Analisi delle Targeted proteina virale nanoparticelle distribuito HER2 + Tumori
Summary
Questo articolo descrive le procedure per l'analisi di immagini ottiche delle nanoparticelle tumore-mirato, Herdox. In particolare, l'uso dettagliato del dispositivo di imaging multimodale per la rilevazione del tumore orientare e valutare la penetrazione del tumore è descritta qui.
Abstract
La nanoparticella HER2 + tumore-mirato, Herdox, espone accumulo tumore preferenziale e ablazione del tumore-crescita in un modello animale di cancro HER2 +. Herdox è formato da non covalente auto-assemblaggio di un tumore mirato proteina penetrazione cella con l'agente chemioterapico, doxorubicina, tramite una piccola linker acido nucleico. Una combinazione di elettrofilo, intercalazione, e le interazioni oligomerizzazione facilitare l'auto-assemblaggio in tutto 10-20 particelle nm. Herdox esibisce la stabilità nel sangue e nella conservazione prolungata a temperature diverse. Consegna sistemica di Herdox in topi portatori di tumore provoca la morte delle cellule tumorali, senza effetti negativi rilevabili a tessuto non tumorale, tra il cuore e il fegato (che subiscono danni segnata da doxorubicina non mirati). HER2 elevazione facilita il targeting di cellule che esprimono il recettore del fattore di crescita epidermico umano, quindi tumori che presentavano livelli elevati di HER2 mostrano maggiore accumulo di Herdox rispetto alle cellule exprescantare livelli inferiori, sia in vitro che in vivo. L'imaging di fluorescenza combinata con l'analisi confocale e spettrale situ ha permesso di verificare in vivo del tumore targeting e la penetrazione delle cellule tumorali di Herdox dopo la consegna sistemica. Qui dettaglio i nostri metodi per la valutazione targeting tumorale tramite l'imaging multimodale dopo la consegna sistemica.
Introduction
Tumore-targeting della chemioterapia ha il potenziale per eliminare le cellule tumorali a dosi inferiori rispetto ai farmaci mirati perché più della terapia erogata può accumulare la destinazione prevista in luogo della distribuzione di tessuto non tumorale. Come quest'ultima situazione sarebbe diluire la efficacia del farmaco e quindi richiedono dosi più elevate per essere efficace, tumore-targeting ha sia vantaggi terapeutici e di sicurezza oltre il trattamento non mirati standard.
Targeting chemioterapia di incapsulamento in nanoparticelle auto-assemblati permette al farmaco di rimanere chimicamente non modificato in contrasto con i farmaci che sono covalentemente legati a molecole di targeting. Come tale collegamento ha il potenziale per alterare l'attività sia del farmaco e la molecola di guida; assemblaggio non covalente permette potenza del farmaco da conservare.
Abbiamo precedentemente dimostrato che il romanzo a tre componenti, complesso auto-assemblati, Herdox, rivolge HER2 + tumori <em> In vivo e suscita l'ablazione del tumore-crescita, risparmiando il tessuto normale, compreso il cuore 1. Herdox è formato attraverso interazioni non covalenti tra la proteina recettoriale cellula-penetrazione, HerPBK10, e l'agente chemioterapico, doxorubicina (Dox), tramite una piccola linker acido nucleico. HerPBK10 lega il recettore del fattore di crescita epidermico umano (HER) e attiva endocitosi mediata da recettore 2-4, mentre endosomal penetrazione membrana viene realizzato attraverso incorporazione della adenovirus-derivato penton base di capside proteico 4-6. Un dominio carica positivamente sulla proteina permette acido nucleico legante 4, 5, attraverso il quale può essere trasportato Dox DNA-intercalato per la somministrazione mirata. Elettrofila, intercalazione, e possibilmente interazioni oligomerizzazione di proteine facilitano l'auto-assemblaggio in tutto 10-20 particelle nm che sono stabili nel sangue e sotto lo stoccaggio prolungato a temperature diverse 1. Preferenziale mira a LEI2 + cellule tumorali è facilitata dalla maggiore affinità ligando quando HER2 è elevata.
Nostri studi precedenti hanno dimostrato che la consegna sistematica delle rese Herdox accumulo preferenziale nei tumori oltre tessuto non tumorale e in confronto a untargeted Dox 1, e la penetrazione nelle cellule tumorali in vivo 7. Abbiamo osservato che Herdox rilasci Dox dopo l'entrata delle cellule tumorali, permettendo l'accumulo di Dox nel nucleo 1. Tumore-accumulo sembra essere correlata con il livello recettoriale, come tumori esprimenti HER2-relativamente bassi accumulano meno Herdox rispetto a quelli con livelli relativamente più elevati HER2 1. Inoltre, la concentrazione effettiva morte cellulare presenta una correlazione inversa con HER2 visualizzazione su linee cellulari tumorali esprimenti differenti livelli di HER2 superficie cellulare 1. Herdox mostra un vantaggio terapeutico e di sicurezza oltre Dox non mirati, come l'uccisione del tumore si verifica in più di dosi 10 volte inferiore rispetto a decomprimeregramme incentrato farmaco e non produce effetti avversi riscontrabili su cuore (rilevata mediante ecocardiografia e istologici macchia) o il fegato (riconosciuto mediante TUNEL macchia) dei tessuti, in contrasto untargeted Dox 1. Nonostante la sua derivazione da una proteina del capside virale, HerPBK10 presenta nessun immunogenicità rilevabile a livelli terapeutici 2. Mentre gli anticorpi preesistenti a tutto adenovirus possono riconoscere HerPBK10, non sono in grado di prevenire vincolante 2 cellule.
Volume del tumore misurata nel tempo è un metodo standard di valutazione dell'efficacia terapeutica delle terapie mirate, ed è stato impiegato per valutare l'efficacia terapeutica di Herdox. Integrando questo approccio con in vivo e ex vivo imaging di fluorescenza intensità ci ha permesso di valutare meglio gli obiettivi di efficienza 7. Abbiamo specificatamente integrato in situ confocale di tumori asportati con analisi spettrale di Dox fluorescenza per verificare che non Herdoxt accumulato solo a tumori in vivo, ma penetrato nelle cellule tumorali e Dox consegnato nel citoplasma e nel nucleo 7. Analisi spettrale inoltre ci ha permesso di distinguere Dox fluorescenza da autofluorescenza 7.
Qui mostriamo più in dettaglio il nostro approccio per la valutazione Herdox in vivo dopo la consegna sistemica, e, soprattutto, per valutare il targeting attraverso metodi di imaging multimodali e di analisi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dox fluorescenza può essere rilevabile in vivo utilizzando la termocamera multimode quando i tumori sono sottocutaneo. Tuttavia, la dose terapeuticamente efficace di Herdox (0,004 mg / kg) è al di sotto della soglia di rilevamento dopo una singola dose. Al contrario, dopo 7 iniezioni giornaliere (1x/day per 7 giorni), l'accumulo tumore e ritenzione della particella è sufficiente per consentire la visualizzazione di Dox fluorescenza.
È critico quando si lavora con Dox o quals…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni a LKM-K dal National Institutes of Health / National Cancer Institute (R01CA129822 e R01CA140995). Dr. Medina-Kauwe ringrazia C. Rey, M. M-Kauwe e D. Revetto per il supporto continuo.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Fluorescence laser scanning confocal microscope | Leica | SPE | |
| In Vivo Optical Imager | Spectral Molecular Imaging | Multimode In Vivo Optical Imager | |
| Doxorubicin-HCl | Sigma-Aldrich | D4035 | |
| Nude (NU/NU) mouse, female, 6-8 week | Charles River | Strain code 088 | |
| MDA-MB-435 human HER2+ tumor cells | NCI-Frederick Cancer DCTD Tumor/Cell Line Repository | 0507292 | |
| 3/10 cc insulin syringe U-100 with 29G x 1/2″ Ultra-FineIV permanently attached needle | BD | 309301 | |
| Delta T chamber | Bioptechs | 04200417B |
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