AXREGEN) en de Compagnia di San Paolo, gliarep project.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Solutions and chemicals
Rose Bengal Sigma, Italy 330000
Isoflurane Vet Merial 103120022
Betadine Asta Medica
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
Surgical material and equipment
Fluosorber Filter Havard apparatus 340415
150W fiber optic illuminator Photonic PL3000
Temperature Controller for Plate TCAT-2DF Havard apparatus 727561
Stereotaxic Instrument Stoelting 51950
Operating microscope Takagi OM8
Heating pad
Oxygen and nitrogen gas
Surgery Tools World precision instrument Optic fiber taps and mask are custom-made

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lopez, A. D., Mathers, C. D., Ezzati, M., Jamison, D. T., Murray, C. J. Global and regional burden of disease and risk factors. Lancet. 367, 1747-1757 (2001).
  2. Mathers, C. D., Boerma, T., Ma Fat, D. Global and regional causes of death. Br. Med. Bull. 92, 7-32 (2009).
  3. Rosenblum, W. I., El-Sabban, F. Platelet aggregation in the cerebral microcirculation: effect of aspirin and other agents. Circ. Res. 40, 320-328 (1977).
  4. Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Ann. Neurol. 17, 497-504 (1985).
  5. Bergeron, M. Inducing photochemical cortical lesions in rat brain. Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 9, Unit 9 16 (2003).
  6. Lee, J. K., et al. Photochemically induced cerebral ischemia in a mouse model. Surg. Neurol. 67, 620-625 (2007).
  7. Dietrich, W. D., Watson, B. D., Busto, R., Ginsberg, M. D., Bethea, J. R. Photochemically induced cerebral infarction. I. Early microvascular alterations. Acta Neuropathol. 72, 315-325 (1987).
  8. Schroeter, M., Jander, S., Stoll, G. Non-invasive induction of focal cerebral ischemia in mice by photothrombosis of cortical microvessels: characterization of inflammatory responses. J. Neurosci. Methods. 117, 43-49 (2002).
  9. Kitagawa, K., et al. Cerebral ischemia after bilateral carotid artery occlusion and intraluminal suture occlusion in mice: evaluation of the patency of the posterior communicating artery. J. Cereb. Blood Flow Metab. 18, 570-579 (1998).
  10. Sigler, A., Goroshkov, A., Murphy, T. H. Hardware and methodology for targeting single brain arterioles for photothrombotic stroke on an upright microscope. J. Neurosci. Methods. 170, 35-44 (2008).
  11. Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. 1st, Academic Press. New York. (1997).
  12. Piao, M. S., Lee, J. K., Jang, J. W., Kim, S. H., Kim, H. S. A mouse model of photochemically induced spinal cord injury. J. Korean Neurosurg. Soc. 46, 479-483 (2009).
  13. Silva, V. M., Corson, N., Elder, A., Oberdorster, G. The rat ear vein model for investigating in vivo thrombogenicity of ultrafine particles (UFP). Toxicol. Sci. 85, 983-989 (2005).
  14. Watson, B. D., Prado, R., Dietrich, W. D., Ginsberg, M. D., Green, B. A. Photochemically induced spinal cord injury in the rat. Brain Res. 367, 296-300 (1986).
  15. Van Reempts, J., Van Deuren, B., Van de Ven, M., Cornelissen, F., Borgers, M. Flunarizine reduces cerebral infarct size after photochemically induced thrombosis in spontaneously hypertensive rats. Stroke. 18, 1113-1119 (1987).
  16. Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2, 396-409 (2005).
  17. Kleinschnitz, C., et al. Blocking of platelets or intrinsic coagulation pathway-driven thrombosis does not prevent cerebral infarctions induced by photothrombosis. Stroke. 39, 1262-1268 (2008).
  18. Porritt, M. J., et al. Photothrombosis-induced infarction of the mouse cerebral cortex is not affected by the Nrf2-activator sulforaphane. PLoS One. 7, e41090 (2012).
  19. Baskin, Y. K., Dietrich, W. D., Green, E. J. Two effective behavioral tasks for evaluating sensorimotor dysfunction following traumatic brain injury in mice. J. Neurosci Methods. 129, 87-93 (2003).
  20. Markgraf, C. G., et al. Comparative histopathologic consequences of photothrombotic occlusion of the distal middle cerebral artery in Sprague-Dawley and Wistar rats. Stroke. 24, 286-292 (1993).
  21. Wester, P., Watson, B. D., Prado, R., Dietrich, W. D. A photothrombotic 'ring' model of rat stroke-in-evolution displaying putative penumbral inversion. Stroke. 26, 444-450 (1995).
  22. Hu, X., Wester, P., Brannstrom, T., Watson, B. D., Gu, W. Progressive and reproducible focal cortical ischemia with or without late spontaneous reperfusion generated by a ring-shaped, laser-driven photothrombotic lesion in rats. Brain Res. Brain Res. Protoc. 7, 76-85 (2001).
  23. Maxwell, K. A., Dyck, R. H. Induction of reproducible focal ischemic lesions in neonatal mice by photothrombosis. Dev. Neurosci. 27, 121-126 (2005).
  24. Kuroiwa, T., et al. Development of a rat model of photothrombotic ischemia and infarction within the caudoputamen. Stroke. 40, 248-253 (2009).
Fototrombotisch Ischemie: Een minimaal invasieve en Reproduceerbaar Fotochemisch corticale laesie Model voor Mouse Stroke Studies
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Labat-gest, V., Tomasi, S. Photothrombotic Ischemia: A Minimally Invasive and Reproducible Photochemical Cortical Lesion Model for Mouse Stroke Studies. J. Vis. Exp. (76), e50370, doi:10.3791/50370 (2013).More

Labat-gest, V., Tomasi, S. Photothrombotic Ischemia: A Minimally Invasive and Reproducible Photochemical Cortical Lesion Model for Mouse Stroke Studies. J. Vis. Exp. (76), e50370, doi:10.3791/50370 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter