Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

איסכמיה Photothrombotic: דגם נגע פולשנית לשעתק פוטו קליפתיים לעכבר מחקרי שבץ

doi: 10.3791/50370 Published: June 9, 2013

Summary

Photothrombosis היא טכניקה מהירה, מינימאלי פולשנית לגרימת אוטם קטן ומופרד היטב בתחומי העניין באופן מאוד לשחזור. זה מתאים במיוחד ללימוד תגובות תאיות ומולקולריים שבבסיס פלסטיות מוח בעכברים מהונדסים.

Abstract

מודל שבץ photothrombotic מטרתו לגרום נזק איסכמי באזור בקליפת המוח שניתן על ידי אמצעי צילום ההפעלה של צבע רגיש לאור הזריק בעבר. בעקבות תאורה, הצבע מופעל ומייצר חמצן גופייה שרכיבי נזקים של קרומי תאי אנדותל, עם הצטברות טסיות דם ולאחר מכן היווצרות thrombi, שסופו של דבר קובע את ההפרעה של זרימת דם מקומית. גישה זו, בתחילה הוצעה על ידי רוזנבלום ואל Sabban בשנת 1977, מאוחר יותר השתפר ובוטסון בשנת 1985 במוח חולדה ולהגדיר את הבסיס של המודל הנוכחי. כמו כן, הזמינות המוגברת של קווי עכבר מהונדסים עוד תרמה להעלאת ריבית על מודל photothrombosis. בקצרה, צבע רגיש (רוז בנגל) מוזרק intraperitoneally ונכנס לזרם הדם. כאשר מוארים על ידי מקור אור קר, הצבע הופך להיות פעיל וגורם לניזק אנדותל עם הפעלה ופקק טסיות דם, וכתוצאה מכך מקומיתהפרעה לזרימת דם. מקור האור יכול להיות מיושם על הגולגולת השלמה ללא צורך בפתיחת הגולגולת, המאפשר מיקוד של כל אזור בקליפת המוח של עניין בדרך לשחזור ולא פולשנית. העכבר לאחר מכן נתפר ואפשרו להתעורר. ההערכה של נזק איסכמי יכולה להתבצע במהירות על ידי כלוריד triphenyl-tetrazolium או כתמים סגול cresyl. טכניקה זו מייצרת אוטם בגודל קטן וגבולות מופרדים היטב, וזה יתרון מאוד לאפיון מדויק של תאים או מחקרים תפקודיים. יתר על כן, הוא מתאים במיוחד ללימוד תגובות תאיות ומולקולריים שבבסיס פלסטיות מוח בעכברים מהונדסים.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

בתחילת המאה ה -21, שבץ איסכמי הוא הפרעה הרסנית, המייצגת את הגורם השני של נכות לטווח ארוכים 1 והגורם השני לתמותה בעולם, שבו השבץ היווה כ 5,7 מיליון מקרי מוות בשנת 2004 2. למרות המאמצים הרבים שהשקיעו, אין עדיין טיפול יעיל זמין כדי לשפר את ההתאוששות תפקודית לאחר שבץ. מודלים של בעלי חיים של שבץ נמצאים בשימוש נרחב בתחום מחקר שבץ מאחר שהם מאפשרים מידול של הפתופיזיולוגיה של נזק איסכמי ולבדוק את היעילות של אסטרטגיות neuroprotective שונות in vivo. רוב המודלים האלה שואפים לגרום לאוטם נרחב על ידי הפרעה (זמני או קבוע) זרימת הדם בתוך עורק המוח האמצעי, ואילו דגמים אחרים פותחו ללמוד נגעים בגודל קטן באזורים ספציפיים, בדרך כלל רכב וקליפת המוח חושי. עם זאת, מספר גורמים עשויים לתרום ליצירת ACתואר ertain של השתנות במחקרים ניסיוניים שבץ, כוללים זן העכבר בשימוש, גיל והמין של בעלי חיים שנכללו במחקר, ומעל לכל, את הטכניקה אימצה כדי לגרום את נזק איסכמי. בהתייחס לנקודה האחרונה, משך הזמן והפולשנות של הניתוח (כלומר את הצורך בפתיחת גולגולת), כמו גם את המיומנות כירורגית נדרשת למפעיל כדי לגרום לנגע איסכמי מהימן הם גורמים קריטיים להצלחה ובלתי משוחד במחקר שבץ vivo .

הרעיון של photothrombosis בתחילה הוצע על ידי רוזנבלום ואל Sabban בשנת 1977 והפך 3 נודע על ידי היישום שלה במוח חולדה על ידי ווטסון ואח' בשנת 1985 4 שבטכניקה השתפרה במידה רבה, ולהגדיר את הבסיס של המודל הנוכחי 3. - 6. גישת photothrombotic מטרתו לגרום לאוטם קליפת המוח דרך צילום ההפעלה של צבע רגיש לאור נמסרה בעבר למערכת דם, WHIch התוצאה פקקת כלי מקומי באזורים החשופים לאור. כאשר הצבע במחזור מואר באורך הגל המתאים על ידי מקור אור קר, הוא משחרר אנרגיה למולקולות חמצן, אשר בתורו לייצר כמות גדולה של מוצרי חמצן גופייה תגובתי. ביניים חמצן אלו לגרום לחמצון ממברנת תא האנדותל, שהובילו להידבקות ואגרגציה של טסיות דם, וסופו של דבר להיווצרות של thrombi אשר קובעת הפרעה זרימת מוחין מקומית 7.

Photothrombosis הוא מודל איסכמי שאינם קנוני שלא לחסום או לשבור את עורק אחד בלבד כפי שקורה בדרך כלל בשבץ מוחי אנושי, אבל גורם לנגעים בכלי שטחיים יותר, וכתוצאה מההפרעה סלקטיבית של זרימת דם באזורים החשופים לאור. מסיבה זו, גישה זו עשויה להיות מתאימה ללימודים תאיים ומולקולריים של פלסטיות בקליפת המוח. היתרון העיקרי של שיטה זו נמצא בפשטות הפעלה שלו.יתר על כן, ניתן לבצע בקלות בphotothrombosis כארבעים דקות לכל בעל חיים, כולל המתנה בת עשרים דקות (3 דקות להרדמה; 1 דקות לגלח את הקרקפת; 3 עד 5 דקות למקום את החיה על מנגנון stereotaxic; 2 דקות לקרצף קרקפת עם תמיסת חיטוי, עושה חתך ולנקות את הגולגולת; 2 עד 4 דקות למקום הקרים סיבי האור; 1 דקות להזריק את פתרון נגל הוורד; 5 דקות-ההמתנה לדיפוזיה intraperitoneal; 15 דקות של תאורה, ו5 דקות כדי לנקות את הפצע ותפר את בעלי החיים). יתר על כן, אין צורך במומחיות כירורגית לבצע טכניקה זו כנגע מושרה באמצעות תאורה פשוטה של ​​הגולגולת השלמה. בניגוד לחסימת עורקים קלסית, בשיטה זו קובעת occlusions סלקטיבית של microvessels pial וintraparenchymal בתוך האזור המוקרן ומקטינה את השונות בין נגעים ככלי אין ביטחונות שנותר כדי לספק חמצן באזור ממוקד.

למרות האופי המסוים שלה,מניות נזק photothrombotic מנגנונים חיוניים המתרחשים בשבץ מוחי. בדומה לחסימת עורק בשבץ מוחי אנושי, הצטברות טסיות דם והיווצרות קריש דם לקבוע הפרעה של זרימת דם באזור המוקרן 7. כמו כן, מודל זה גם מניות תגובות דלקתיות חיוניות כמו בחסימת עורק מוח אמצעית 8. עם זאת, בגלל גבולות delimitated היטב, אזור פנומברה, אשר מתאים לאזור של חילוף חומרים נשמרו באופן חלקי, הוא מאוד מופחת או חסר של אחרי נגע photothrombotic. גבול ברור זה יכול להקל על המחקר של תגובות הסלולר באזור קליפת המוח איסכמי או בשלמותה. מודל עכבר Photothrombosis מתאים במיוחד למחקרי שבץ במגוון רחב של בעלי חיים מהונדסים. ואכן מודלים הקלסיים לא יכולים להתאים לכל הזנים והמחקרים תקופה ארוכות בC57BL / 6 זן עכבר דיווח יחס תמותה גבוה שיכולים לגרום להטיה 9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. טרום ניתוח

  1. שוקל רוז בנגל בצינור 1.5 מ"ל ולהתמוסס בתמיסת מלח סטרילית עד שמגיע לריכוז סופי של 15 מ"ג / מ"ל. סנן לעקר דרך מסנן 0.2 מיקרומטר ולאחסן אותו בחושך בטמפרטורה של עד חודשים חדר.
  2. לעקר את כל מכשירי הניתוח ידי מעוקר. אזור הניתוח צריך להיות מחוטא פחות משעה לפני ביצוע הניתוח.
  3. רשום את משקל גוף העכבר כדי להתאים את המינון של רוז בנגל להיות מוזרקת. הזרקנו 10 משקל חיה μl / g בCD1 נקבות עכברי 12 שבועות ישנים בפרוטוקול הנוכחי. הסכום של רוז בנגל דרוש כדי לייצר ניתן לקבוע את גודל נגע קליפת המוח הרצוי בקלות בקבוצה נפרדת של ניסויים ראשוניים על ידי בדיקת מינונים שונים (בדרך כלל 2 μl / g, 5 μl / g או 10 משקל גוף μl / ז). שימו לב שהסכום של רוז בנגל להיות מוזרקים תלוי מאוד בתנאי הניסוי, בעיקר הסוג של מקור אורבשימוש ומשך החשיפה לאור. במחקר הנוכחי, 10 (150 מיקרוגרם / גרם) מינון נמצא μl / g להיות נחוץ כדי לגרום photothrombosis בחשיפה לאור במשך 15 דקות, ואילו קבוצות אחרות דיווחו כי גם 50 מיקרוגרם / g 6,8 ו -100 מיקרוגרם / g 10 זריקת intraperitoneal הייתה מספיקה לגרימת נגע photothrombotic.

2. נוהל הרדמה

  1. הרדימי עכברים עם isoflurane בתא שקוף אינדוקציה (3.5-4% לזירוז, 1.5-2% לשמירה) בשיעור של 50% (V / V) תערובת גז חד תחמוצת dinitrogen oxygen/50% (V / V). הרדמה גזים מאפשרת בעקבות מהיר עד של בעלי החיים והן ברמה של גז הרדמה יכולה להיות מותאמת בקלות. לחלופין, עכברים יכולים גם להיות מורדמים על ידי תערובת קטמין-xylazine.
  2. כשהוא הגיע הרדמה עמוקה, להסיר את החיה מורדמת מתא האינדוקציה, למקם אותו במסגרת stereotaxic ולשמור על הרדמה באמצעות מסיכת הפנים. התאם isofluraמינון ne כדי להשיג רמה נאותה הרדמה. לפקח על קצב הנשימה לאורך כל ההליך ולוודא שהוא קבוע (40 - 60 נשימות לדקה).
  3. השתמש צובט הבוהן על מנת להבטיח את החיה מורדמת היא עמוק.
  4. החל משחה העין, על מנת למנוע את העיניים מהתייבשות.
  5. הכנס בעדינות את הבדיקה רקטלית כדי לנטר את הטמפרטורה לאורך כל ההליכים כירורגיים. הגדר את כרית חימום משוב מבוקרת הקשורים לשמירה על טמפרטורת גוף העכבר על 37 ± 0.5 ° C.

3. ניתוח להארת אזור היעד

  1. לגלח את קרקפת העכבר עם מכונת גילוח חשמלי.
  2. תקיפות לאבטח את הראש ולהכניס את סורגי האוזן לתוך meatus החיצוני. היזהר שלא עור התוף של נזק.
  3. לחטא את העור על פני השטח עם לסירוגין swipes של אתנול 70% ובטאדין באמצעות צמר גפן.
  4. השתמש באזמל כדי לעשות חתך לאורך קו האמצע מעין leVEL עד לצוואר. החל retractors עור כדי לשמור על הגולגולת חשופה.
  5. בעדינות לחזור periostium את הקצוות של הגולגולת עם אזמל ולתת פני הגולגולת לייבש באמצעות צמר גפן סטרילי. זהה את גבחת ולמבדה. הנח micropipette זכוכית על גבחת כנקודת ייחוס, ולאחר מכן להעביר אותו לקואורדינטות של אזור עניין שלך. האזור של עניין נבחר למאמר זה הוא בערך בצורה נמרצות, שמרכז כ 2 מ"מ לרוחב גבחת, ומשתרע על שטח של כ -30 מ"מ 2, הכולל את חלק גדול של קליפת המוח הסנסורית פי עכבר המוח על ידי האטלס ופרנקלין 11 Paxinos.
  6. סמן את המיקום של ריבית עם נקודות התייחסות והכניס סיבים אופטיים בקשר הדוק עם משטח הגולגולת כדי למנוע פיזור אור, אך לשים לב לא להפעיל לחץ עליו. האזור המואר יכול להיות מוגבל על ידי יישום על גולגולת מסכה עם צמצם קטן או כובע בקצה הסיב האופטי GUIדה.

4. הזרקת רוז בנגל והפעלה

  1. טען את פתרון נגל רוז במזרק 1 מ"ל ולחשב את הסכום כדי להיות מוזרק בהתאם למינון של 10 μl / גרם של משקל גוף.
  2. המשך זריקת intraperitoneal איטית.
  3. בוא המפוזר הצבע ולהזין את זרם הדם. לאחר 5 דקות, לעבור על נורת האור הקרה. הימנע מתאורה של בעלי החיים על ידי כל מקור אחר של אור. אנחנו השתמשנו הפנס סיבים אופטי של עצמת W 150.
  4. לאחר 15 דקות של תאורה, להפסיק חשיפה לאור ותפר את הפצע. חמש דקות של תאורה כבר מייצרות אוטם ו10 דקות היא סביר מספיק כדי להשיג אפקט מקסימאלי 12. על מנת למזער את השונות, אנו בוחרים להאיר במשך 15 דקות.

5. תפר

  1. הסר את retractors העור ולהחיל את תמיסת מלח סטרילית כדי למנוע התייבשות.
  2. לסגור את הפצע באמצעות needl חיתוך הפוךדואר ומשי או חוט תפר ניילון.
  3. לקטוע את אספקת הרדמה, להסיר בזהירות את העכבר ממנגנון stereotaxic ולשים אותו על כרית חימום מראש חימם עד שהוא ער לחלוטין, ולאחר מכן להחזיר אותו לכלוב שלה. טמפרטורת גוף צריך להיות במעקב צמוד לאורך כל ההליכים כדי להגביל את ההשתנות בהארכת האוטם. על פי הריכוז והתוואי של ממשל, רוז עדיין ניתן להבחין בנגל בזרם הדם במשך כמה שעות לאחר הזרקת 13. מעדיף את שמיכת החימום למנורת ההתחממות, כדי למנוע נזקים משניים פוטנציאליים (רוז בנגל קליטת אורך הגל הוא בספקטרום הירוק).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

פרוטוקול זה יהיה לייצר נגע קליפת המוח שכבר נראה לעין על נתיחה של קליפת המוח לעין בלתי מזוינת (איורים 1 א ', 1 ג'). נגע photothrombotic מתפתח בשכבות בקליפת המוח שטחיות ועמוקות שבו הרקמה שקופה במידה מספקת כדי לאפשר צילום הפעלה של רוז בנגל. מדידה של היקף אוטם מוחי יכולה להתבצע במהירות על ידי צביעה היסטולוגית עם כלוריד triphenyl-tetrazolium (TTC) על רקמה טריות או על ידי סגול cresyl לאחר קיבוע paraformaldehyde 4% (PFA). לפני הדגירה TTC, המוח טרי גזור ממוקם במבצע מוח ומחולק לפרוסות עבות 1 מ"מ (איור 1 ג). TTC תוויות רקמה שלמה באדום ואילו אזור infarcted מופיע חיוור, המאפשר מדידה מדויקת של אזור האוטם (איורים 1D-1E). האזור של איסכמיה שלמה מוגדרת כהילה הוא מאוד מופחת או חסר של פי גודלו של הנגע.

בדומה לכך, הצביעה הסגולה cresyl מאפשרת זיהוי של אזורי infarcted בלא כתם בהשוואה לרקמה הסובבת סגולה המוכתמת. יכולים גם להיות מוערך ריבוי תגובתי והחדירה סלולרי (אשר מתרחש במהלך השבוע הראשון שלאחר הפגיעה) (איורים 2A1-2A2), כמו גם את המראה של צלקת גליה (איורים 2b1-2B2). הביקורת השלילית מתבצעת על ידי ביצוע אותו הניתוח והזרקת צבע, אך ללא חשיפה למקור האור הקר. הנגע הוא לשחזור בגודל ובמיקום בנקודות זמן שונים לאחר הנגע (איורים 3 א, 3 ב). אזור האוטם בדרך כלל מגיע לגודל המקסימאלי שלו על ידי 4 עד 6 שעות לאחר הזרקת 14 רוז בנגל, ולאחר מכן מפחית במהירות מ2 ימים עד 4 ימים photothrombosis הודעה. ההקרנה מתרחשת בשכבות השטחיות יותר, אבל כלי גדול בשכבות העמוקות בקליפת המוח עשוי גם להיות האפיל בגללדחיסה עוררה על ידי 7 נגע. חשוב לחקור את שחזור של הנגע לפני הטיפול בגלל חלוקת microvasculature pial המוח יכולה להשתנות בין בעלי החיים שונים של גיל או מתח.

איור 1
איור 1. הופעתו של נגע Macroscopical photothrombotical במוח של עכבר CD1 4 ימים לאחר photothrombosis. תצוגה לרוחב וחזיתית. AB. אוטם השטחי (ראשי חץ) מופיע כאזור לבן גלוי לעין בלתי מזוינת. ג המוח ממוקם במבצע המוח ומחולק למקטעים במהירות 1 מ"מ עובי. DF. מדידה של היקף אוטם מוחי יכולה להיות מושלמת על ידי מכתים TTC . רקמות נמקית בתוך קריש הדם היא אופיized ידי היעדר מכתים. פרוסות עטרה של המוח שמודגם בAC מיוצגים מקורי להארכת הזנב מ D ל-F.

איור 2
איור 2. אבולוציה זמנית נציג של נזק photothrombotic. סעיפי עטרה של מבוגר C57BL / מוח עכבר 6 הוכתמו על ידי סגול cresyl. A1, A2. 7 ימים לאחר פציעת מספר גבוה של תאי אוסף בגבול האוטם. B1, B2. בגיל 30, נפח הנגע מופחת מאוד וצלקת גליה היא טביעה. A2 ו B2 הוא ההגדלה גבוהה של A1 ו B1, בהתאמה. סולם ברים: A1, B1: 1 מ"מ; A2 B2: 0.5 מ"מ.

איור 3
איור 3. הופעה מקרוסקופית של המוח בבית 2, 4 ו -16 ימים לאחר photothrombosis. Microphotographs א מוחות PFA-perfused, מוכן לניתוח immunohistological נוסף. אזור infarcted מודגש (קו מקווקו). B. השוואה של שטח הפנים בבית 2, 4 ו -16 ימים לאחר הפגיעה. n = 4 בכל קבוצה. * P <0.05 (מבחן t של סטודנט).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

שינויים והחלפות

בגלל שיא הספיגה שלה ב 562 ננומטר, לייזר אור ירוק ממנורת קשת קסנון מסוננת נבחר במקור כדי להקרין רוז בנגל רגיש לאור. למרות עירור לייזר בתיווך עדיין היה בשימוש recently5, ניתן להחליף אותו על ידי מנורת אור הקרה שגם להבטיח עירור צבע 10,15. סיבים אופטיים אור קר הם קלים יותר לתמרן ופחות יקרים מאשר מקורות לייזר. עם זאת, יש לשים לב כי לייזרים משמשים בדרך כלל כדי למקד משטח arterioles הבודדים לאחר craniotomy לin vivo כלי ספציפי 10 קרישה.

משלוח של צבע רגיש בדרך כלל נעשה על ידי הזרקה לוריד זנב, אשר דורשת הכשרה כלשהי להשגת תוצאות הומוגניות ושחזור. לעומת זאת, זריקת intraperitoneal היא קלה יותר לביצוע ורוז בנגל הוא להבחין בזרם הדם כמה דקות אחרי 13. phototh האפקטיביrombosis יכול להיות מושגת על ידי מרגשת 5 דקות לאחר הזרקת צבע intraperitoneal 8, מינון גבוה של intraperitoneal זאת רוז בנגל בעכברים הראה כי ריכוז הפלזמה של הצבע ימשיך לעלות אפילו 60 דקות לאחר מתן 13. הזרקה תוך ורידית של רוז בנגל חדור יכולה להגדיל את שחזור של הנגע 13, אולם זה דרכו של הממשל יכולה להיות קשורה לירידה בלחץ דם במקרה העירוי מבוצע מהר מדי (<1.5 דקות) או בריכוז גבוה 5 צבע. להימנעות מתנודות בלחץ דם, ניתן להשתמש בחומרים אחרים רגישים כגון Erythrosin B לייצר כלי occlusions, לעומת זאת מולקולה זו נחשבת פחות יעילה מאשר רוז בנגל עבור אותו הטווח של ריכוז 5.

שלבים קריטיים

גורמים שונים משפיעים על גודל נגע ועומק כגון ריכוז של הצבע רגיש, ההשהיה בין injecti הצבעובתאורה, את עוצמתו של מקור האור, הקוטר של המשטח הנאור, משך החשיפה וטמפרטורת הגוף במהלך ואחרי הניתוח. הזווית של מקור האור על הגולגולת יכולה להשפיע גם על צורתו של האוטם. סדרה של ניסויים ראשוניים צריכה להתבצע כדי לבדוק את שחזור וכדי לקבוע את הסכום המינימאלי של צבע וזמן הקרנה אשר מייצר נגע המשפיע באופן סלקטיבי לאזור היעד ו / או להשיג גירעון התנהגותי significative.

מגבלות של הטכניקה

טכניקה זו פותחה על מנת לחקות שבץ אנושי על ידי גרימת הצטברות טסיות דם כפי שנצפה במהלך 4 איסכמיה מוחית. עם זאת נזק photothrombotic שונה מעט משבץ מוחי אנושי. קודם כל, פקקת מופעלת במספר הגדול של כלי שיט באזור המואר, ואילו שבץ מוחי נגרם בדרך כלל על ידי הפרעה של זרימת דם בתוך עורקי מסוף יחיד. כמותוצאה מכך, חלק מהאזורים במוח, חילוף החומרים שהוא נתמך רק באופן חלקי על ידי העורק עובר הפרעה זרימת הדם בתחילה פחות מושפע הן כפי שהם עשויים לקבל אספקת דם על ידי עורקים בטחונות ולא עוברים מוות של תאי נמקי. בניגוד לגבול המוגדר היטב המיוצר על ידי תוצאות photothrombosis בהילה מאוד מוגבלת, כי הוא המטרה העיקרית של סוכני neuroprotective לאחר איסכמיה. כמו כן, בתת קבוצה של חולים שעבר שבץ, reperfusion מתרחשת באופן ספונטני ועלולה לעורר נזקים משניים (כולל פגיעת reperfusion). ללמוד היבט המסוים הזה של איסכמיה, מודלים חסימה חולפים הם מתאימים יותר.

הדפוס של אוטם עצמו מציג כמה מאפיינים שונים משבץ מוחי אנושי. בדיקת MRI מראה התפתחות בו זמנית של אוטם איסכמי ובצקת vasogenic בנגע photothrombotic גדול ואילו ההתפתחות של אוטם איסכמי גוברת על בצקת vasogenic בומאn שבץ 16. לעומת זאת, photothrombosis לא יכול להיות מתאים ללימוד מחקרי סוכן אנטי טרומבוטיים בשל העובדה שאוטם photothrombotic מתרחש גם לאחר החסימה של טסיות דם או עיכוב של מסלול קרישה פנימי 17. אכן זה הוצע כי בתנאים ייחודיים קרישת טסיות הדם לא הייתה צורך חסימת photothrombotic בי שיבוש שלמות האנדותל הייתי לגרום לבצקת ודחיסה של כלי משויכים שמסביב. יתר על כן באותו ניתוח MRI מחקר לא הראה שינוי של הגודל האוטם לאחר מצור של תפקוד טסיות דם או דלדול של טסיות דם 17.

משמעות ביחס לשיטות קיימות

מודלים סטנדרטיים היטב רבים של איסכמיה קבועה, ארעית, והמוקד העולמי, מכאני או כימי מושרה, פותחו במכרסמים על מנת לחקות באופן הדוק הפתופיזיולוגיה השבץ המוחי האנושית וdeveloאסטרטגיות neuroprotective החדשות p. Photothrombosis כפי שהוצג כאן הוא מודל של איסכמיה מוקד הקבועה שגורמת לפגיעת שבץ בגודל הרצוי בכל אתר או קליפת המוח subcortical בצורה מאוד לשעתק ופולשנית באופן עקבי. מודל זה מראה ששיעור הישרדות גבוה שהגיעו ל -100% בניסויים שלנו (25 חיות) ואילו מחקרים נרחבים יותר השיגו 98.4% 18. נגע photothrombotic יכול להיות מותאם אישית כדי להשפיע על תפקוד מדויק בהתאם לאזור ממוקד וההבראה התנהגותי ניתן להעריך על ידי בדיקות מרובות 6,19. יתר על כן גישה זו אינה גוזל זמן, כמה יקרה וניתן ללמוד במהירות כפי שהוא לא תובעני מבחינה טכנית, בניגוד לדגמים אחרים, כולל דגם חוט הלהט. בנוסף חסימת כלי הדם מושגת על ידי זירוז היווצרות המקומית של thrombi שהם דומים מבחינה מבנית לאלו שנצפו באירוע מוחי אנושי. עם זאת, גישת photothrombotic גם מותאמת ליחסי הציבורocclusions oducing של עורק 20 אמצע מוחין. מודל נגע הטבעת מאוחר יותר פיתחה על מנת לקבל עליו הילה גדולה יותר. זה מורכב של תאורה מתחת לצורת עיגול, ובמרכזו האזור של רקמת קליפת המוח קיימא מוקף ברקמה פגועה מעגלית וחולק את מאפייני ביוכימיים ומולקולריים של הילת איסכמי 21,22. נוסחים שונים של טכניקה זמינים לביצוע בשבץ המוח המתפתח 23 או ברקמת subcortical 24 גם.

לסיכום, photothrombosis הוא קל לביצוע מודל איסכמי עם שחזור גבוה. יתר על כן, הוא מתאים למספר מחקרים ניסיוניים שבץ, במיוחד להערכה של פלסטיות קליפת המוח בתגובה לפגיעה במוח, ברמה תאית ומולקולרית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Acknowledgments

אנו מודים Annalisa Buffo להצעות והערות, תובנות ומאוריציו Grassano, מרינה Boido וErmira Pajaj לירי. עבודה זו מומנה על ידי FP7-MC-214,003-2 (מארי קירי ראשוני ההדרכה AXREGEN רשת) וCompagnia די סן פאולו, פרויקט gliarep.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Solutions and chemicals
Rose Bengal Sigma, Italy 330000
Isoflurane Vet Merial 103120022
Betadine Asta Medica
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
Surgical material and equipment
Fluosorber Filter Havard apparatus 340415
150W fiber optic illuminator Photonic PL3000
Temperature Controller for Plate TCAT-2DF Havard apparatus 727561
Stereotaxic Instrument Stoelting 51950
Operating microscope Takagi OM8
Heating pad
Oxygen and nitrogen gas
Surgery Tools World precision instrument Optic fiber taps and mask are custom-made

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lopez, A. D., Mathers, C. D., Ezzati, M., Jamison, D. T., Murray, C. J. Global and regional burden of disease and risk factors. Lancet. 367, 1747-1757 (2001).
  2. Mathers, C. D., Boerma, T., Ma Fat, D. Global and regional causes of death. Br. Med. Bull. 92, 7-32 (2009).
  3. Rosenblum, W. I., El-Sabban, F. Platelet aggregation in the cerebral microcirculation: effect of aspirin and other agents. Circ. Res. 40, 320-328 (1977).
  4. Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Ann. Neurol. 17, 497-504 (1985).
  5. Bergeron, M. Inducing photochemical cortical lesions in rat brain. Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 9, Unit 9 16 (2003).
  6. Lee, J. K., et al. Photochemically induced cerebral ischemia in a mouse model. Surg. Neurol. 67, 620-625 (2007).
  7. Dietrich, W. D., Watson, B. D., Busto, R., Ginsberg, M. D., Bethea, J. R. Photochemically induced cerebral infarction. I. Early microvascular alterations. Acta Neuropathol. 72, 315-325 (1987).
  8. Schroeter, M., Jander, S., Stoll, G. Non-invasive induction of focal cerebral ischemia in mice by photothrombosis of cortical microvessels: characterization of inflammatory responses. J. Neurosci. Methods. 117, 43-49 (2002).
  9. Kitagawa, K., et al. Cerebral ischemia after bilateral carotid artery occlusion and intraluminal suture occlusion in mice: evaluation of the patency of the posterior communicating artery. J. Cereb. Blood Flow Metab. 18, 570-579 (1998).
  10. Sigler, A., Goroshkov, A., Murphy, T. H. Hardware and methodology for targeting single brain arterioles for photothrombotic stroke on an upright microscope. J. Neurosci. Methods. 170, 35-44 (2008).
  11. Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. 1st, Academic Press. New York. (1997).
  12. Piao, M. S., Lee, J. K., Jang, J. W., Kim, S. H., Kim, H. S. A mouse model of photochemically induced spinal cord injury. J. Korean Neurosurg. Soc. 46, 479-483 (2009).
  13. Silva, V. M., Corson, N., Elder, A., Oberdorster, G. The rat ear vein model for investigating in vivo thrombogenicity of ultrafine particles (UFP). Toxicol. Sci. 85, 983-989 (2005).
  14. Watson, B. D., Prado, R., Dietrich, W. D., Ginsberg, M. D., Green, B. A. Photochemically induced spinal cord injury in the rat. Brain Res. 367, 296-300 (1986).
  15. Van Reempts, J., Van Deuren, B., Van de Ven, M., Cornelissen, F., Borgers, M. Flunarizine reduces cerebral infarct size after photochemically induced thrombosis in spontaneously hypertensive rats. Stroke. 18, 1113-1119 (1987).
  16. Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2, 396-409 (2005).
  17. Kleinschnitz, C., et al. Blocking of platelets or intrinsic coagulation pathway-driven thrombosis does not prevent cerebral infarctions induced by photothrombosis. Stroke. 39, 1262-1268 (2008).
  18. Porritt, M. J., et al. Photothrombosis-induced infarction of the mouse cerebral cortex is not affected by the Nrf2-activator sulforaphane. PLoS One. 7, e41090 (2012).
  19. Baskin, Y. K., Dietrich, W. D., Green, E. J. Two effective behavioral tasks for evaluating sensorimotor dysfunction following traumatic brain injury in mice. J. Neurosci Methods. 129, 87-93 (2003).
  20. Markgraf, C. G., et al. Comparative histopathologic consequences of photothrombotic occlusion of the distal middle cerebral artery in Sprague-Dawley and Wistar rats. Stroke. 24, 286-292 (1993).
  21. Wester, P., Watson, B. D., Prado, R., Dietrich, W. D. A photothrombotic 'ring' model of rat stroke-in-evolution displaying putative penumbral inversion. Stroke. 26, 444-450 (1995).
  22. Hu, X., Wester, P., Brannstrom, T., Watson, B. D., Gu, W. Progressive and reproducible focal cortical ischemia with or without late spontaneous reperfusion generated by a ring-shaped, laser-driven photothrombotic lesion in rats. Brain Res. Brain Res. Protoc. 7, 76-85 (2001).
  23. Maxwell, K. A., Dyck, R. H. Induction of reproducible focal ischemic lesions in neonatal mice by photothrombosis. Dev. Neurosci. 27, 121-126 (2005).
  24. Kuroiwa, T., et al. Development of a rat model of photothrombotic ischemia and infarction within the caudoputamen. Stroke. 40, 248-253 (2009).
איסכמיה Photothrombotic: דגם נגע פולשנית לשעתק פוטו קליפתיים לעכבר מחקרי שבץ
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Labat-gest, V., Tomasi, S. Photothrombotic Ischemia: A Minimally Invasive and Reproducible Photochemical Cortical Lesion Model for Mouse Stroke Studies. J. Vis. Exp. (76), e50370, doi:10.3791/50370 (2013).More

Labat-gest, V., Tomasi, S. Photothrombotic Ischemia: A Minimally Invasive and Reproducible Photochemical Cortical Lesion Model for Mouse Stroke Studies. J. Vis. Exp. (76), e50370, doi:10.3791/50370 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter