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Medicine

Photothrombotic Ischemia: माउस स्ट्रोक अध्ययन के लिए एक न्यूनतम इनवेसिव और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य रसायनिक cortical घाव मॉडल

doi: 10.3791/50370 Published: June 9, 2013

Summary

Photothrombosis अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीके में हित के क्षेत्रों में छोटी और अच्छी तरह से सीमांकित रोधगलन उत्प्रेरण के लिए एक त्वरित, न्यूनतम इनवेसिव तकनीक है. यह ट्रांसजेनिक चूहों में मस्तिष्क plasticity अंतर्निहित सेलुलर और आणविक प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है.

Abstract

photothrombotic स्ट्रोक मॉडल एक पहले इंजेक्शन प्रकाश के प्रति संवेदनशील डाई की तस्वीर के सक्रियण के माध्यम से एक दिया cortical क्षेत्र के भीतर एक इस्कीमिक नुकसान प्रेरित करना है. रोशनी के बाद, डाई सक्रिय और स्वेटर ऑक्सीजन पैदा करता है कि बाद में प्लेटलेट एकत्रीकरण और अंत में स्थानीय रक्त प्रवाह में रुकावट जो निर्धारित थ्रोम्बी गठन, साथ endothelial सेल झिल्ली का हर्जाना घटकों. शुरू में 1977 में Rosenblum और अल Sabban द्वारा प्रस्तावित यह दृष्टिकोण, बाद में चूहे के मस्तिष्क में 1985 में वाटसन से सुधार हुआ है और मौजूदा मॉडल के आधार स्थापित किया गया था. इसके अलावा, ट्रांसजेनिक माउस लाइनों की वृद्धि की उपलब्धता आगे photothrombosis मॉडल पर ब्याज बढ़ाने के लिए योगदान दिया. संक्षेप में, एक सहज डाई (गुलाब बंगाल) intraperitoneally के इंजेक्शन और रक्त प्रवाह में प्रवेश करती है. एक ठंड प्रकाश स्रोत से प्रकाशित करते हैं, डाई सक्रिय हो जाता है और स्थानीय, जिसके परिणामस्वरूप में प्लेटलेट सक्रियण और घनास्त्रता के साथ endothelial क्षति लातीरक्त के प्रवाह में रुकावट. प्रकाश स्रोत एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और गैर इनवेसिव रास्ते में ब्याज की किसी भी cortical क्षेत्र को निशाना बनाने की अनुमति देता है जो कपाल - उच्छेदन, की कोई आवश्यकता के साथ बरकरार खोपड़ी पर लागू किया जा सकता है. माउस तब sutured और जागृत करने के लिए अनुमति दी है. इस्कीमिक क्षति का मूल्यांकन जल्दी triphenyl-tetrazolium क्लोराइड या cresyl बैंगनी धुंधला द्वारा पूरा किया जा सकता है. इस तकनीक सटीक सेल लक्षण वर्णन या कार्यात्मक अध्ययन के लिए बेहद फायदेमंद है, जो छोटे आकार और अच्छी तरह से सीमांकित सीमाओं की रोधगलन पैदा करता है. इसके अलावा, यह ट्रांसजेनिक चूहों में मस्तिष्क plasticity अंतर्निहित सेलुलर और आणविक प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है.

Introduction

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21th सदी की शुरुआत में, इस्कीमिक स्ट्रोक दीर्घकालिक विकलांगता 1 और स्ट्रोक 2004 2 में लगभग 5,7 लाख लोगों की मृत्यु के लिए जिम्मेदार है, जिसमें मृत्यु दर दुनिया भर के दूसरे कारण के दूसरे कारण का प्रतिनिधित्व करने वाली एक घातक बीमारी है. में डाल रहे थे कि कई प्रयासों के बावजूद, स्ट्रोक के बाद कार्यात्मक वसूली में सुधार करने के लिए उपलब्ध नहीं प्रभावी उपचार अभी भी वहाँ है. वे इस्कीमिक क्षति के pathophysiology की मॉडलिंग के लिए अनुमति देते हैं और इन विवो में अलग न्यूरोप्रोटेक्टिव रणनीतियों की प्रभावकारिता का परीक्षण के रूप में स्ट्रोक के पशु मॉडल व्यापक रूप से स्ट्रोक अनुसंधान के क्षेत्र में उपयोग किया जाता है. इन मॉडलों के अधिकांश अन्य मॉडल आम तौर पर विशिष्ट क्षेत्रों, मोटर और somatosensory cortices में छोटे आकार के घावों का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है, जबकि मध्य मस्तिष्क धमनी के भीतर (अस्थायी या स्थायी रूप से) रक्त प्रवाह में दखल द्वारा व्यापक infarctions के लिए प्रेरित करना है. हालांकि, कई कारकों एसी उत्पन्न करने के लिए योगदान कर सकते हैंइस्तेमाल किया माउस तनाव सहित प्रयोगात्मक स्ट्रोक पढ़ाई में परिवर्तनशीलता के ertain डिग्री, सब से ऊपर की उम्र और लिंग के अध्ययन में शामिल जानवरों की और, तकनीक इस्कीमिक क्षति को उत्पन्न करने के लिए अपनाया. उत्तरार्द्ध बिंदु, सर्जरी की अवधि और invasiveness (यानी एक कपाल - उच्छेदन के लिए की जरूरत है) के रूप में भी मज़बूती से एक इस्कीमिक घाव उत्पन्न करने के लिए ऑपरेटर की आवश्यकता शल्य कौशल के संबंध के लिए महत्वपूर्ण निर्धारक हैं एक सफल और इन विवो स्ट्रोक अध्ययन में निष्पक्ष .

photothrombosis की अवधारणा शुरू में 1977 में 3 Rosenblum और अल Sabban द्वारा प्रस्तावित और वाटसन एट अल द्वारा चूहे के मस्तिष्क में अपने आवेदन से प्रसिद्ध हो गया 1985 4 में तकनीक काफी हद तक सुधार हुआ है और मौजूदा मॉडल 3 का आधार स्थापित किया गया था, जिसमें था. - 6. photothrombotic दृष्टिकोण पहले से रक्त प्रणाली, क में कर दिया एक प्रकाश के प्रति संवेदनशील डाई की तस्वीर के सक्रियण के माध्यम से एक cortical रोधगलन प्रेरित करना हैआईसीएच प्रकाश को उजागर क्षेत्रों में स्थानीय पोत घनास्त्रता में परिणाम है. घूम डाई एक ठंड प्रकाश स्रोत द्वारा उचित तरंगदैर्ध्य पर प्रबुद्ध है, यह बदले में उच्च प्रतिक्रियाशील स्वेटर ऑक्सीजन उत्पादों की एक बड़ी राशि उत्पन्न जो ऑक्सीजन के अणुओं को ऊर्जा रिलीज. ये ऑक्सीजन मध्यवर्ती, endothelial सेल झिल्ली peroxidation प्रेरित प्लेटलेट आसंजन और एकत्रीकरण के लिए अग्रणी है, और अंत में स्थानीय मस्तिष्क प्रवाह रुकावट 7 निर्धारित जो थ्रोम्बी के गठन के लिए.

Photothrombosis यह आम तौर पर मानव स्ट्रोक में होता है, लेकिन प्रकाश के संपर्क में क्षेत्रों में रक्त के प्रवाह के चुनिंदा रुकावट में परिणाम है जो अधिक सतही जहाजों, में घावों को प्रेरित करता है के रूप में केवल एक ही धमनी रोक देना या तोड़ नहीं है कि एक गैर विहित इस्कीमिक मॉडल है. इस कारण से, इस दृष्टिकोण cortical plasticity के सेलुलर और आणविक अध्ययन के लिए उपयुक्त हो सकता है. इस तकनीक का प्रमुख लाभ निष्पादन की अपनी सादगी में रहता है.हाथ धोने के लिए 2 मिनट, खोपड़ी दाढ़ी बनाने के लिए 1 मिनट, stereotaxic तंत्र पर जानवरों की जगह के लिए 3 से 5 मिनट इसके अलावा, photothrombosis आसानी से बीस मिनट की प्रतीक्षा (संज्ञाहरण के लिए 3 मिनट समेत पशु के अनुसार लगभग चालीस मिनट में किया जा सकता है एंटीसेप्टिक समाधान के साथ खोपड़ी, एक चीरा बनाने और खोपड़ी साफ, 2 से 4 मिनट ठंड प्रकाश फाइबर जगह करने के लिए, गुलाब बंगाल समाधान इंजेक्षन करने के लिए 1 मिनट, intraperitoneal प्रसार के लिए 5 मिनट प्रतीक्षा, रोशनी के लिए 15 मिनट, और 5 मिनट के लिए घाव को साफ और) पशु सीवन. इसके अलावा, कोई शल्य विशेषज्ञता घाव बरकरार खोपड़ी की साधारण रोशनी के माध्यम से प्रेरित किया है के रूप में इस तकनीक का प्रदर्शन करने की जरूरत है. शास्त्रीय धमनी रोड़ा के विपरीत, इस विधि विकिरणित क्षेत्र के भीतर pial और intraparenchymal microvessels के चुनिंदा occlusions निर्धारित करता है और कोई जमानत पोत लक्षित क्षेत्र में ऑक्सीजन की आपूर्ति के लिए छोड़ दिया जाता है, के रूप में घावों के बीच परिवर्तनशीलता कम कर देता है.

अपनी विशेष प्रकृति के बावजूदphotothrombotic क्षति शेयरों आवश्यक तंत्र मस्तिष्क स्ट्रोक में होने वाली. इसी प्रकार मानव स्ट्रोक में धमनी रोड़ा करने, प्लेटलेट एकत्रीकरण और थक्का बनने विकिरणित क्षेत्र 7 में रक्त के प्रवाह में रुकावट का निर्धारण. इसी तरह, इस मॉडल भी मध्य मस्तिष्क धमनी रोड़ा 8 में के रूप में आवश्यक भड़काऊ प्रतिक्रियाओं के शेयरों. हालांकि, क्योंकि अच्छी तरह से delimitated सीमाओं से, आंशिक रूप से संरक्षित चयापचय के एक क्षेत्र से मेल खाती है खंडच्छायायुक्त क्षेत्र, एक photothrombotic घाव के बाद बहुत कम या inexistent है. यह स्पष्ट सीमा इस्कीमिक या बरकरार cortical क्षेत्र के भीतर सेलुलर प्रतिक्रियाओं के अध्ययन की सुविधा कर सकते हैं. Photothrombosis माउस मॉडल ट्रांसजेनिक जानवरों की एक किस्म में स्ट्रोक के अध्ययन के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है. दरअसल शास्त्रीय मॉडल माउस तनाव पूर्वाग्रह 9 पैदा कर सकता है कि एक उच्च मृत्यु दर अनुपात की सूचना C57BL 6 / में सभी उपभेदों और लंबी अवधि के अध्ययन के लिए फिट नहीं कर सकते.

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Protocol

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1. पूर्व सर्जरी

  1. एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में गुलाब बंगाल वजन और 15 मिलीग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता तक पहुँचने तक बाँझ खारा समाधान में भंग. एक 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से बाँझ फ़िल्टर और दो महीने के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में स्टोर.
  2. Autoclaving की सभी शल्य चिकित्सा उपकरणों जीवाणुरहित. शल्य चिकित्सा के क्षेत्र सर्जरी शुरू करने से पहले कम से कम एक घंटे साफ किया जाना चाहिए.
  3. इंजेक्शन जा गुलाब बंगाल की खुराक को समायोजित करने के लिए माउस शरीर के वजन रिकार्ड. हम वर्तमान प्रोटोकॉल में 12 सप्ताह पुरानी महिला CD1 चूहों में 10 μl / छ पशु वजन इंजेक्शन. गुलाब बंगाल की राशि वांछित cortical घाव आकार आसानी से विभिन्न dosages (आमतौर पर 2 μl / ग्राम, 5 μl / ग्राम या 10 ग्राम / μl शरीर के वजन) के परीक्षण से प्रारंभिक प्रयोगों का एक अलग सेट में निर्धारित किया जा सकता है उत्पादन के लिए आवश्यक. इंजेक्शन जा गुलाब बंगाल की राशि, प्रकाश स्रोत का विशेष प्रकार के प्रयोग की स्थिति पर निर्भर है कि नोटइस्तेमाल किया और प्रकाश जोखिम की अवधि. वर्तमान अध्ययन में, 10 ग्राम / μl (150 माइक्रोग्राम / छ) खुराक दूसरों समूहों की सूचना दी है, जबकि 15 मिनट के लिए प्रकाश के संपर्क पर photothrombosis प्रेरित करने के लिए आवश्यक हो पाया था कि 50 माइक्रोग्राम / छ 6,8 और 100 माइक्रोग्राम / छ या तो 10 intraperitoneal इंजेक्शन एक photothrombotic घाव उत्प्रेरण के लिए पर्याप्त था.

2. संज्ञाहरण प्रक्रिया

  1. 50% में एक पारदर्शी प्रेरण कक्ष (प्रेरण के लिए 3.5-4%, को बनाए रखने के लिए 1.5-2%) (v / v) oxygen/50% (v / v) dinitrogen मोनोऑक्साइड गैस के मिश्रण में isoflurane के साथ चूहों anesthetize. गैसीय संज्ञाहरण जानवरों की एक त्वरित जगा देता है और संवेदनाहारी गैस का स्तर आसानी से समायोजित किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, चूहे भी एक ketamine-xylazine मिश्रण द्वारा anesthetized किया जा सकता है.
  2. गहरी संज्ञाहरण तक पहुँच जाता है, एक चेहरा मुखौटा का उपयोग संज्ञाहरण, प्रेरण कक्ष से संवेदनाहृत पशु हटाने stereotaxic फ्रेम में डाल दिया है और बनाए रखने के लिए. Isoflura समायोजित करेंपूर्वोत्तर खुराक एक पर्याप्त संज्ञाहरण स्तर को प्राप्त करने के लिए. प्रक्रिया के दौरान सांस की दर पर नजर रखने और इसे (40 - प्रति मिनट 60 साँस) स्थिर है सुनिश्चित करें.
  3. पशु गहरा anaesthetized है यह सुनिश्चित करने के क्रम में पैर के अंगूठे चुटकी का प्रयोग करें.
  4. बाहर सुखाने से आंखों को रोकने के क्रम में, नेत्र मरहम लागू करें.
  5. धीरे सर्जिकल प्रक्रियाओं के दौरान तापमान पर नजर रखने के लिए गुदा जांच सम्मिलित करें. ± 0.5 डिग्री सेल्सियस 37 पर माउस शरीर का तापमान बनाए रखने के लिए संबद्ध प्रतिक्रिया नियंत्रित हीटिंग पैड सेट

3. टारगेट एरिया की रोशनी के लिए सर्जरी

  1. एक बिजली के रेजर के साथ माउस खोपड़ी दाढ़ी.
  2. मजबूती से सिर को सुरक्षित और बाहरी कुहर में कान सलाखों डालें. क्षति eardrums के लिए सावधान नहीं रहो.
  3. कपास swabs का उपयोग कर 70% इथेनॉल और betadine की swipes के साथ बारी सतह पर त्वचा कीटाणुरहित.
  4. आंख ले से midline के साथ एक चीरा बनाने के लिए एक छुरी का प्रयोग करेंगर्दन को नीचे वेल. खोपड़ी संपर्क में रखने के लिए त्वचा रिट्रैक्टर लागू करें.
  5. धीरे एक स्केलपेल के साथ खोपड़ी के किनारों को periostium वापस लेना और खोपड़ी की सतह बाँझ कपास swabs का उपयोग कर सूखा. शीर्षस्थान और लैम्ब्डा पहचानें. संदर्भ बिंदु के रूप में पर्वबिन्दु पर एक गिलास micropipette प्लेस, तो ब्याज की अपने क्षेत्र का समन्वय करने के लिए यह कदम. इस लेख के लिए चुना ब्याज के क्षेत्र, मोटे तौर पर जी भरकर आकार का है शीर्षस्थान के लिए पार्श्व लगभग 2 मिमी केंद्रित है, और फ्रेंकलिन द्वारा माउस मस्तिष्क एटलस के अनुसार ज्ञानेन्द्रिय प्रांतस्था का एक बड़ा हिस्सा शामिल है और जो के बारे में 30 मिमी 2, के एक क्षेत्र को कवर Paxinos 11.
  6. संदर्भ अंक के साथ ब्याज की स्थिति चिह्न और प्रकाश बिखरने से बचने लेकिन उस पर दबाव लागू करने के लिए नहीं ध्यान देने की खोपड़ी की सतह के साथ निकट संपर्क में एक ऑप्टिक फाइबर डाल दिया. प्रबुद्ध क्षेत्र ऑप्टिक फाइबर जीयूआई की नोक पर छोटे छेद या एक टोपी के साथ खोपड़ी पर एक मुखौटा लागू करने से प्रतिबंधित किया जा सकता हैडे.

4. गुलाब बंगाल इंजेक्शन और एक्टिवेशन

  1. एक 1 मिलीलीटर सिरिंज में गुलाब बंगाल समाधान लोड और शरीर के वजन के 10 μl / जी की एक खुराक के हिसाब से इंजेक्शन की मात्रा की गणना.
  2. एक धीमी intraperitoneal इंजेक्शन के लिए आगे बढ़ें.
  3. डाई फैलाना चलो और रक्त प्रवाह में प्रवेश. 5 मिनट के बाद, ठंड प्रकाश प्रकाशक पर स्विच. प्रकाश के किसी अन्य स्रोत से पशु की रोशनी से बचें. हम 150 डब्ल्यू तीव्रता के फाइबर ऑप्टिक प्रकाशक का इस्तेमाल किया.
  4. रोशनी के 15 मिनट के बाद, प्रकाश जोखिम को रोकने और घाव सीवन. रोशनी से पांच मिनट पहले ही रोधगलन उत्पादन और 10 मिनट के एक अधिक से अधिक प्रभाव 12 प्राप्त करने की संभावना के लिए पर्याप्त है. परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए, हम 15 मिनट के लिए रोशन करने के लिए चुनते हैं.

5. सिवनी

  1. त्वचा रिट्रैक्टर निकालें और निर्जलीकरण से बचने के लिए बाँझ खारा समाधान लागू होते हैं.
  2. रिवर्स काटने needl उपयोग कर घाव ऊपर बंदई और रेशम या नायलॉन सीवन धागे.
  3. यह पूरी तरह से जाग है जब तक संज्ञाहरण वितरण में बाधा डालना, ध्यान stereotaxic तंत्र से माउस को हटाने और एक पूर्व गर्म हीटिंग पैड पर रखा, तो अपने पिंजरे से वापसी. शरीर का तापमान रोधगलितांश विस्तार में परिवर्तनशीलता को सीमित करने के लिए प्रक्रियाओं के दौरान सावधानी से निगरानी की जानी चाहिए. एकाग्रता और प्रशासन के मार्ग के अनुसार, बंगाल अभी भी इंजेक्शन 13 के बाद कई घंटे के लिए रक्त प्रवाह में पता लगाया जा सकता है गुलाब. संभावित माध्यमिक हर्जाना (गुलाब बंगाल अवशोषण तरंग दैर्ध्य हरी स्पेक्ट्रम में है) से बचने के लिए वार्मिंग दीपक को हीटिंग कंबल पसंद करते हैं.

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Representative Results

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इस प्रोटोकॉल पहले से ही बेबस नजर (आंकड़े 1 ए 1 सी) के लिए प्रांतस्था के विच्छेदन पर दिख रहा है कि एक cortical घाव का उत्पादन होगा. photothrombotic घाव ऊतक गुलाब बंगाल की तस्वीर सक्रियण अनुमति देने के लिए पर्याप्त रूप से पारदर्शी है जिसमें सतही और गहरी cortical परतों में विकसित करता है. मस्तिष्क रोधगलन की हद तक का मापन 4% paraformaldehyde (पीएफए) के निर्धारण के बाद ताजा ऊतक पर या cresyl बैंगनी द्वारा triphenyl-tetrazolium क्लोराइड (टीटीसी) के साथ ऊतकीय धुंधला द्वारा जल्दी से किया जा सकता है. टीटीसी ऊष्मायन से पहले, हौसले से विच्छेदित मस्तिष्क एक मस्तिष्क स्लाइसर में तैनात है और 1 मिमी मोटी स्लाइस (चित्रा 1C) में sectioned. Infarcted क्षेत्र रोधगलितांश क्षेत्र (आंकड़े 1D-1E) के एक सटीक माप की अनुमति देता है, पीला दिखाई देता है जबकि टीटीसी लाल में बरकरार ऊतक लेबल. penumbra के रूप में परिभाषित अधूरा ischemia के क्षेत्र घाव के आकार के हिसाब से बहुत कम या inexistent है.

इसी तरह, cresyl बैंगनी धुंधला बैंगनी दाग ​​आसपास के ऊतकों की तुलना में बेदाग infarcted क्षेत्रों की पहचान की अनुमति देता है. प्रतिक्रियाशील प्रसार और सेल घुसपैठ (घाव के बाद पहले सप्ताह के दौरान होता है) के रूप में भी अच्छी तरह से एक glial निशान (आंकड़े 2B1-2B2) की उपस्थिति के रूप में, (आंकड़े 2A1-2A2) का आकलन किया जा सकता है. नकारात्मक नियंत्रण एक ही सर्जरी और डाई इंजेक्शन प्रदर्शन के द्वारा किया जाता है, लेकिन ठंड प्रकाश स्रोत के लिए जोखिम के बिना है. घाव घाव (आंकड़े 3 ए -3 बी) के बाद अलग अलग समय बिंदुओं पर आकार और स्थान में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है. रोधगलितांश क्षेत्र आम तौर पर गुलाब बंगाल इंजेक्शन 14 के बाद 4 से 6 घंटे से इसकी अधिकतम आकार तक पहुँच जाता है और बाद में 2 दिन से 4 दिनों के बाद photothrombosis को जल्दी से कम कर देता है. विकिरण अधिक सतही परतों में होता है, लेकिन गहरी cortical परतों में बड़े जहाजों इसलिए भी occluded किया जा सकता हैसंपीड़न घाव 7 द्वारा उकसाया. मस्तिष्क pial microvasculature का वितरण विभिन्न आयु या तनाव के जानवरों के बीच भिन्न हो सकते हैं क्योंकि यह इलाज से पहले घाव के reproducibility की जांच के लिए महत्वपूर्ण है.

चित्रा 1
चित्रा 1. 4 दिन photothrombosis. एबी. पार्श्व और ललाट देखने के बाद CD1 माउस मस्तिष्क में photothrombotical घाव के Macroscopical उपस्थिति. सतही रोधगलन (तीर) बेबस आंखों को दिखाई एक सफेद क्षेत्र के रूप में प्रकट होता है. सी. मस्तिष्क 1 मिमी मोटी वर्गों में जल्दी sectioned मस्तिष्क स्लाइसर में तैनात है. लोमो. मस्तिष्क रोधगलन की हद तक का मापन टीटीसी धुंधला द्वारा पूरा किया जा सकता है . थ्रोम्बोटिक घाव के भीतर परिगलित ऊतक चरित्र हैधुंधला की अनुपस्थिति द्वारा ized. एसी में सचित्र मस्तिष्क का राज्याभिषेक स्लाइस से डी एफ के लिए दुम का विस्तार करने के लिए विजय - स्तम्भ में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं.

चित्रा 2
चित्रा 2. Photothrombotic क्षति के प्रतिनिधि अस्थायी विकास. वयस्क C57BL 6 / माउस मस्तिष्क के कोरोनल वर्गों cresyl बैंगनी से दाग रहे थे. ए 1, ए 2. 7 दिनों की चोट के बाद कोशिकाओं के एक उच्च संख्या रोधगलितांश सीमा पर इकट्ठा. बी 1, बी 2. 30 से कम, घाव मात्रा बेहद कम है और glial निशान बनाने से है. A2 और बी 2 क्रमशः A1 और बी 1 की उच्च वृद्धि कर रहे हैं. स्केल सलाखों: ए 1, बी 1: 1 मिमी, ए 2 बी 2: 0.5 मिमी.

चित्रा 3
चित्रा 3. 2 में मस्तिष्क के macroscopic उपस्थिति, photothrombosis के बाद 4 और 16 दिनों के लिए. पीएफए ​​perfused दिमाग की Microphotographs, आगे immunohistological विश्लेषण के लिए तैयार है. infarcted क्षेत्र (धराशायी लाइन) पर प्रकाश डाला है. बी घाव के बाद 2, 4 और 16 दिनों में क्षेत्र की सतह की तुलना करें. एन प्रत्येक समूह में = 4. * <0.05 पी (छात्र टी परीक्षण).

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Discussion

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संशोधन और प्रतिस्थापन

क्योंकि 562 एनएम पर उसके अवशोषण शिखर की, एक फ़िल्टर क्सीनन चाप दीपक से एक हरे प्रकाश लेजर मूल रूप से सहज गुलाब बंगाल प्रकाशित करने के लिए चुना गया था. लेजर की मध्यस्थता उत्तेजना अभी recently5 इस्तेमाल किया गया था, यह भी डाई उत्तेजना 10,15 सुनिश्चित है कि ठंड प्रकाश दीपक द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है. शीत प्रकाश ऑप्टिक फाइबर लेजर स्रोतों की तुलना में हेरफेर करने के लिए आसान और कम खर्चीला है. हालांकि, यह लेज़रों आमतौर पोत विशेष के थक्के 10 vivo में एक के लिए कपाल - उच्छेदन के बाद व्यक्तिगत सतह धमनियों को लक्षित करने के लिए उपयोग किया जाता है कि देखा जाना चाहिए.

संवेदनशील डाई का वितरण आम तौर पर समरूप और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए कुछ प्रशिक्षण की आवश्यकता है जो पूंछ नस इंजेक्शन, द्वारा पूरा किया है. इसके विपरीत, intraperitoneal इंजेक्शन प्रदर्शन करने के लिए आसान है और गुलाब बंगाल के कुछ ही मिनट बाद 13 रक्त प्रवाह में detectable है. प्रभावी photothrombosis डाई की कि प्लाज्मा एकाग्रता प्रशासन 13 के बाद भी 60 मिनट में वृद्धि जारी पता चला intraperitoneal इंजेक्शन 8, चूहे में गुलाब बंगाल की लेकिन उच्च intraperitoneal खुराक के बाद रोमांचक डाई 5 मिनट के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. गुलाब बंगाल के संचार नसों में इंजेक्शन लेकिन प्रशासन का इस तरह से निषेचन भी तेजी (<1.5 मिनट) या उच्च डाई एकाग्रता 5 में प्रदर्शन के मामले में हाइपोटेंशन को संबद्ध किया जा सकता है, घाव 13 के reproducibility बढ़ा सकते हैं. रक्तचाप में उतार चढ़ाव से बचने के लिए, ऐसे Erythrosin बी के रूप में अन्य सहज पदार्थों वाहिकाओं occlusions का उत्पादन किया जा सकता है, लेकिन इस अणु एकाग्रता 5 की इसी श्रृंखला के लिए गुलाब बंगाल की तुलना में कम कुशल माना जाता है.

महत्वपूर्ण कदम

विभिन्न कारकों जैसे संवेदनशील डाई की एकाग्रता के रूप में घाव आकार और गहराई, डाई injecti के बीच विलंबता को प्रभावितपर और रोशनी, प्रकाश स्रोत की तीव्रता, सर्जरी के दौरान और बाद में प्रबुद्ध सतह, जोखिम अवधि और शरीर के तापमान के व्यास. खोपड़ी पर प्रकाश स्रोत के कोण भी रोधगलितांश के आकार को प्रभावित कर सकते हैं. प्रारंभिक प्रयोगों की एक श्रृंखला reproducibility के परीक्षण करने के लिए और चुनिंदा लक्ष्य क्षेत्र और / या प्राप्त अभिप्रायपूण व्यवहार घाटे को प्रभावित करने वाले एक घाव जो उत्पादन डाई और विकिरण समय की न्यूनतम राशि निर्धारित करने के लिए किया जाना चाहिए.

तकनीक की सीमाएं

इस तकनीक मस्तिष्क ischemia 4 के दौरान मनाया के रूप में प्लेटलेट एकत्रीकरण उत्प्रेरण द्वारा मानव स्ट्रोक की नकल करने के क्रम में विकसित किया गया था. हालांकि photothrombotic क्षति थोड़ा मानव स्ट्रोक से अलग है. स्ट्रोक आम तौर पर एक टर्मिनल धमनी में रक्त के प्रवाह में रुकावट के कारण होता है जबकि सबसे पहले, घनास्त्रता, प्रबुद्ध क्षेत्र में जहाजों की बड़ी संख्या में शुरू हो रहा है. जैसावे जमानत धमनियों से रक्त की आपूर्ति प्राप्त हो सकता है और परिगलित कोशिका मृत्यु से गुजरना नहीं है के रूप में एक परिणाम है, जिसका चयापचय केवल आंशिक रूप से रक्त के प्रवाह में रुकावट के दौर से गुजर धमनी द्वारा समर्थित है मस्तिष्क के कुछ क्षेत्रों के शुरू में कम प्रभावित हैं. इसके विपरीत पर एक बहुत सीमित penumbra में photothrombosis परिणाम द्वारा उत्पादित अच्छी तरह से परिभाषित सीमा, उस के बाद ischemia के न्यूरोप्रोटेक्टिव एजेंटों का मुख्य लक्ष्य है. इसके अलावा, स्ट्रोक रोगियों के एक सबसेट में, reperfusion की सहज होता है और माध्यमिक हर्जाना (reperfusion चोट सहित) बटोर सकता है. Ischemia के इस विशेष पहलू का अध्ययन करने के लिए, क्षणिक रोड़ा मॉडल अधिक उपयुक्त हैं.

रोधगलन खुद के पैटर्न मानव स्ट्रोक से अलग है कि कुछ विशेषताओं को प्रदर्शित करता है. एमआरआई इस्कीमिक infarction के विकास जबकि बड़े photothrombotic घाव में इस्कीमिक infarction और vasogenic शोफ का एक साथ विकास हुमा में vasogenic शोफ से अधिक की तस दिखाता हैएन स्ट्रोक 16. इसके विपरीत, photothrombosis photothrombotic रोधगलन प्लेटलेट्स या आंतरिक जमावट मार्ग 17 के निषेध के अवरुद्ध होने के बाद भी होता है कि इस तथ्य के कारण विरोधी thrombotic एजेंट के अध्ययन के अध्ययन के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता. वास्तव में यह अजीब स्थिति में प्लेटलेट जमावट endothelial अखंडता के विघटन शोफ और आसपास के जहाजों के जुड़े संपीड़न उत्पन्न करेगा जिसमें photothrombotic रोड़ा करने के लिए आवश्यक नहीं था कि सुझाव दिया गया है. इसके अलावा इसी अध्ययन एमआरआई विश्लेषण में प्लेटलेट्स 17 से प्लेटलेट समारोह या कमी की नाकाबंदी के बाद रोधगलितांश आकार का संशोधन नहीं दिखा था.

मौजूदा तरीकों के संबंध में महत्व

, स्थायी क्षणिक, फोकल और वैश्विक ischemia के कई अच्छी तरह से मानकीकृत मॉडल, यंत्रवत् या रासायनिक प्रेरित, निकट मानव स्ट्रोक pathophysiology को नकल और विकास करने के क्रम में कृन्तकों में विकसित किए गएपी नई न्यूरोप्रोटेक्टिव रणनीतियों. यहाँ प्रस्तुत रूप photothrombosis लगातार एक बहुत प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और कम आक्रामक तरीके से किसी भी कॉर्टिकल या subcortical साइट में वांछित आकार की एक स्ट्रोक की चोट लाती है कि स्थायी फोकल ischemia के एक मॉडल है. इस मॉडल को और अधिक व्यापक अध्ययन 98.4% 18 प्राप्त किया, जबकि उस (25 जानवरों) हमारे प्रयोगों में 100% तक पहुँच गया है कि एक उच्च जीवित रहने की दर से पता चलता है. photothrombotic घाव कई परीक्षण 6,19 द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता लक्षित क्षेत्र और व्यवहार अच्छा हो जाना के अनुसार एक सटीक समारोह को प्रभावित करने के क्रम में अनुकूलित किया जा सकता. इसके अलावा इस दृष्टिकोण समय लेने वाली है, कुछ विचार नहीं है और यह तकनीकी रूप रेशा मॉडल सहित अन्य मॉडलों का विरोध करने की मांग नहीं कर रहा है के रूप में जल्दी से सीखा जा सकता है. इसके अतिरिक्त पोत रोड़ा मानव स्ट्रोक में मनाया उन लोगों के लिए संरचनात्मक रूप से समान हैं कि थ्रोम्बी के स्थानीय गठन उत्प्रेरण द्वारा हासिल की है. हालांकि, photothrombotic दृष्टिकोण भी जनसंपर्क के लिए अनुकूलित किया गया थामध्य मस्तिष्क धमनी 20 की oducing occlusions. रिंग घाव मॉडल बाद में एक बड़ा penumbra प्राप्त करने के लिए विकसित किया गया था. यह व्यवहार्य ऊतक के cortical क्षेत्र एक परिपत्र क्षतिग्रस्त ऊतकों से घिरा हुआ है और इस्कीमिक penumbra 21,22 के जैव रासायनिक और आणविक विशेषताओं का हिस्सा है जिसमें से केन्द्र में, एक चक्र के आकार के तहत एक रोशनी के होते हैं. तकनीक के वेरिएंट भी विकासशील मस्तिष्क 23 में या subcortical ऊतक 24 में स्ट्रोक का प्रदर्शन करने के लिए उपलब्ध हैं.

अंत में, photothrombosis उच्च reproducibility के साथ इस्कीमिक मॉडल प्रदर्शन करने के लिए आसान है. इसके अलावा, यह सेलुलर और आणविक दोनों स्तर पर, विशेष रूप से मस्तिष्क की चोट के जवाब में cortical plasticity के मूल्यांकन के लिए, प्रयोगात्मक स्ट्रोक अध्ययन का एक नंबर के लिए उपयुक्त है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

हम व्यावहारिक सुझावों और टिप्पणियों, और Maurizio Grassano, मरीना Boido और शूटिंग के लिए Ermira Pajaj लिए Annalisa भैंस का धन्यवाद. इस काम के FP7-एम सी 214003-2 (मैरी क्यूरी प्रारंभिक प्रशिक्षण नेटवर्क AXREGEN) और Compagnia डि सैन पाओलो, gliarep परियोजना द्वारा वित्त पोषित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Solutions and chemicals
Rose Bengal Sigma, Italy 330000
Isoflurane Vet Merial 103120022
Betadine Asta Medica
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
Surgical material and equipment
Fluosorber Filter Havard apparatus 340415
150W fiber optic illuminator Photonic PL3000
Temperature Controller for Plate TCAT-2DF Havard apparatus 727561
Stereotaxic Instrument Stoelting 51950
Operating microscope Takagi OM8
Heating pad
Oxygen and nitrogen gas
Surgery Tools World precision instrument Optic fiber taps and mask are custom-made

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References

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Photothrombotic Ischemia: माउस स्ट्रोक अध्ययन के लिए एक न्यूनतम इनवेसिव और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य रसायनिक cortical घाव मॉडल
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Labat-gest, V., Tomasi, S. Photothrombotic Ischemia: A Minimally Invasive and Reproducible Photochemical Cortical Lesion Model for Mouse Stroke Studies. J. Vis. Exp. (76), e50370, doi:10.3791/50370 (2013).More

Labat-gest, V., Tomasi, S. Photothrombotic Ischemia: A Minimally Invasive and Reproducible Photochemical Cortical Lesion Model for Mouse Stroke Studies. J. Vis. Exp. (76), e50370, doi:10.3791/50370 (2013).

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