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Medicine

Photothrombotic Ischämie: eine minimal-invasive und reproduzierbare photochemische kortikale Läsion Modell für Mouse Stroke Studies

doi: 10.3791/50370 Published: June 9, 2013

Summary

Photothrombose ist eine schnelle, minimal-invasive Technik zur Induktion von kleinen und gut abgegrenzt Infarkt in Bereiche von Interesse in sehr reproduzierbar. Es ist besonders geeignet für die Untersuchung zellulären und molekularen Reaktionen zugrunde Plastizität des Gehirns in transgenen Mäusen.

Abstract

Die photothrombotic Hubmodell zielt auf eine ischämische Schädigung innerhalb einer bestimmten kortikalen Bereich mittels Foto-Aktivierung eines zuvor injizierten lichtempfindlichen Farbstoff induzieren. Nach der Belichtung wird der Farbstoff aktiviert und Singulett-Sauerstoff, die Schäden Komponenten Endothelzellen Membranen mit anschließender Thrombozytenaggregation und Thrombenbildung, die schließlich bestimmt, die Unterbrechung der lokalen Durchblutung. Dieser Ansatz, der ursprünglich von Rosenblum und El-Sabban 1977 vorgeschlagen, wurde später von Watson im Jahr 1985 verbesserte sich im Rattenhirn und stellen die Grundlage für das aktuelle Modell. Auch die zunehmende Verfügbarkeit von transgenen Mauslinien weiter dazu beigetragen, das Interesse an der Photothrombose Modell zu erhöhen. Kurz gesagt, wird eine lichtempfindliche Farbstoff (Rose Bengal) intraperitoneal injiziert und gelangt in den Blutkreislauf. Wenn von einer Kaltlichtquelle beleuchtet wird, wird der Farbstoff aktiviert und induziert Endothelschädigung mit Thrombozytenaktivierung und Thrombose, was zu lokalenBlutfluss Unterbrechung. Die Lichtquelle kann auf dem intakten Schädel ohne Notwendigkeit der Kraniotomie, die ein Targeting jeder kortikalen Bereich von Interesse in einer reproduzierbaren und nicht-invasive Art und Weise angewendet werden können. Die Maus wird dann vernäht und erlaubt aufzuwachen. Die Auswertung der ischämischen Schädigung schnell von Triphenyl-Tetrazoliumchlorid oder Kresylviolett Färbung durchgeführt werden. Diese Technik erzeugt Infarkt der geringen Größe und gut abgegrenzt Grenzen, was sehr vorteilhaft für die präzise Charakterisierung Zelle oder funktionelle Studien ist. Weiterhin ist es besonders geeignet für die Untersuchung zellulären und molekularen Reaktionen zugrunde Plastizität des Gehirns in transgenen Mäusen.

Introduction

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Zu Beginn des 21. Jahrhunderts, ist ischämischem Schlaganfall eine verheerende Krankheit, die die zweite Ursache für langfristige Behinderung 1 und die zweithäufigste Todesursache weltweit, in denen Schlaganfall etwa 5,7 Millionen Todesfälle im Jahr 2004 entfielen 2 darstellt. Trotz der vielen Anstrengungen, die gesetzt wurden in, gibt es noch keine wirksame Behandlung zur Verfügung funktionelle Erholung nach einem Schlaganfall verbessern. Tiermodelle von Schlaganfall sind weit verbreitet im Bereich der Hub Forschung verwendet, da sie Modellierung der Pathophysiologie des ischämischen Schadens und damit Prüfung der Wirksamkeit verschiedener neuroprotektive Strategien in vivo. Die meisten dieser Modelle sollen umfangreiche Infarkte durch Unterbrechung (vorübergehend oder dauerhaft) den Blutfluss in der Arteria cerebri media, während andere Modelle wurden entwickelt, um Läsionen der geringen Größe in bestimmten Bereichen, in der Regel der Motor und somatosensorischen Kortex studieren zu induzieren. Allerdings können mehrere Faktoren beitragen, ac erzeugenn eingetragen Maß an Variabilität in experimentellem Schlaganfall Studien, einschließlich der Maus-Stamm verwendet, dem Alter und Geschlecht der Tiere in die Studie eingeschlossen und vor allem hat die Technik, um die ischämische Schädigung induzieren. Im Hinblick auf den letztgenannten Punkt, der Dauer und Invasivität der Operation (dh die Notwendigkeit einer Kraniotomie) sowie der chirurgischen Geschick erforderlich, um den Bediener zuverlässig induzieren einen ischämischen Läsion sind kritische Faktoren für eine erfolgreiche und unvoreingenommene in vivo Studie Schlaganfall .

Das Konzept wurde ursprünglich von Photothrombose Rosenblum und El-Sabban 1977 3 vorgeschlagen und wurde berühmt durch ihre Anwendung im Rattenhirn von Watson et al 1985 4, in dem die Technik wurde weitgehend verbessert und stellen die Basis des aktuellen Modells 3. - 6. Die photothrombotic Ansatz zielt auf eine kortikale Infarkt durch die Foto-Aktivierung eines lichtempfindlichen Farbstoff zuvor in Blutsystem, wh geliefert induzierenich ergibt lokalen Gefäß Thrombose in den Bereichen die dem Licht ausgesetzt. Wenn der zirkulierenden Farbstoff bei der geeigneten Wellenlänge wird von einer Kaltlichtquelle beleuchtet, gibt es Energie, um Sauerstoff-Moleküle, die wiederum erzeugen eine große Menge von hochreaktiven Singulettsauerstoff Produkte. Diese Sauerstoff-Zwischenstufen induzieren Endothelzellmembran Peroxidation führt zu Blutplättchen-Adhäsion und-Aggregation und schließlich zur Bildung von Thromben lokalen zerebralen Flussunterbrechung 7 zu bestimmen.

Photothrombose ist ein nicht-kanonischen ischämischen Modell, das nicht verstopfen nicht oder brechen nur eine Arterie, wie es geschieht in der Regel in der menschlichen Schlaganfall, sondern induziert Läsionen in mehr oberflächlichen Gefäße, die in selektive Unterbrechung des Blutflusses in den Bereichen Licht ausgesetzt ergibt. Aus diesem Grund kann dieser Ansatz für Zell-und molekularbiologische Untersuchungen der kortikalen Plastizität. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens liegt in seiner Einfachheit der Ausführung.1 min, um die Kopfhaut rasieren;; 3-5 min, um das Tier auf der stereotaktischen Gerät zu platzieren; Darüber hinaus können Photothrombose leicht in ca. 40 Minuten pro Tier, einschließlich zwanzig Minuten Wartezeit (3 min für Anästhesie durchgeführt werden 2 min auf die schrubben Kopfhaut mit einer antiseptischen Lösung, einen Einschnitt machen und reinigen Sie den Schädel; 2 bis 4 min, um die kalte Licht Faser platzieren; 1 min bis die Rose Bengal Lösung zu injizieren; 5 Minuten Wartezeit für die intraperitoneale Diffusion; 15 min von Beleuchtung und 5 min auf Reinigen Sie die Wunde und Naht das Tier). Darüber hinaus ist keine chirurgische Know-how benötigt, um diese Technik durchzuführen, wie die Läsion durch einfache Beleuchtung des intakten Schädel induziert wird. Im Gegensatz zu klassischen Arterienverschluss Diese Methode ermittelt selektive Verschlüsse Pia und intraparenchymal microvessels innerhalb der bestrahlten Zone und verringert die Variabilität unter Läsionen keine Sicherheiten Behälter gelassen wird Sauerstoff in dem Zielgebiet zu liefern.

Trotz seiner besonderen Art, derphotothrombotic Schäden Aktien wesentlichen Mechanismen auftretenden Hirnschlag. Ähnlich wie in der menschlichen Arteria Schlaganfall bestimmen Thrombozytenaggregation und Gerinnselbildung Unterbrechung des Blutflusses in der bestrahlten Fläche 7. Ebenso auch dieses Modell teilt wesentliche Entzündungsreaktionen wie in Mitte Zerebralarterie 8. Da jedoch der gut abgegrenzt Grenzen ist die Penumbra-Zone, die zu einem Bereich des teilweise erhaltenen Stoffwechsel entspricht, sehr reduzierten oder existiert nach einem photothrombotic Läsion. Diese klare Grenze kann die Untersuchung von zellulären Reaktionen innerhalb ischämischen oder intakten kortikalen Bereich zu erleichtern. Photothrombose Mausmodell eignet sich besonders für Untersuchungen Hub in eine Vielzahl von transgenen Tieren. Tatsächlich klassischen Modelle können nicht an allen Stämmen und längere Studien in C57BL / 6 Maus-Stamm berichtet eine hohe Sterblichkeit Verhältnis, das Bias 9 führen kann passen.

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Protocol

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1. Pre-Chirurgie

  1. Wiegen Rose Bengal in einer 1,5-ml-Röhrchen und lösen sich in steriler Kochsalzlösung bis zum Erreichen einer Endkonzentration von 15 mg / ml. Man filtriert durch ein 0,2 um Filter zu sterilisieren und speichern sie in der Dunkelheit bei Raumtemperatur bis zu zwei Monate.
  2. Sterilisieren alle chirurgischen Instrumente durch Autoklavieren. Der OP-Bereich sollte weniger als eine Stunde vor dem Start der Operation sterilisiert werden.
  3. Notieren Sie die Maus Körpergewicht, die Dosis von Rose Bengal injiziert werden anzupassen. Wir injizierten 10 ul / g Gewicht des Tieres in der weiblichen CD1-Mäusen 12 Wochen alt in der vorliegenden Protokoll. Die Höhe der Rose Bengal benötigt um die gewünschte kortikalen Läsion Größe leicht in einer separaten Reihe von Vorversuchen werden durch das Testen verschiedener Dosierungen (in der Regel 2 ul / g, 5 ul / g oder 10 ul / g Körpergewicht) bestimmt. Beachten Sie, dass die Menge von Rose Bengal injiziert werden stark von den experimentellen Bedingungen ist, insbesondere der Art der Lichtquellesowie die Dauer der Belichtung. In der vorliegenden Studie wurden 10 ul / g (150 g / g) Dosis erwies sich als notwendig, Photothrombose bei Einwirkung von Licht für 15 Minuten zu induzieren, während andere Gruppen berichtet, dass entweder 50 ug / g 6,8 und 100 ug / g 10 intraperitoneale Injektion war ausreichend zur Induktion einer photothrombotic Läsion.

2. Anästhesie Vorgehen

  1. Anesthetize Mäuse mit Isofluran in einem transparenten Ansaugkammer (3,5-4% für die Induktion, 1.5-2% zur Aufrechterhaltung) in 50% (v / v) oxygen/50% (v / v) Distickstoffmonoxid Gasgemisch. Gasförmige Anästhesie ermöglicht eine schnelle Aufwachen der Tiere und das Niveau der Narkosegas kann leicht angepasst werden. Alternativ können Mäuse auch betäubt werden durch eine Ketamin-Xylazin Mischung.
  2. Wenn tiefe Narkose erreicht ist, entfernen Sie den narkotisierten Tier aus der Induktion Kammer, legen Sie es in den stereotaktischen Rahmen und Aufrechterhaltung einer Narkose mit einer Gesichtsmaske. Stellen Sie die isoflurane Dosis eine ausreichende Anästhesie Niveau zu erreichen. Überwachen Sie die Atemfrequenz während des gesamten Verfahrens und stellen Sie sicher, es ist konstant (40 - 60 Atemzüge pro Minute).
  3. Verwenden Zeh drückt, um sicherzustellen, das Tier tief narkotisiert.
  4. Bewerben Augensalbe, um die Augen vor dem Austrocknen zu verhindern.
  5. Schieben Sie die rektale Sonde, um die Temperatur in den chirurgischen Verfahren zu überwachen. Stellen Sie die zugehörigen rückkopplungsgesteuerten Heizkissen für die Aufrechterhaltung der Maus Körpertemperatur bei 37 ± 0,5 ° C.

3. Chirurgie für die Illumination der Zielfläche

  1. Rasur der Maus Kopfhaut mit einem elektrischen Rasierer.
  2. Fest sichern den Kopf und legen Sie die Ohr Bars in äusseren Gehörgang. Seien Sie vorsichtig, nicht zu beschädigen Trommelfelle.
  3. Desinfizieren Sie die Haut auf der Oberfläche mit wechselnden Seitenhiebe von 70% Ethanol und betadine mit Wattestäbchen.
  4. Mit einem Skalpell einen Schnitt entlang der Mittellinie machen aus dem Auge leVel bis in den Nacken. Wenden Sie Haut Aufrolleinrichtungen zu halten, der Schädel freigelegt.
  5. Vorsichtig einfahren Periost zu den Rändern des Schädels mit einem Skalpell und lassen den Schädel Oberfläche trocknen mit sterilen Wattestäbchen. Identifizieren Sie die Bregma und Lambda. Legen Sie eine Glasmikropipette am Bregma als Bezugspunkt, dann verschieben Sie sie in den Koordinaten der Region von Interesse. Die Region von Interesse für diesen Artikel ausgewählt ist etwa rundweg geformt, zentriert etwa 2 mm lateral der Bregma und bedeckt eine Fläche von etwa 30 mm 2, die einen großen Teil des sensomotorischen Kortex umfasst nach der Maus Gehirn Atlas von Franklin und Paxinos 11.
  6. Markieren Sie die Position von Interesse mit Bezugspunkten und legte einen Lichtwellenleiter in engem Kontakt mit dem Schädel Oberfläche der Lichtstreuung zu vermeiden, aber achten Sie nicht, um Druck auf sie auszuüben. Der beleuchtete Bereich durch Aufbringen auf den Schädel einer Maske mit kleinen Öffnung oder eine Kappe an der Spitze der optischen Faser GUI eingeschränktde.

4. Rose Bengal Injection und Aktivierung

  1. Laden der Rose Bengal Lösung in einer 1 ml Spritze und berechnen die nach einer Dosis von 10 ul / g Körpergewicht injiziert werden.
  2. Gehen Sie zu einem langsamen intraperitoneale Injektion.
  3. Lassen Sie den Farbstoff diffus und in die Blutbahn eindringen. Nach 5 min auf dem Kaltlichtbeleuchtung wechseln. Vermeiden Beleuchtung des Tieres durch eine andere Lichtquelle. Wir verwendeten Glasfaser-Beleuchtung von 150 W Intensität.
  4. Nach 15 min der Beleuchtung, Bremslicht Belichtung und vernähen die Wunde. Fünf Minuten Beleuchtung produzieren bereits Infarkt und 10 min dürfte ausreichen, um eine maximale Wirkung zu erhalten 12. Um die Variabilität zu minimieren, wählen wir für 15 min zu beleuchten.

5. Naht

  1. Entfernen Sie die Haut Gurtstraffer und gelten steriler Kochsalzlösung, um eine Dehydratation zu vermeiden.
  2. Schließen Sie die Wunde mit Reverse Schneiden needle und Seide oder Nylon Faden.
  3. Unterbrechen Anästhesie, entfernen Sie vorsichtig mit der Maus aus dem stereotaktischen Apparat und legte es auf einen vorgewärmten Heizkissen, bis es vollständig wach ist, dann wieder in seinen Käfig. Die Körpertemperatur sollte sorgfältig im Laufe der Verfahren überwacht werden, um die Variabilität in der Infarkt-Erweiterung zu begrenzen. Nach der Konzentration und der Art der Verabreichung, Rose Bengal immer noch in den Blutstrom über mehrere Stunden nach der Injektion 13 detektiert werden. Ziehe die Heizdecke an Wärmelampe potenziellen Folgeschäden (Rose Bengal Absorption Wellenlänge im grünen Spektrum) zu vermeiden.

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Representative Results

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Dieses Protokoll wird einen kortikalen Läsionen, die bereits sichtbar auf Dissektion der Rinde mit dem bloßen Auge (1A bis 1C). Die photothrombotic Läsion entwickelt in oberflächlichen und tiefen kortikalen Schichten, in denen das Gewebe ausreichend durchscheinend ist, um das Foto-Aktivierung des Rose Bengal zu ermöglichen. Messung des Ausmaßes der Hirninfarkt schnell durch histologische Färbung durchgeführt werden mit Triphenyl-Tetrazoliumchlorid (TTC) auf einem Gewebe oder Kresylviolett nach Fixierung in 4% Paraformaldehyd (PFA). Vor TTC Inkubation wird die frisch präparierten Gehirn in einem Gehirn Slicer positioniert und geschnitten in 1 mm dicke Scheiben (Abbildung 1C). TTC markiert intaktem Gewebe in rot, während die Infarkt-Gebiet erscheint blass, das ermöglicht eine präzise Messung der Infarkt Bereich (Abb. 1D-1E). Die Zone der unvollständigen Ischämie Penumbra definiert ist sehr reduzierte oder nicht vorhandene entsprechend der Größe der Läsion.

Ebenso ermöglicht die Kresylviolett Färbung die Identifizierung von ungefärbten Infarktbereichen wie der lila-gefärbten umliegende Gewebe verglichen. Die reaktive Proliferation und Infiltration (die sich während der ersten Woche nach der Läsion) auch beurteilt (Fig. 2A1-2A2), ebenso wie das Auftreten einer glialen Narbe (Fig. 2B1-2B2). Die negative Kontrolle erfolgt, indem die gleichen Operationen und Farbstoff Injektion, aber ohne die in der Kälte Lichtquelle. Die Läsion ist reproduzierbar in Größe und Position zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Läsion (3A-3B). Die Infarkt-Bereich im Allgemeinen erreicht seine maximale Größe von 4 bis 6 Stunden nach der Injektion 14 Rose Bengal und anschließend reduziert schnell ab 2 Tage bis 4 Tage nach Photothrombose. Die Bestrahlung erfolgt in den oberflächlichen Schichten mehr, aber große Schiffe in den tiefen kortikalen Schichten vielleicht auch wegen der verschlossen werdenKompression durch die Läsion 7 provoziert. Es ist wichtig, um die Reproduzierbarkeit der Läsion vor der Behandlung zu untersuchen, weil die Verteilung des Gehirns pial microvasculature zwischen Tieren unterschiedlichen Alters oder Belastung variieren.

Abbildung 1
Abbildung 1. Makroskopischen Aussehen photothrombotical Läsion im Gehirn der Maus CD1 4 Tage nach Photothrombose. AB. Seitliche und frontale Ansicht. Die oberflächliche Infarkt (Pfeilspitzen) wird als eine weiße Region mit bloßem Auge. C. Das Gehirn ist in Gehirn Slicer positioniert und geschnitten schnell zu 1 mm dicken Abschnitte. DF. Messung des Ausmaßes der Hirninfarkt durch TTC-Färbung durchgeführt werden kann . Nekrosen innerhalb der thrombotischen Läsion CharakterIzed durch das Fehlen der Färbung. Coronal Scheiben des Gehirns in AC dargestellt sind in rostral nach kaudal Erweiterung von D bis F dargestellt.

Abbildung 2
Abbildung 2. Repräsentative zeitliche Entwicklung photothrombotic Schäden. Coronal Abschnitte der erwachsenen C57BL / 6 Maus Gehirn wurden durch Kresylviolett gefärbt. A1, A2. 7 Tage nach der Verletzung eine hohe Anzahl von Zellen sammelt sich an der Grenze Infarkt. B1, B2. Bei 30, die Läsion stark reduzierten und Glianarbe bildet. A2 und B2 sind hohe Vergrößerung von A1 bzw. B1. Maßstab Bars: A1, B1: 1 mm; A2 B2: 0,5 mm.

Abbildung 3
Abbildung 3. Makroskopische Aussehen des Gehirns bei 2, 4 und 16 Tage nach Photothrombose. A. Mikrophotogramme PFA-perfundierten Gehirne, für weitere immunhistologische Analyse vorbereitet. Infarktgebiet markiert ist (gestrichelte Linie). B. Vergleich der Fläche nach 2, 4 und 16 Tage nach der Läsion. n = 4 in jeder Gruppe. * P <0,05 (Student-t-Test).

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Discussion

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Modifikationen und Substitutionen

Wegen seiner Absorptions-Peak bei 562 nm, wurde ein grünes Licht Laser aus einer gefilterten Xenonbogenlampe ursprünglich gewählt, um die lichtempfindliche Rose Bengal bestrahlen. Obwohl Laser-vermittelte Erregung wurde noch recently5 verwendet, kann es durch Kaltlichtlampe ersetzt werden, auch dafür sorgen, Farbstoffanregung 10,15. Kaltlicht optischen Fasern sind leichter zu manipulieren und weniger teuer als Laserquellen. Es sollte jedoch bemerkt, dass Laser werden üblicherweise verwendet, um einzelne Oberfläche Arteriolen nach Craniotomie für eine in vivo-Schiffstyp spezifischen Gerinnung 10 abzuzielen.

Versand von empfindlichen Farbstoff wird üblicherweise durch Injektion in die Schwanzvene, die eine Ausbildung für den Erhalt homogene und reproduzierbare Ergebnisse erreicht erfordert. Im Gegensatz dazu ist Intraperitonealinjektion einfacher durchzuführen und Rose Bengal ist nachweisbar in die Blutbahn ein paar Minuten nach 13. Effektive photothrombosis kann durch Anregung des Farbstoffs 5 min nach intraperitonealer Injektion 8, jedoch hohe intraperitonealen Dosis von Rose Bengal in Ratten zeigte erreicht werden, dass Plasma-Konzentration des Farbstoffes weiterhin noch 60 min nach der Verabreichung 13 zu erhöhen. Infundiert intravenöse Injektion von Rose Bengal erhöhen die Reproduzierbarkeit der Läsion 13, aber diese Art der Verabreichung kann Hypotonie bei der Infusion zu schnell (<1,5 min) oder bei hohen Farbstoffkonzentration 5 durchgeführt wird in Verbindung gebracht werden. Zur Vermeidung von Schwankungen des Blutdrucks, der anderen lichtempfindlichen Substanzen wie Erythrosin B verwendet werden, um Schiffe Verschlüsse produzieren, aber dieses Molekül als weniger effizient als Rose Bengal für den gleichen Konzentrationsbereich 5.

Kritische Schritte

Verschiedene Faktoren beeinflussen die Größe der Läsion und Tiefe wie die Konzentration der Farbstoff, die Latenz zwischen dem Farbstoff injectiauf und Beleuchtung, die Intensität der Lichtquelle, wobei der Durchmesser des erleuchteten Oberfläche der Expositionsdauer und Körpertemperatur während und nach der Operation. Der Winkel der Lichtquelle auf dem Schädel können auch Einfluss auf die Form der Infarkt. Eine Reihe von Vorversuchen sollte durchgeführt werden, um die Reproduzierbarkeit zu testen und die minimale Menge an Farbstoff und Bestrahlung Zeit, die eine Läsion beeinflussen selektiv den Zielbereich und / oder zu erhalten significative Verhaltens Defizit produzieren zu bestimmen.

Einschränkungen der Technik

Diese Technik wurde entwickelt, um die menschliche Hub durch Induktion Thrombozytenaggregation bei zerebraler Ischämie 4 beobachtet imitieren. Allerdings photothrombotic Schaden geringfügig von menschlichen Schlaganfall. Zunächst wird Thrombose in große Zahl von Schiffen in der beleuchteten Fläche ausgelöst, während Hub wird typischerweise durch Unterbrechung des Blutflusses in einem einzigen Endgerät Arterie. WieFolge sind einige Regionen des Gehirns, deren Stoffwechsel wird nur teilweise durch die Arterie unterzogen die Durchblutung Unterbrechung unterstützt zunächst weniger betroffen, da sie Blutversorgung durch Kollateralarterien empfangen kann und nicht unterziehen nekrotischen Zelltod. Am Gegenteil, die gut definierte Grenze von Photothrombose Ergebnisse in einem sehr begrenzten Penumbra produziert, das ist das Hauptziel der post-Ischämie neuroprotektive Mittel. Auch in einer Untergruppe von Schlaganfall-Patienten tritt Reperfusion spontan und kann Folgeschäden (einschließlich der Reperfusion) zu entlocken. Um diesen besonderen Aspekt der Ischämie zu studieren, sind vorübergehende Okklusion Modelle besser geeignet.

Das Muster der Infarkt selbst zeigt einige Merkmale, die aus menschlichen Schlaganfall unterscheiden. MRT zeigt eine gleichzeitige Entwicklung des ischämischen Infarkt und vasogenen Ödem in großen photothrombotic Läsion während der Entwicklung der ischämischen Infarkt herrscht über vasogenen Ödem in human Hub 16. Umgekehrt kann Photothrombose nicht geeignet für die Untersuchung von anti-thrombotische Agens Studien aufgrund der Tatsache, dass photothrombotic Infarkt tritt auch nach der Blockierung von Blutplättchen oder Hemmung der endogenen Gerinnungssystem 17. Tatsächlich wurde vorgeschlagen, dass in besonderen Bedingungen der Blutplättchen Gerinnung nicht notwendig war, photothrombotic Okklusion in der Störung der endothelialen Integrität Ödem und die damit verbundenen Kompression der umgebenden Gefäße induzieren würde. Darüber hinaus in der gleichen Studie MRI-Analyse zeigte keine Veränderung der Infarktgröße nach Blockade der Thrombozytenfunktion und der Abbau von Thrombozyten 17.

Bedeutung in Bezug auf bestehende Methoden

Zahlreiche gut standardisierte Modelle fest, vorübergehende, fokale und globale Ischämie, mechanisch oder chemisch induziert wurden bei Nagetieren entwickelt, um genau imitieren die menschliche Hub Pathophysiologie und entwip neue neuroprotektive Strategien. Die Photothrombose hier vorgestellte ist ein Modell der permanenten fokalen Ischämie induziert, die konsequent einen Schlaganfall Verletzungen der gewünschten Größe in einem kortikalen oder subkortikalen Website in einem sehr gut reproduzierbar und minimal-invasive Weise. Dieses Modell zeigt eine hohe Überlebensrate, dass die 100% erreicht in unseren Experimenten (25 Tiere), während weitere umfangreiche Untersuchungen erhaltenen 98,4% 18. Die photothrombotic Läsion angepasst, um eine exakte Funktion entsprechend der Zielregion und Verhaltensstörungen Rekuperation beeinflussen kann von mehreren Tests 6,19 bewertet werden. Darüber hinaus ist dieser Ansatz nicht zeitaufwendig, teuer und nur wenige können schnell erlernt werden, da es technisch nicht anspruchsvoll ist, wie bei anderen Modellen, einschließlich der Filament-Modell entgegen. Zusätzlich wird der Gefäßverschluss durch Induktion der lokalen Bildung von Thromben, die strukturell ähnlich zu denen in der menschlichen Hubende erreicht. Allerdings wurde die photothrombotic Ansatz auch für den pr angepasstoducing Verschlüsse der Arteria cerebri media 20. Der Ring Läsionsmodell später entwickelt werden, um eine größere Penumbra erhalten. Es besteht aus einer Beleuchtung unter der Form von einem Kreis, in dessen Mitte die kortikalen Bereich von lebensfähigen Gewebes von einer kreisförmigen geschädigte Gewebe umgeben ist und gemeinsam die biochemischen und molekularen Eigenschaften des ischämischen Penumbra 21,22. Varianten der Technik sind auch für die Durchführung Schlaganfall in das sich entwickelnde Gehirn in 23 oder 24 subkortikalen Gewebe.

Zusammenfassend ist Photothrombose ein einfach zu ischämischen Modell mit hoher Reproduzierbarkeit durchzuführen. Darüber hinaus ist es für eine Reihe von experimentellen Studien Hub, insbesondere zur Auswertung von kortikalen Plastizität in Reaktion auf Hirnverletzung, sowohl zellulärer und molekularer Ebene.

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Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgments

Wir danken Annalisa Buffo für aufschlussreiche Anregungen und Kommentare, und Maurizio Grassano, Marina Boido und Ermira Pajaj für die Dreharbeiten. Diese Arbeit wurde von FP7-MC-214003-2 (Marie Curie Initial Training Network AXREGEN) und der Compagnia di San Paolo, gliarep Projekt finanziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Solutions and chemicals
Rose Bengal Sigma, Italy 330000
Isoflurane Vet Merial 103120022
Betadine Asta Medica
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
Surgical material and equipment
Fluosorber Filter Havard apparatus 340415
150W fiber optic illuminator Photonic PL3000
Temperature Controller for Plate TCAT-2DF Havard apparatus 727561
Stereotaxic Instrument Stoelting 51950
Operating microscope Takagi OM8
Heating pad
Oxygen and nitrogen gas
Surgery Tools World precision instrument Optic fiber taps and mask are custom-made

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References

  1. Lopez, A. D., Mathers, C. D., Ezzati, M., Jamison, D. T., Murray, C. J. Global and regional burden of disease and risk factors. Lancet. 367, 1747-1757 (2001).
  2. Mathers, C. D., Boerma, T., Ma Fat, D. Global and regional causes of death. Br. Med. Bull. 92, 7-32 (2009).
  3. Rosenblum, W. I., El-Sabban, F. Platelet aggregation in the cerebral microcirculation: effect of aspirin and other agents. Circ. Res. 40, 320-328 (1977).
  4. Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Ann. Neurol. 17, 497-504 (1985).
  5. Bergeron, M. Inducing photochemical cortical lesions in rat brain. Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 9, Unit 9 16 (2003).
  6. Lee, J. K., et al. Photochemically induced cerebral ischemia in a mouse model. Surg. Neurol. 67, 620-625 (2007).
  7. Dietrich, W. D., Watson, B. D., Busto, R., Ginsberg, M. D., Bethea, J. R. Photochemically induced cerebral infarction. I. Early microvascular alterations. Acta Neuropathol. 72, 315-325 (1987).
  8. Schroeter, M., Jander, S., Stoll, G. Non-invasive induction of focal cerebral ischemia in mice by photothrombosis of cortical microvessels: characterization of inflammatory responses. J. Neurosci. Methods. 117, 43-49 (2002).
  9. Kitagawa, K., et al. Cerebral ischemia after bilateral carotid artery occlusion and intraluminal suture occlusion in mice: evaluation of the patency of the posterior communicating artery. J. Cereb. Blood Flow Metab. 18, 570-579 (1998).
  10. Sigler, A., Goroshkov, A., Murphy, T. H. Hardware and methodology for targeting single brain arterioles for photothrombotic stroke on an upright microscope. J. Neurosci. Methods. 170, 35-44 (2008).
  11. Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. 1st, Academic Press. New York. (1997).
  12. Piao, M. S., Lee, J. K., Jang, J. W., Kim, S. H., Kim, H. S. A mouse model of photochemically induced spinal cord injury. J. Korean Neurosurg. Soc. 46, 479-483 (2009).
  13. Silva, V. M., Corson, N., Elder, A., Oberdorster, G. The rat ear vein model for investigating in vivo thrombogenicity of ultrafine particles (UFP). Toxicol. Sci. 85, 983-989 (2005).
  14. Watson, B. D., Prado, R., Dietrich, W. D., Ginsberg, M. D., Green, B. A. Photochemically induced spinal cord injury in the rat. Brain Res. 367, 296-300 (1986).
  15. Van Reempts, J., Van Deuren, B., Van de Ven, M., Cornelissen, F., Borgers, M. Flunarizine reduces cerebral infarct size after photochemically induced thrombosis in spontaneously hypertensive rats. Stroke. 18, 1113-1119 (1987).
  16. Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2, 396-409 (2005).
  17. Kleinschnitz, C., et al. Blocking of platelets or intrinsic coagulation pathway-driven thrombosis does not prevent cerebral infarctions induced by photothrombosis. Stroke. 39, 1262-1268 (2008).
  18. Porritt, M. J., et al. Photothrombosis-induced infarction of the mouse cerebral cortex is not affected by the Nrf2-activator sulforaphane. PLoS One. 7, e41090 (2012).
  19. Baskin, Y. K., Dietrich, W. D., Green, E. J. Two effective behavioral tasks for evaluating sensorimotor dysfunction following traumatic brain injury in mice. J. Neurosci Methods. 129, 87-93 (2003).
  20. Markgraf, C. G., et al. Comparative histopathologic consequences of photothrombotic occlusion of the distal middle cerebral artery in Sprague-Dawley and Wistar rats. Stroke. 24, 286-292 (1993).
  21. Wester, P., Watson, B. D., Prado, R., Dietrich, W. D. A photothrombotic 'ring' model of rat stroke-in-evolution displaying putative penumbral inversion. Stroke. 26, 444-450 (1995).
  22. Hu, X., Wester, P., Brannstrom, T., Watson, B. D., Gu, W. Progressive and reproducible focal cortical ischemia with or without late spontaneous reperfusion generated by a ring-shaped, laser-driven photothrombotic lesion in rats. Brain Res. Brain Res. Protoc. 7, 76-85 (2001).
  23. Maxwell, K. A., Dyck, R. H. Induction of reproducible focal ischemic lesions in neonatal mice by photothrombosis. Dev. Neurosci. 27, 121-126 (2005).
  24. Kuroiwa, T., et al. Development of a rat model of photothrombotic ischemia and infarction within the caudoputamen. Stroke. 40, 248-253 (2009).
Photothrombotic Ischämie: eine minimal-invasive und reproduzierbare photochemische kortikale Läsion Modell für Mouse Stroke Studies
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Labat-gest, V., Tomasi, S. Photothrombotic Ischemia: A Minimally Invasive and Reproducible Photochemical Cortical Lesion Model for Mouse Stroke Studies. J. Vis. Exp. (76), e50370, doi:10.3791/50370 (2013).More

Labat-gest, V., Tomasi, S. Photothrombotic Ischemia: A Minimally Invasive and Reproducible Photochemical Cortical Lesion Model for Mouse Stroke Studies. J. Vis. Exp. (76), e50370, doi:10.3791/50370 (2013).

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