Effektiv og Rapid Isolering av tidlig stadium embryo fra<em> Arabidopsis thaliana</em> Frø
Summary
Vi rapporterer om en effektiv og enkel metode for å isolere embryoer på tidlige stadier av utviklingen fra<em> Arabidopsis thaliana</em> Frø. Opp til 40 embryoene kan bli isolert i 1 time til 4 timer, avhengig av den anvendelse nedstrøms. Fremgangsmåten er egnet for transcriptome, DNA metylering, reporter genekspresjon, farging og fluorescens<em> In situ</em> Hybridiserings-analyser.
Abstract
I blomsterplanter, utvikler embryo innenfor en nærende vev – den endosperm – omgitt av mors frø integuments (eller frø pels). Som en konsekvens, er isolering av anlegget embryoer på tidlige stadier (en celle til globulær stadium) teknisk utfordrende på grunn av deres relative utilgjengelighet. Effektiv manuell disseksjon på tidlige stadier er sterkt svekket av den lille størrelsen av unge Arabidopsis frø og klebrighet embryoet til omkringliggende vev. Her beskriver vi en fremgangsmåte som tillater effektiv isolering av små Arabidopsis embryo, noe som gir opp til 40 embryoer i 1 time til 4 timer, avhengig av den anvendelse nedstrøms. Embryoet blir sluppet ut i isolasjon buffer med litt knusing 250-750 frø med en plast stampe i en Eppendorf tube. Et glass microcapillary festet til enten en standard laboratorium pipette (via en gummislange), eller hydraulisk microinjector brukes til å samle embryoer fra dråpene plassd på en multi-brønn glir på en invertert lysmikroskop. De tekniske ferdigheter som kreves er enkle og lett omsettelige, og grunnleggende oppsett krever ikke kostbart utstyr. Innsamlede embryoer er egnet for en rekke nedstrøms applikasjoner som RT-PCR, RNA sekvensering, DNA-metylering analyser, fluorescens in situ hybridisering (FISH), farging og reporter gen analyser.
Introduction
Embryo av blomstrende planter er omgitt av stivelse, en næringsverdi vev avledet fra en annen befruktning hendelsen. Både embryo og endosperm er omgitt av flere cellelag av frøhylsteret. Kollektivt disse vev danne et frø, som utvikler seg inni frukten. Dermed er vev-og celle-spesifikke analyser av Arabidopsis embryoer sterkt svekket på grunn av sin utilgjengelighet. Likevel, embryo på de sene globular eller senere stadiene er relativt godt mottagelig for manuell disseksjon ved å bruke fine Tungsten nåler under stereomikroskop, eller ved å trykke lett på frøet med tang for å pakke dem ut. Slike teknikker ble brukt med hell for transcriptome eller epigenome profilering analyser som microarray hybridisering, bisulfite sekvensering, eller RNA-sekvensering (f.eks 1-3). I kontrast, studier av embryo ved zygote til tidlig globular stadium forbli teknisk utfordrende. Til dags dato, bare noen få studier har reported transkriptom analyser på unge embryo ved hjelp av enten laser-fangst mikrodisseksjon (LCM) av embryonale vev fra faste frø § § 4 eller manuell ekstraksjon av individuelle embryoer fra innen frø med gode verktøy fem. Imidlertid er LCM utstyr ikke allment tilgjengelig og manuell embryo utvinning på tidlige stadier er tidkrevende og krever gode disseksjon ferdigheter som ikke er lett omsettelige. I tillegg til genome-wide analyser, in situ genuttrykk analyser er også vanskelig å utføre på unge, hel-mount embryoer fra Arabidopsis. Til en viss grad, kan unge embryo bli utgitt på objektglass ved forsiktig press på frøene og brukes til reporter gen analyser eller protein deteksjon ved farging (se for eksempel 6,7). Denne teknikken er imidlertid ikke tillater høy gjennomstrømming embryo isolasjon, og dermed hindrer kvantitative analyser.
Derfor har vi utviklet en effektiv og rask protokollfor tidlig embryo isolasjon fra Arabidopsis frø som er enkel å sette opp, lett omsettelige, og egnet for en rekke nedstrøms applikasjoner. Det grunnleggende prinsippet er å forsiktig knuse frøene – dissekert fra unge siliques i en Eppendorf rør ved hjelp av en plast stampe i en passende isolasjon buffer. Frøet pakke er plassert i dråper på en multi-brønn lysbilde og er skjermet for tilstedeværelse av frigjorte embryoer på ønsket tidspunkt ved hjelp av et invertert mikroskop. Embryoene er samlet ved hjelp av et glass microcapillary festet til en microinjector eller en standard laboratorium pipette. For molekylære programmer, er embryoer vasket to ganger etter gjentatte utslipp til dråper ny isolasjon buffer før du overfører dem til bestemmelsesstedet buffer i et minimalt volum. For cytologiske applikasjoner (reporter analyser, farging, fisk), kan vasketrinnene utelates.
Metoden gir flere fordeler: (i) det gir 25-40 embryoer i ~ 45 min for cytologisk applications eller i 3-4 timer for molekylær applikasjoner (inkludert vaske trinn), (ii) det tillater isolering av spesifikke embryonale stadier, (iii) det er lett overførbar til andre personer og laboratorier på grunn av sin enkle oppsett, (iv) det krever rimelig utstyr for den grunnleggende konfigurasjon som er mottagelig for oppgradering, og (v) det ble med hell brukt for ulike nedstrøms applikasjoner som RNA 8 sekvensering, gen-spesifikke DNA-metylering analyse 9, reporter assays (10 og Raissig et al. in prep.) og FISH (J. Jaenisch, U. Grossniklaus, C. Baroux upublisert, se figur 5).
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi utviklet et embryo isolasjon protokoll som er rask, effektiv, og kan enkelt overføres til andre laboratorier.
Utstyret som beskrives her, består av et invertert mikroskop, en mikromanipulator, glass microcapillaries, en vertikal filament avtrekker og en microinjector (figur 3A). Oppsettet er lik den som er beskrevet for enkelt dyr celleisolasjon for transcriptomics analyser 17. Vi har også lykkes i arbeidet med en mer grunnleggende oppsett der glass microcap…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gjerne takke Tal Nawy og Martin Bayer for sine råd om embryo isolasjon. MTR, VG, UG og CB utviklet embryo isolert utstyr. MTR, VG og CB utviklet embryo isolasjon protokollen. MTR, VG og CB etablert protokollen, isolert embryoene, og genererte embryo cDNA, VG utførte PCR, MTR den GUS flekker, JJ fisken eksperimenter. MTR, VG, CG og UG skrev manuskriptet. Dette arbeidet ble finansiert av Universitetet i Zürich, en Brorskap Roche Research Foundation (til MTR), og tilskudd fra den sveitsiske National Foundation (til UG og CB).
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| REAGENTS | |||
| Sigmacote | SIGMA | SL2-100 ml | |
| RNAse OUT | Invitrogen (life technologies) | 10777-019 | |
| First- strand buffer | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | contained in Superscript II package |
| DTT | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | contained in Superscript II package |
| Bovine serum albumin (BSA) 100x =10 mg/ml | New England Biolabs Inc. | Different suppliers will also work | |
| Thin wall Capillaries 1.0 mm | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| DNA LoBind tube 0.5 ml | Vaudaux-Eppendorf | 0030108.035 | |
| CellTricsΔ 30 μm | PARTEC | 04-0042-2316 | |
| 5wells 10 mm diameter slides | Electron Microscopy Sciences | 63421-10 | |
| Formaldehyde Solution | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| Superfrost Plus slide | Thermo Fisher | J1800AMNZ | Menzel-Gläser |
| Tris | Amaresco | 0497 | |
| EDTA | Applichem | A2937 | |
| Glycin | Fluka | 50050 | |
| SDS pellets | Roth | CN30.3 | |
| Micro Pestle | VWR | 431-0094 | |
| Microfine insulin syringes | BD | U-100 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| Ethanol | Schaurlau | ET00102500 | |
| Forceps N5 | Dumont | 0108-5 | |
| Bioanalyzer Pico Chip | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| EQUIPMENT | |||
| Inverted microscope | Nikon TMS (Japan), | ||
| Micromanipulator | Leitz | Leica | |
| Micomanipulator Post mount LH1 probe | Leica microsystems | 39430101 | Different brand will also do the work |
| Vertical filament puller | Sutter instrument | P-20 model | Other model are also suitable |
| Cell Tram vario | Vaudaux-Eppendorf | 5176.000.033 | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | 2100 | |
| Qubit Fluorometer | Invitrogen (life technologies |
References
- Gehring, M., Bubb, K. L., Henikoff, S. Extensive demethylation of repetitive elements during seed development underlies gene imprinting. Science. 324, 1447-1451 (2009).
- Muller, B., Sheen, J. Cytokinin and auxin interaction in root stem-cell specification during early embryogenesis. Nature. 453, 1094-1097 (2008).
- Gehring, M., Missirian, V., Henikoff, S. Genomic analysis of parent-of-origin allelic expression in Arabidopsis thaliana seeds. PLoS One. 6, 23687-23 (2011).
- Xiang, D., et al. Genome-wide analysis reveals gene expression and metabolic network dynamics during embryo development in Arabidopsis. Plant Physiol. 156, 346-356 (2011).
- Nawy, T., et al. The GATA factor HANABA TARANU is required to position the proembryo boundary in the early Arabidopsis embryo. Dev Cell. 19, 103-113 (2010).
- Baroux, C., Pecinka, A., Fuchs, J., Schubert, I., Grossniklaus, U. The triploid endosperm genome of Arabidopsis adopts a peculiar, parental-dosage-dependent chromatin organization. Plant Cell. 19, 1782-1794 (2007).
- Autran, D., et al. Maternal epigenetic pathways control parental contributions to Arabidopsis early embryogenesis. Cell. 145, 707-719 (2011).
- Wohrmann, H. J., et al. Identification of a DNA methylation-independent imprinting control region at the Arabidopsis MEDEA locus. Genes Dev. 26, 1837-1850 (2012).
- Raissig, M. T., Baroux, C., Grossniklaus, U. Regulation and Flexibility of Genomic Imprinting during Seed Development. Plant Cell. 23, 16-26 (2011).
- Rea, M., et al. Determination of DNA methylation of imprinted genes in Arabidopsis endosperm. J. Vis Exp. 47 (47), e2327 (2011).
- Breuninger, H., Rikirsch, E., Hermann, M., Ueda, M., Laux, T. Differential expression of WOX genes mediates apical-basal axis formation in the Arabidopsis embryo. Dev Cell. 14, 867-876 (2008).
- Kohler, C., Page, D. R., Gagliardini, V., Grossniklaus, U. The Arabidopsis thaliana MEDEA Polycomb group protein controls expression of PHERES1 by parental imprinting. Nature. 37, 28-30 (2005).
- Fransz, P., De Jong, J. H., Lysak, M., Castiglione, M. R., Schubert, I. Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14584-14589 (2002).
- Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. Transcriptome analysis of single cells. J. Vis. Exp. (50), e2634 (2011).
- Nodine, M. D., Bartel, D. P. Maternal and paternal genomes contribute equally to the transcriptome of early plant embryos. Nature. 482 (7383), (2012).
- Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A., Bevan, M. W. G. U. S. fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6, 3901-3907 (1987).
- Schmidt, A., Wöhrmann, H., Raissig, M. T., Arand, J., Gheyselinck, J., Gagliardini, V., Heichinger, C., Walter, J., Grossniklaus, U. The Polycomb group protein MEDEA and the DNA methyltransferase MET1 interact in Arabidopsis to repress autonomous endosperm development. Plant J. 73 (5), (1111).
