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Bioengineering

Análise de Proteína Viral alvejado Nanopartículas entregue para tumores HER2 +

doi: 10.3791/50396 Published: June 18, 2013

Summary

Este artigo detalha os procedimentos para a análise das nanopartículas tumor-alvo, Herdox imageamento óptico. Em particular, o uso detalhado do aparelho de imagem para detecção do tumor multimodo alvo e avaliar a penetração do tumor é descrito aqui.

Abstract

A nanopartícula HER2 + tumor-alvo, Herdox, apresenta acúmulo tumor preferencial e ablação de tumores de crescimento em um modelo animal de câncer HER2 +. Herdox é formada por auto-montagem não covalente de uma proteína de penetração nas células alvo do tumor com o agente de quimioterapia, doxorubicina, através de um pequeno ligante de ácido nucleico. Uma combinação de eletrofílico, intercalação e interações oligomerização facilitar a auto-montagem em partículas redondas 10-20 nm. Herdox exibe estabilidade no sangue, bem como em armazenamento prolongado a temperaturas diferentes. Entrega sistémica de Herdox em ratos portadores de tumor resulta na morte de células de tumor, sem efeitos adversos detectáveis ​​para tecido não-tumoral, incluindo o coração e fígado (que sofrer danos marcados por doxorubicina não segmentados). HER2 elevação facilita direccionamento para células que expressam o receptor do factor de crescimento epidérmico humano, daí tumores exibindo níveis elevados de HER2 exibem uma maior acumulação de células em comparação com Herdox expressãocantar níveis mais baixos, tanto in vitro como in vivo. Imagem intensidade de fluorescência combinada com a análise espectral confocal e situ nos permitiu verificar em tumor vivo segmentação e penetração de Herdox após a entrega sistemática de células tumorais. Aqui detalhamos os nossos métodos para avaliar tumor alvo através de imagens multimodo após a entrega sistêmica.

Introduction

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Tumor-alvo de quimioterapia tem o potencial de eliminar células cancerosas com uma dose mais baixa em comparação com as drogas irrelevantes porque a maior parte da terapia administrada pode acumular-se ao seu destino pretendido, em vez de distribuir a tecido não do tumor. A última situação iria diluir a eficácia do fármaco e, assim, requerem doses mais elevadas para ser eficaz, o tumor-alvo tem vantagens terapêuticas e segurança ao longo do tratamento não específico padrão.

Targeting quimioterapia por encapsulamento em nanopartículas automontadas permite que a droga permaneça quimicamente não modificado, em contraste com as drogas que são covalentemente ligados a moléculas alvo. Como tal ligação tem o potencial de alterar a actividade de ambos o fármaco e a molécula alvo; montagem não covalente permite que a potência da droga a ser retida.

Nós mostramos anteriormente que o romance de três componentes, complexo de auto-montados, Herdox, visa tumores HER2 + 1. Herdox é formado através de interacções não covalentes entre a proteína de ligação ao receptor de células-penetração, HerPBK10, e o agente quimioterapêutico, a doxorrubicina (Dox), através de um pequeno ligante de ácido nucleico. HerPBK10 se liga o factor de crescimento epidérmico humano (HER), e desencadeia a endocitose mediada pelo receptor de 2-4, enquanto que a penetração da membrana endossomal é conseguida através da incorporação do derivado de adenovírus penton base de proteína da cápside 4-6. Um domínio carregado positivamente com a proteína de ligação de ácido nucleico permite a 4, 5, através da qual o ADN-Dox intercalado pode ser transportado para a entrega alvo. Eletrofílica, intercalação e, possivelmente, as interações de oligomerização da proteína facilitar a auto-montagem em volta de 10-20 nm partículas que são estáveis ​​no sangue e sob o armazenamento prolongado em temperaturas diferentes 1. Alvo preferencial para HER2 + células tumorais é facilitada pela afinidade de ligando aumentada quando HER2 é elevado.

Os nossos estudos anteriores mostraram que a administração sistémica de rendimentos Herdox acumulação preferencial em tumores de mais de tecido não-tumoral e em comparação com uma Dox irrelevantes, e a penetração de células tumorais in vivo, 7. Temos observado que as versões Herdox Dox após a entrada de células tumorais, permitindo a acumulação Dox no núcleo 1. Tumor-acumulação parece correlacionar-se com o nível do receptor, como tumores que expressam HER2 relativamente baixas acumulam menos Herdox em comparação com aqueles com níveis mais elevados comparativamente HER2 1. Além disso, a concentração efectiva de morte celular exibe uma correlação inversa com a exibição de HER2 em linhas de células de tumor que expressam superfície celular diferentes níveis de HER2 1. Herdox apresenta uma vantagem terapêutica e segurança sobre Dox irrelevantes, como a matança tumor ocorre em mais de dose de 10 vezes menor em comparação com a untarigualmente dirigido droga e não produz efeitos adversos detectáveis ​​no coração (detectado por ecocardiografia e histológica mancha) ou fígado (detectado por coloração TUNEL) do tecido, em contraste com um Dox irrelevantes. Apesar de sua derivação a partir de uma proteína do capsídeo viral, HerPBK10 não apresenta imunogenicidade detectável em níveis terapêuticos 2. Considerando anticorpos pré-existentes para adenovírus todo pode reconhecer HerPBK10, eles são incapazes de impedir a ligação de 2 celular.

O volume do tumor medido ao longo do tempo é um método padrão de avaliação da eficácia terapêutica de terapêuticas específicas, e tem sido utilizada para avaliar a eficácia terapêutica do Herdox. Complementando esta abordagem com in vivo e ex vivo de imagens intensidade de fluorescência nos permitiu avaliar melhor direcionamento eficiência 7. Temos especificamente integrados in situ de imagem confocal de tumores excisados ​​com a análise espectral de Dox fluorescência para verificar que nenhum Herdoxt só acumulou em tumores in vivo, mas penetrou nas células tumorais e Dox entregue no citoplasma e núcleo 7. A análise espectral, além disso, nos permitiu distinguir Dox fluorescência da autofluorescência 7.

Aqui demonstramos em maior detalhe a nossa abordagem para avaliar Herdox in vivo, após a administração sistémica, e mais importante, para avaliar a segmentação por métodos de imagem multimodo e análises.

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Protocol

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1. Entrega sistêmica In vivo

  1. Misturar suficiente Herdox com solução salina estéril para equiparar 0,2 ml de uma dose de 0,004 mg / kg de Herdox por injecção durante 6-8 semanas de idade nu / nu rato rolamento tumores subcutâneos bilaterais xenoenxerto flanco.
  2. Suavemente Herdox desenhar a mistura para uma seringa de insulina 3/10 cc com uma agulha 29G, evitando bolhas.
  3. A anestesia é induzida por exposição breve isoflurano numa câmara de indução equipado com um sistema de limpeza de gás (taxa de fluxo de oxigénio: 0,5-1 l / min, concentração de isoflurano: 3-4% (ou inferior).
  4. Injectar a mistura total na veia da cauda de um rato anestesiado (0,2 ml por injecção). Injecção IV também pode ser realizada em um contido, rato não anestesiados.
  5. Repetir a injecção no mesmo rato para mais seis dias seqüenciais, uma vez por dia.

2. Imagens de fluorescência in vivo

O acúmulo de Herdox fluorescência em tumores podeser detectáveis ​​até ao último dia da injecção (Dia 7), utilizando um gerador de imagens multimodo. Os procedimentos abaixo implica a utilização de uma macro-sistema de iluminação e de detecção de personalização (Figura 1) 8.

  1. Ligue o multimodo In vivo Imager Optical.
  2. Escolha um filtro passa-banda de emissão (590 nm ± 30 nm) adequado para a detecção de fluorescência doxorrubicina.
  3. Ligue Argon-Krypton laser e colocar um filtro passa-banda de excitação (488 nm ± 10 nm) no caminho óptico laser.
  4. Ligue o sistema de anestesia e em seguida, coloque o mouse na câmara de anestesiante (taxas de fluxo de oxigênio: 0,5-1 L / min, concentração de isoflurano: 3-4% (ou inferior), equipados com um sistema de limpeza de gás.
  5. Transferir o mouse da câmara de anestesiar à câmara de imagem do multimodo In vivo Imager Optical quando o mouse está anestesiado.
  6. Coloque um nosecone sobre o nariz do mouse e abrir o fluxo de administrar anestesia contínuasia durante a aquisição de imagem (taxa de fluxo de oxigênio: 0,5-1 L / min, a concentração de isoflurano: 2-3% (ou inferior).
  7. Adquirir imagens de fluorescência utilizando um tempo de exposição de 5-15 seg.
  8. Realizar a análise de imagem e processamento, incluindo correção de fundo ou ajuste de contraste.

3. Imagem de Fluorescência ex vivo

Herdox fluorescência pode ser trabalhada em tumores e órgãos específicos (incluindo o fígado, rim, baço, coração e músculo esquelético), colhidas a partir de ratinhos sacrificados às 24 horas após a última injecção (7 dias) de Herdox.

  1. Ligue o multimodo In vivo Imager Optical.
  2. Escolha um filtro passa-banda de emissão (580 nm ± 20 nm) para detecção de fluorescência doxorrubicina.
  3. Ligue Argon-Krypton laser e colocar um filtro passa-banda de excitação (488 nm ± 10 nm) no caminho óptico laser.
  4. Tumores lugar e órgãos específicos dispostos em uma placa de Petri para a imagem da câmara of o multimodo Em Imager Optical vivo.
  5. Adquirir imagens de fluorescência de tecidos, utilizando um tempo de exposição de 5-15 seg. Um exemplo de aquisição da imagem de fluorescência inicial é mostrado na figura 2a. Repita o mesmo usando uma placa de Petri vazia, que servirá como pano de fundo (Figura 2b).
  6. Realizar a análise de imagem e processamento, incluindo correção de fundo ou ajuste de contraste. Um exemplo de uma imagem corrigida é mostrado na Figura 2c, resultante da subtração da Figura 2b a partir da Figura 2a.

4. In situ imagem confocal de Tumores

Na imagem confocal situ permite a detecção e análise da acumulação tumoral Herdox ao nível celular.

  1. Ligue um microscópio confocal Leica SPE.
  2. Selecione 488 luz laser nm para a excitação de doxorrubicina e emissão de comprimentos de onda (560-620 nm) para a doxorrubicinadetecção por fluorescência.
  3. Selecione uma objetiva de 40X ou 63X e óleo de imersão queda na lente objetiva.
  4. Extrair tumores fresco a partir de ratos sacrificados que receberam previamente tratamentos Herdox e simulada como descrito no procedimento 2.
  5. Tumores colocar em uma placa de Petri sobre gelo para evitar a degradação do tecido e, em seguida, transferir os tumores a uma câmara Delta T para a imagem confocal.
  6. Adquirir imagens confocal dos tumores em profundidades focais seqüenciais (tamanho do passo: 1 mícron, espessura: 20 mm). Um exemplo de imagens adquiridas sequencialmente ao longo do eixo z é mostrado na Figura 3, painel da esquerda.
  7. Realizar intensidade máxima z projecção das imagens. Uma projecção de intensidade máxima z empilhado imagens é mostrado na Figura 3, painel da direita.
  8. Calcular média intensidades de fluorescência de intensidade máxima Z -. Imagens de projeção média intensidades de fluorescência das imagens sobre o campo de vista global foram calculard usando ImageJ.

5. Spectral Imaging Ratiometric e Análise

Imagem espectral Ratiometric e análise permite discriminação entre Dox fluorescência e autofluorescência.

  1. Energia em um microscópio confocal de varredura a laser de fluorescência.
  2. Adquirir 15 imagens dos tumores Herdox-tratadas e não tratadas, a uma profundidade especificada no intervalo espectral de 510-650 nm, com um tamanho de passo de 10 nm, e a luz de excitação a 488 nm, utilizando um microscópio confocal Leica SPE.
  3. Prepara-se uma solução 100 uM de doxorrubicina.
  4. Realizar imagem espectral da solução de doxorrubicina 100 uM para obter a assinatura espectral pura de fluorescência Dox (faixa espectral: 510-650 nm, um tamanho de passo: 10 nm). Os resultados típicos de aquisição de imagem a partir de imagiologia espectral e do espectro de fluorescência resultante representada em gráfico são mostrados na Figura 4.
  5. Adquirir a assinatura espectral autofluorescência de uma imagem cube (faixa espectral: 510-650 nm, um tamanho do passo: 10 nm) obtidos por imagem espectral de tumores não tratados. Os resultados típicos de aquisição de imagem a partir de imagiologia espectral e do espectro de fluorescência resultante representada em gráfico são mostrados na Figura 5.
  6. Gerar quatro assinaturas espectrais de referência (puro autofluorescência, 0.1.doxorubin 0,9. Autofluorescência, 0.2. Doxorrubicina 0,8. Autofluorescência, 0.3.doxorubin 0,7. Autofluorescência) utilizando o programa que nós desenvolvemos 9. Uma curva típica que mostra quatro assinaturas espectrais de referência é mostrado na Figura 6.
  7. Realizar classificação espectral das imagens, tal como definido pela referência de assinaturas espectrais através de medida de distância euclidiana usando o programa que anteriormente desenvolvido 9.
  8. Realizar separação espectral linear dessas imagens usando um programa espectral desmistura (plug-in ImageJ) desenvolvemos 7, 10, para comparação com a imagem espectral e análise raciométrica. Um example de separar fluorescência Herdox de autofluorescência por separação espectral linear é mostrada na Figura 7.

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Representative Results

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A Figura 1 mostra o gerador de imagens in vivo protótipo óptico, o qual foi construído com o objectivo de aquisição de imagem em várias modalidades, incluindo a intensidade de fluorescência, espectral, tempo de vida, 2-fotão, confocal intra-vital, e imagem de bioluminescência. Além disso, a elevada sensibilidade da câmara de refrigeração e as linhas de laser de alta potência incorporado no presente sistema produz imagens de fluorescência de contraste mais elevados em comparação com os sistemas de imagiologia óptica 11 comerciais, especialmente para a detecção in vivo de doxorrubicina fluorescência. Assim, este sistema era crítico para a utilização no presente estudo, a aquisição de vários pontos de dados complementares na avaliação da Herdox in vivo.

A fluorescência do tumor alta mostrada na figura 2 é típica após a administração sistémica de Herdox, e indicativa da sua segmentação tumoral preferencial. A fluorescência detectada no músculo esquelético é atípico e pode resultar from anomalias no procedimento de injecção (isto é, injectando demasiado perto do corpo). Qualitativamente, a imagem mostrada na Figura 2a tem baixa de fundo. No entanto, para realizar uma análise quantitativa das intensidades de fluorescência relativa do tecido, é necessária a realização de uma correcção do fundo usando um prato vazio, como mostrado na Figura 2b. Isto pode resultar em uma "base corrigida" imagem mostrada na Figura 2c, que tem um maior sinal de fundo na orla da imagem em comparação com o original (Figura 2a), porque a imagem de fundo (Fig. 2b) tem intensidades mais baixas na borda do imagem. Assim, enquanto que a correcção de fundo pode proporcionar um aumento do sinal na borda da imagem, isto é um passo necessário para a análise quantitativa subsequente.

A fim de obter uma avaliação quantitativa da acumulação Herdox em tumores, as imagens de fluorescência confocal foram obtidos em diferentes focalprofundidades in situ, seguido de intensidade máxima z projecção das imagens (Figura 3), e a aquisição da intensidade de fluorescência média da imagem projectada. A imagem resultante contém a informação sobre a acumulação ao longo dos indicados Herdox z profundidades em cada pixel, e, assim, a média da intensidade de fluorescência reflecte as acumulações globais Herdox em tumores em diferentes profundidades quantitativamente.

Para distinguir Herdox fluorescência de autofluorescência em tumores e quantitativamente discriminar os dois com alta especificidade, imagiologia espectral raciométrica e análise foi realizada. As assinaturas espectrais puros para a doxorrubicina e autofluorescência obtido por imagiologia espectral são ilustrados nas Figuras 4 e 5, respectivamente. Assinaturas espectrais de referência (Figura 6) também foram criados por mistura de diferentes proporções das assinaturas espectrais puras utilizando o programa foi desenvolvido 9. Cada comuniquence assinatura espectral aqui representa a fluorescência relativa de Herdox acumulado nos tumores no que respeita a autofluorescência. As imagens classificação espectral (dados não foi mostrado neste artigo) mostraram melhores acumulações Herdox quantitativos 7 em comparação com a imagem sem mistura espectral obtida usando as assinaturas espectrais de referência puros (Figura 7). Figuras 4-7 representam os achados característicos na realização imagem espectral raciométrica e análise.

Figura 1
Figura 1. Imager óptico vivo. Um sistema de imageamento óptico com intensidade de fluorescência, espectral, tempo de vida de fluorescência e capacidade de imagem confocal intravital deve ser usado. O sistema de imagem óptica multimodo usada aqui é mostrado, e tem sido descrevendoed previamente 8. Imagem fornecida com a devida permissão de Springer Science & Business Media BV: Hwang, JY, et al, Mol.. Imagem Biol., 14, 431-42 (2012).

Figura 2
Figura 2. Imagens representativas de intensidade de fluorescência dos órgãos internos e tumores extraídas de um ratinho receber Herdox. Os tecidos e os tumores foram colhidos a partir de ratinhos sacrificados em 24 horas após a última injecção (7 dias) de imagens Herdox intensidade de fluorescência antes e depois de correcção de fundo (b) são representados por (a) e (c), respectivamente. clique aqui para ampliar descobrir .


Figura 3. Intensidade máxima do z-projeção das imagens obtidas em sequenciais z profundidades. As imagens empilhadas mostrados à esquerda são representativos dos exames confocal do tecido tumoral obtido no sequenciais um profundidades uM. A imagem à direita mostra a compilação das imagens empilhados do lado esquerdo.

Figura 4
Figura 4. Aquisição de uma assinatura espectral pura para a doxorubicina. Após as imagens de uma solução de doxorrubicina foram obtidos a comprimentos de onda sequenciais dentro de 510-650 nm, com um tamanho de passo de 10 nm (esquerda), a assinatura espectral pura foi obtida por doxorrubicina usando o programa que nós desenvolvemos. Clique aqui para ver a figura maior .

Figura 5
Figura 5. Aquisição de uma assinatura espectral puro para autofluorescência. Depois que as imagens de tumor tratados foram obtidas em comprimentos de onda sequenciais dentro 510-650 nm, com um passo de tamanho de 10 nm (à esquerda), a assinatura espectral puro para autofluorescência foi obtida usando o programa que nós desenvolvemos. Clique aqui para ver a figura maior .

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Figura 6. Quatro referência assinaturas espectrais de imagem espectral raciométrica e análise. As assinaturas espectrais de referência foram criadas pela mistura das assinaturas espectrais puras usando o programa que nós desenvolvemos. A linha sólida de cor verde representa autofluorescência pura, a linha contínua de cor vermelha representa 0.1.doxorubin 0,9. Autofluorescência, a linha contínua de cor azul representa 0,2. doxorrubicina 0,8. autofluorescência e a linha sólida cor ciano 0.3.doxorubin 0,7. autofluorescência, respectivamente. A figura é reproduzida de trabalho dos autores anteriores: Hwang, JY, et al, PLoS One 7 (4), (2012)...

Figura 7
Figura 7. Herdox fluorescência no tecido antes e depois da des-mistura espectral. Após a obtenção das assinaturas espectrais de Dox e autofluorescência, thsinais de e Dox são separados usando linear de mistura espectral un 12,13. A figura mostra a imagem mista autofluorescência e Herdox diante da imagem Herdox separados após espectral de mistura espectral un-un-mistura e.

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Discussion

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Dox fluorescência pode ser detectada in vivo utilizando o gerador de imagens multimodo quando os tumores são subcutâneas. No entanto, a dose terapeuticamente eficaz de Herdox (0,004 mg / kg) é inferior ao limiar de detecção, após uma única dose. Em contraste, após 7 injecções diárias (1x/dia durante 7 dias), a acumulação do tumor e retenção das partículas é suficiente para permitir a visualização de Dox fluorescência.

É essencial quando se trabalha com Dox ou qualquer outro fluoróforo para imagem in vivo que a técnica de limpeza é usado. Goteja sobre o exterior do rato deve ser evitado, uma vez que o gerador de imagens detectar a fluorescência no exterior da pele, sem discriminar se o Dox é externa ou interna. Do mesmo modo, a contaminação Dox as luvas podem deixar marcas fluorescentes no exterior do rato durante o manuseamento dos animais, provocando, assim, a detecção de fluorescência errónea.

No sistema óptico multimodo, umfeixe de laser é utilizada para excitação do Herdox. O feixe de laser tem, tipicamente, um perfil de Gauss. Assim, para a excitação uniforme de espécimes de interesse, são utilizados difusores ópticos. No entanto, a luz de laser difundido tanto preserva um perfil do feixe Gaussiano. Deste modo, para a análise quantitativa ideal, a correcção de fundo tem de ser executada. As imagens antes corrigidos e fundo normalmente têm uma profundidade de 16 bits. Portanto, antes da correcção de fundo é realizada, a profundidade da imagem deve ser convertido para 32 bits, a fim de evitar os erros indesejados de profundidade da imagem da discrepância entre as imagens resultantes e de entrada.

Na aquisição de uma imagem de fundo, um papel preto (Artagain) foi previamente colocada em uma placa de imagem, a fim de evitar reflexos da iluminação antes de realizar imagens de fluorescência. No entanto, uma vez que a câmara é altamente sensível, a partir de sinais de fundo baixa o papel negro foi detectado pela câmara. Por isso, o fundosinais mostrados na Figura 2 veio do papel negro, em vez de a partir de uma placa de Petri vazia.

Uma alta concentração de solução de doxorrubicina foi utilizado para obter as assinaturas espectrais puros com alta precisão. Examinamos ainda resoluções espectrais em que o sistema é capaz de detectar a fluorescência suficiente da amostra para produzir assinaturas espectrais de confiança. Como resultado, a resolução espectral foi ajustado para 10 nm. Aqui verificou-se que o microscópio sob a definição de resoluções espectrais mais elevados (<10 nm), não conseguimos detectar a fluorescência suficiente para produzir assinaturas espectrais fiáveis. Com as assinaturas espectrais puras, que poderia gerar várias assinaturas espectrais raciométrica (Figura 6). Em particular, podemos distinguir quantitativamente a partir de sinais de fluorescência Herdox autofluorescência pelas respectivas assinaturas espectrais raciométrica 7. A imagem sem mistura espectral obtida com a assinatura espectral puras (Figura 7) foi semelhante à imagem classificada pelas duas assinaturas espectrais de referência (azul:. 0.2.Dox 0,8 Autofl e verde:.. Autofl). No conjunto, a imagem confocal espectral / raciométrica fornecida mais informação quantitativa sobre a acumulação Herdox em células tumorais in situ com alta resolução, verificando-se assim a sua utilidade na análise das nanopartículas entregues aos tumores HER2 +.

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Disclosures

O autor, Daniel Farkas, é presidente do espectral Molecular Imaging. Os demais autores não têm interesses conflitantes.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado por subvenções a LKM-K dos Institutos Nacionais de Saúde / Instituto Nacional do Câncer (R01CA129822 e R01CA140995). Dr. Medina-Kauwe graças C. Rey, M. M-Kauwe e D. Revetto para apoio contínuo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fluorescence laser scanning confocal microscope Leica SPE
In Vivo Optical Imager Spectral Molecular Imaging Multimode In Vivo Optical Imager
Doxorubicin-HCl Sigma-Aldrich D4035
Nude (NU/NU) mouse, female, 6-8 week Charles River Strain code 088
MDA-MB-435 human HER2+ tumor cells NCI-Frederick Cancer DCTD Tumor/Cell Line Repository 0507292
3/10 cc insulin syringe U-100 with 29G x 1/2" Ultra-FineIV permanently attached needle BD 309301
Delta T chamber Bioptechs 04200417B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Hwang, J. Y., Farkas, D. L., Medina-Kauwe, L. K. Analysis of Targeted Viral Protein Nanoparticles Delivered to HER2+ Tumors. J. Vis. Exp. (76), e50396, doi:10.3791/50396 (2013).More

Hwang, J. Y., Farkas, D. L., Medina-Kauwe, L. K. Analysis of Targeted Viral Protein Nanoparticles Delivered to HER2+ Tumors. J. Vis. Exp. (76), e50396, doi:10.3791/50396 (2013).

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