Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

تحليل المستهدفة البروتين الفيروسي النانوية يسلم إلى HER2 + أورام

doi: 10.3791/50396 Published: June 18, 2013

Summary

تفاصيل هذه المقالة الإجراءات لتحليل التصوير البصري للجسيمات متناهية الصغر للورم المستهدفة، HerDox. على وجه الخصوص، وصفت تفاصيل استخدام جهاز التصوير المتعدد للكشف عن الورم استهداف وتقييم تغلغل الورم هنا.

Abstract

جسيمات متناهية الصغر HER2 + ورم المستهدفة، HerDox، يسلك تراكم الورم تفضيلية والاجتثاث الورم للنمو في نموذج حيواني من HER2 + سرطان. يتم تشكيل HerDox من قبل غير التساهمية التجميع الذاتي للورم استهدفت خلية البروتين اختراق مع وكيل العلاج الكيميائي، دوكسوروبيسين، عن طريق رابط صغير الحمض النووي. مزيج من بالإلكترونات، إقحام، والتفاعلات oligomerization تسهيل التجميع الذاتي في جولة 10-20 الجسيمات نانومتر. HerDox يسلك الاستقرار في الدم وكذلك في تخزين طويلة في درجات حرارة مختلفة. تسليم النظامية من HerDox في الفئران الحاملة للورم ينتج في موت خلايا الورم مع عدم وجود آثار ضارة يمكن كشفها إلى الأنسجة غير السرطانية، بما في ذلك القلب والكبد (التي تخضع الضرر تميزت دوكسوروبيسين تشتته). HER2 ارتفاع يسهل استهداف الخلايا معربا عن الإنسان مستقبلات عامل نمو البشرة، وبالتالي الأورام بعرض مستويات مرتفعة HER2 يحمل أكبر تراكم HerDox مقارنة اكسبريس الخلاياالغناء المستويات الدنيا، سواء في التجارب المختبرية والحية. وقد سمح التصوير كثافة مضان جنبا إلى جنب مع التحليل الطيفي ومتحد البؤر في الموقع لنا للتحقق من الورم في الجسم الحي استهداف واختراق الخلايا السرطانية من HerDox بعد الولادة النظامية. نحن هنا التفاصيل طرقنا لتقييم الورم عبر استهداف التصوير المتعدد بعد الولادة النظامية.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

استهداف الورم من العلاج الكيميائي لديه القدرة على القضاء على الخلايا السرطانية في جرعة أقل بالمقارنة مع الأدوية غير مستهدفة لأن أكثر من العلاج تسليمها يمكن أن تتراكم في وجهتها المقصودة بدلا من توزيعها على الأنسجة غير السرطانية. حيث أن الوضع الأخير سيضعف من فعالية الدواء وبالتالي تتطلب جرعات أعلى لتكون فعالة، استهداف الورم على حد سواء مزايا علاجية والسلامة على معيار المعاملة غير المستهدفة.

استهداف العلاج الكيميائي عن طريق التغليف في الجسيمات النانوية الذاتي تجميعها يسمح للدواء أن تظل غير معدلة كيميائيا على النقيض من الأدوية التي ترتبط تساهميا إلى جزيئات الاستهداف. على هذا النحو الربط لديه القدرة على تغيير النشاط من كل من المخدرات وجزيء الاستهداف؛ يسمح التجمع غير التساهمية فاعلية الدواء ليتم الاحتفاظ بها.

لقد أظهرنا سابقا أن الرواية ثلاثة مكونات، مجمع الذاتي تجميعها، HerDox، تستهدف HER2 + الأورام 1. يتم تشكيل HerDox من خلال التفاعلات غير التساهمية بين مستقبلات ملزم بروتين الخلية الاختراق، HerPBK10، وكيل العلاج الكيميائي، دوكسوروبيسين (دوكس)، عبر رابط صغير الحمض النووي. HerPBK10 يربط الإنسان مستقبلات عامل نمو البشرة (HER) ويطلق الإلتقام مستقبلات بوساطة 2-4، في حين يتم إنجاز اختراق غشاء endosomal من خلال إدماج اتش المستمدة بينتون قاعدة قفيصة البروتين 4-6. A المجال المشحون إيجابيا على البروتين تمكن الحمض النووي ملزم 4، 5، التي من خلالها دوكس DNA-مقحم يمكن نقلها للتسليم المستهدفة. بالإلكترونات، إقحام، وربما تفاعلات البروتين oligomerization تسهيل التجميع الذاتي في جولة 10-20 نانومتر الجزيئات التي هي مستقرة في الدم وتحت الموسعة التخزين عند درجات حرارة مختلفة 1. التفضيلية التي تستهدف لهاومما يسهل 2 + خلايا الورم عن طريق تقارب يجند المحسن عندما يتم رفع HER2.

وقد أظهرت دراساتنا السابقة أن تسليم النظامية من غلة HerDox تراكم تفضيلي في الأورام أكثر من الأنسجة غير السرطانية وبالمقارنة مع تشتته دوكس وتغلغل في الخلايا السرطانية في الجسم الحي 7. وقد لاحظنا أن إطلاق HerDox دوكس بعد دخول الخلايا السرطانية، مما يتيح تراكم دوكس في نواة 1. يظهر ورم تراكم للربط مع مستوى مستقبلات، مثل الأورام HER2، معربا عن منخفض نسبيا تتراكم أقل HerDox مقارنة مع الذين لديهم مستويات أعلى نسبيا HER2 1. وعلاوة على ذلك، فإن التركيز الفعال موت الخلايا يسلك جود علاقة عكسية مع HER2 العرض على خطوط الخلايا السرطانية معربا عن اختلاف سطح الخلية HER2 مستويات 1. HerDox يسلك ميزة العلاجية والسلامة على دوكس تشتته، كما يحدث قتل الورم في أكثر من جرعة أقل 10 مرات مقارنة untarالمخدرات geted وينتج أي تأثير سلبي للكشف على القلب (الكشف عن ضربات القلب والنسيجية وصمة عار) أو الكبد (الكشف عن النفق وصمة عار) الأنسجة، وعلى النقيض من تشتته دوكس 1. على الرغم من الاشتقاق من البروتين قفيصة الفيروسية، يسلك HerPBK10 لا المناعية للكشف على المستويات العلاجية 2. بينما الأجسام المضادة الموجودة من قبل لاتش كله يمكن التعرف HerPBK10، أنهم غير قادرين على منع الخلية ملزم 2.

يقاس حجم الورم مع مرور الوقت هو الطريقة القياسية لتقييم الكفاءة العلاجية من العلاجات المستهدفة، واستخدمت لتقييم الكفاءة العلاجية من HerDox. وقد سمح هذا النهج مع المكمل في الجسم الحي وخارج الحي مضان التصوير كثافة لنا لتقييم أفضل استهداف كفاءة 7. قمنا بدمج تحديدا التصوير متحد البؤر الموقع من الأورام مع رفعه في التحليل الطيفي للدوكس مضان للتحقق من أن لا HerDoxر تراكمت فقط في الأورام في الجسم الحي ولكن توغلوا في خلايا الورم ودوكس تسليمها إلى السيتوبلازم والنواة 7. وعلاوة على ذلك التحليل الطيفي مكن لنا أن نميز بين دوكس مضان من تألق ذاتي 7.

نحن هنا لشرح بمزيد من التفصيل نهجنا لتقييم HerDox في الجسم الحي بعد الولادة النظامية، والأهم من ذلك، لتقييم الاستهداف من خلال أساليب التصوير المتعدد والتحليلات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. النظامية التسليم في الجسم الحي

  1. خلط ما يكفي HerDox مع ملحي معقم لمساواة 0.2 مل من 0.004 ملغ / كغ جرعة من HerDox في حقن ل6-8 أسبوع من العمر NU / NU الماوس واضعة تحت الجلد الأورام طعم أجنبي الجهة الثنائية.
  2. رسم بلطف الخليط HerDox إلى حقنة الانسولين 3/10 سم مكعب مزودة إبرة 29G، وتجنب الفقاعات.
  3. وبفعل التخدير عن طريق التعرض isoflurane وجيزة في غرفة الاستقراء مجهزة بنظام الكسح الغاز (معدلات تدفق الأوكسجين: 0.5-1 لتر / دقيقة، وتركيز isoflurane و: 3-4٪ (أو أقل).
  4. حقن الخليط كله في الوريد ذيل الماوس تخدير (0.2 مل لكل حقن). ويمكن أيضا حقن IV أن يؤديها في ضبط النفس، والماوس unanesthetized.
  5. تكرار الحقن في نفس الماوس لمدة ستة أيام أكثر متتابعة، مرة واحدة يوميا.

2. التصوير مضان في الجسم الحي

تراكم HerDox مضان في الأورام يمكنيتم كشفها بواسطة اليوم الأخير من حقن (يوم 7) باستخدام جهاز تصوير المتعدد. الإجراءات أدناه ينطوي على استخدام A-إضاءة الكلي والكشف عن نظام حسب الطلب (الشكل 1) 8.

  1. بدوره على المتعدد في تصوير بصري الجسم الحي.
  2. تحديد الانبعاثات ممر الموجة مرشح (590 نانومتر ± 30 نانومتر) مناسبة للدوكسوروبيسين مضان الكشف.
  3. بدوره على الأرجون ليزر كريبتون-ووضع ممر الموجة مرشح الإثارة (488 نانومتر ± 10 نانومتر) في مسار بصري ليزر.
  4. بدوره على نظام التخدير وثم ضع الماوس في غرفة التخدير (معدلات تدفق الأوكسجين: 0.5-1 لتر / دقيقة، وتركيز isoflurane و: 3-4٪ (أو أقل) مجهزة بنظام الكسح الغاز.
  5. نقل الماوس من غرفة التخدير إلى غرفة التصوير من المتعدد في الجسم الحي تصوير الضوئي عند الفأر هو تخدير.
  6. وضع الرؤوس على الأنف من الفأرة وافتح تدفق لإدارة تخدير المستمرSIA خلال الحصول على الصور (معدلات تدفق الأوكسجين: 0.5-1 لتر / دقيقة، وتركيز isoflurane و: 2-3٪ (أو أقل).
  7. الحصول على صور مضان باستخدام ومدة التعرض من 5-15 ثانية.
  8. إجراء تحليل الصور ومعالجتها بما في ذلك تصحيح الخلفية أو تعديل التباين.

3. مضان التصوير خارج الحي

HerDox مضان ولا يمكن تصوير في الأورام وأجهزة محددة (بما في ذلك الكبد والكلى والطحال والقلب والعضلات والهيكل العظمي) تحصد من الفئران الموت الرحيم في 24 ساعة بعد (يوم 7) حقن النهائي من HerDox.

  1. بدوره على المتعدد في تصوير بصري الجسم الحي.
  2. تحديد الانبعاثات ممر الموجة مرشح (580 نانومتر ± 20 نانومتر) لدوكسوروبيسين الكشف عن مضان.
  3. بدوره على الأرجون ليزر كريبتون-ووضع ممر الموجة مرشح الإثارة (488 نانومتر ± 10 نانومتر) في مسار بصري ليزر.
  4. مكان الأورام وأجهزة معينة رتبت على طبق بيتري في غرفة التصوير Oو على المتعدد في تصوير بصري الجسم الحي.
  5. الحصول على صور مضان من الأنسجة باستخدام ومدة التعرض من 5-15 ثانية. ويرد مثال من الحصول على الصور مضان الأولي في الشكل 2A. تكرار نفس باستخدام بيتري طبق فارغ، والذي سيكون بمثابة الخلفية (الشكل 2B).
  6. إجراء تحليل الصور ومعالجتها بما في ذلك تصحيح الخلفية أو تعديل التباين. ويرد مثال لصورة تصحيحه في الشكل 2C، الناتجة عن الطرح من الشكل 2B 2A من الشكل.

4. في مجال التصوير متحد البؤر الموقع من الأورام

في مجال التصوير متحد البؤر الموقع يسمح الكشف والتحليل من تراكم الورم HerDox على المستوى الخلوي.

  1. بدوره على لايكا SPE متحد البؤر المجهر.
  2. حدد 488 نانومتر ضوء الليزر لإثارة دوكسوروبيسين وانبعاث موجات (560-620 نانومتر) لدوكسوروبيسينالكشف عن مضان.
  3. حدد الهدف 40X 63X أو وانخفاض النفط الغمر على العدسة الهدف.
  4. استخراج أورام جديدة من الفئران الموت الرحيم التي تلقت سابقا العلاجات HerDox وهمية كما هو موضح في الإجراء 2.
  5. مكان الأورام على طبق بيتري على الجليد لتجنب تدهور الأنسجة، ومن ثم نقل الأورام إلى T غرفة الدلتا للتصوير متحد البؤر.
  6. الحصول على صور متحد البؤر من الأورام في أعماق تنسيق متسلسلة (حجم الخطوة: 1 ميكرون، وسمك: 20 ميكرون). ويرد مثال من الصور بالتتابع المكتسبة على طول المحور Z في الشكل 3، لوحة اليسار.
  7. أداء أقصى كثافة Z-الإسقاط من الصور. ويرد أقصى الإسقاط كثافة Z-مكدسة الصور في الشكل 3، اللوحة اليمنى.
  8. حساب يعني كثافة مضان من الحد الأقصى للكثافة Z - صور الإسقاط متوسط ​​كثافة مضان من الصور على الحقل العام للرأي تم حسابد باستخدام يماغيج.

5. التصوير الطيفي Ratiometric وتحليل

التصوير الطيفي Ratiometric وتحليل يسمح التمييز بين دوكس مضان وتألق ذاتي.

  1. الطاقة على المسح الضوئي ليزر متحد البؤر المجهر مضان.
  2. الحصول على 15 صور للأورام المعالجة وغير المعالجة HerDox على عمق محدد ضمن النطاق الطيفي من 510-650 نانومتر، مع حجم خطوة من 10 نانومتر، والإثارة في 488 نانومتر باستخدام ضوء لايكا SPE المجهر متحد البؤر.
  3. يعد حل ميكرومتر 100 من دوكسوروبيسين.
  4. أداء التصوير الطيفي للميكرومتر حل 100 دوكسوروبيسين للحصول على البصمة الطيفية نقية من دوكس مضان (المدى الطيفي: 510-650 نانومتر، حجم الخطوة: 10 نانومتر). تآمر نتائج نموذجية من الحصول على الصور من التصوير الطيفي والناتجة الطيف مضان حيث يتم إظهارها على الرسم البياني في الشكل (4).
  5. الحصول على البصمة الطيفية تألق ذاتي من صورة جيوب (المدى الطيفي: 510-650 نانومتر، حجم الخطوة: 10 نانومتر) التي تم الحصول عليها عن طريق التصوير الطيفي للأورام غير المعالجة. تآمر نتائج نموذجية من الحصول على الصور من التصوير الطيفي والناتجة الطيف مضان حيث يتم إظهارها على الرسم البياني في الشكل 5.
  6. توليد أربعة طيفية المرجعية (تألق ذاتي محض، 0.1.doxorubin +0.9. تألق ذاتي، 0.2. دوكسوروبيسين +0.8. تألق ذاتي، 0.3.doxorubin +0.7. تألق ذاتي) باستخدام برنامج قمنا بتطوير 9. ويرد منحنى نموذجي تظهر أربعة طيفية إشارة في الشكل (6).
  7. أداء تصنيف الطيفية من الصور على النحو الذي حدده طيفية إشارة من خلال قياس المسافة الإقليدية باستخدام البرنامج الذي وضعت سابقا 9.
  8. أداء unmixing الطيفية خطي من تلك الصور باستخدام برنامج الطيفية unmixing (المكونات في في ImageJ) وضعنا 7، 10، للمقارنة إلى التصوير الطيفي ratiometric والتحليل. بريدويرد xample فصل مضان HerDox من تألق ذاتي من قبل unmixing الطيفية الخطي في الشكل 7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ويبين الشكل 1 في الجسم الحي النموذج تصوير الضوئي، التي بنيت لغرض الحصول على الصور تحت طرائق متعددة، بما في ذلك كثافة مضان، الطيفية، والعمر، 2 الفوتون، متحد البؤر داخل الحيوية، والتصوير تلألؤ بيولوجي. وبالإضافة إلى ذلك، فإن تبريد الكاميرا حساسية عالية وخطوط ليزر عالية الطاقة الواردة في هذا النظام عائدات أعلى الصور مضان النقيض بالمقارنة مع أنظمة التصوير الضوئي التجارية 11، وخاصة بالنسبة للفي الكشف عن الجسم الحي من دوكسوروبيسين مضان. وبالتالي، كان هذا النظام الهامة للاستخدام في هذه الدراسة للحصول على عدة نقاط البيانات التكميلية في تقييم HerDox في الجسم الحي.

مضان الورم عالية هو مبين في الشكل 2 هو نموذجي بعد الولادة النظامية من HerDox، ويدل على الاستهداف للورم تفضيلية. مضان الكشف عنها في الهيكل العظمي والعضلات هو شاذة وربما يؤدي جيئة وذهاباالشذوذ م في إجراء الحقن (أي عن طريق الحقن قريبة جدا من الجسم). نوعيا، الصورة التي تظهر في الشكل 2A لديه خلفية منخفضة. ومع ذلك، لإجراء التحليل الكمي للالنسبي شدة مضان الأنسجة، فمن الضروري إجراء تصحيح الخلفية باستخدام طبق فارغ، كما هو مبين في الشكل 2B. هذا يمكن أن يؤدي إلى "خلفية تصحيح" الصورة هو مبين في الشكل 2C الذي يحتوي على إشارة خلفية العالي في حافة الصورة مقارنة مع النسخة الأصلية (الشكل 2A) لأن الصورة الخلفية (الشكل 2B) لديه أقل شدة في حافة الصورة. وهكذا، في حين تصحيح الخلفية يمكن أن تسفر عن زيادة إشارة على حافة الصورة، وهذا هو خطوة ضرورية للتحليل الكمي لاحقة.

من أجل الحصول على تقييم كمي لتراكم HerDox في الأورام، تم الحصول على الصور مضان مبائر في مختلف التنسيقأعماق في الموقع تليها أقصى كثافة Z-الإسقاط من الصور (الشكل 3)، والاستحواذ على كثافة مضان يعني من الصورة المسقطة. الصورة الناتجة يحتوي على المعلومات تراكم HerDox أنحاء المشار Z-الأعماق في كل بكسل، وبالتالي فإن متوسط ​​كثافة مضان يعكس عموما تراكمات HerDox في الأورام على أعماق مختلفة كميا.

للتمييز HerDox مضان من تألق ذاتي في الأورام وتميز من الناحية الكمية وهما مع خصوصية عالية، والتصوير الطيفي ratiometric وتحليل أجري. ويوضح طيفية خالصة لدوكسوروبيسين وتألق ذاتي الحصول عليها عن طريق التصوير الطيفي في أرقام 4 و 5 على التوالي. تم إنشاؤها أيضا إشارة طيفية (الشكل 6) عن طريق خلط نسب مختلفة من طيفية النقي باستخدام برنامج قمنا بتطوير 9. كل refereNCE البصمة الطيفية هنا يمثل مضان النسبية للHerDox المتراكمة في الأورام فيما يتعلق تألق ذاتي. وأظهرت الصور تصنيف الطيفية (لم تظهر البيانات في هذه الورقة) أفضل تراكمات HerDox الكمي 7 مقارنة صورة غير مخلوط الطيفية التي تم الحصول عليها باستخدام نقية طيفية إشارة (الشكل 7). الأرقام 4-7 تمثل النتائج النموذجية عند تنفيذ التصوير الطيفي ratiometric والتحليل.

الشكل 1
الشكل 1. في تصوير الضوئي الجسم الحي. نظام التصوير الضوئي مع كثافة مضان، الطيفية، عمر مضان وقدرات التصوير متحد البؤر حيوي داخلي يجب أن تستخدم. يظهر نظام التصوير الضوئي المتعدد المستخدمة هنا، وكان describ إد سابقا 8. تقديم صورة بإذن نوع من سبرينغر العلوم والأعمال وسائل الإعلام BV: هوانج، JY، وآخرون، وزارة العمل. بيول. التصوير، 14، 431-42 (2012).

الشكل 2
الشكل 2. ممثل الصور كثافة مضان من الأعضاء الداخلية والأورام المستخرجة من ماوس تلقي HerDox. كانت تحصد الأنسجة والأورام من الفئران الموت الرحيم في 24 ساعة بعد (يوم 7) حقن النهائي من HerDox الصور كثافة مضان قبل وبعد تصحيح الخلفية (ب) يتم تمثيل (أ) و (ج)، على التوالي. انقر هنا لعرض أكبر الرقم .

FO: المحافظة على together.within الصفحات = "دائما"> الشكل (3)
الشكل (3). كثافة أقصى Z-الإسقاط من الصور التي تم الحصول عليها في متسلسلة Z-الأعماق. الصور مكدسة الموضح على اليمين هي ممثل للمتحد البؤر المسح الضوئي من أنسجة الورم التي تم الحصول عليها في أعماق متتابعة 1 ميكرون. الصورة في اليمين يظهر تجميع الصور مكدسة على اليسار.

الشكل 4
الشكل 4. الاستحواذ على البصمة الطيفية النقي لدوكسوروبيسين. بعد تم الحصول على الصور من حل دوكسوروبيسين في موجات متتابعة ضمن 510-650 نانومتر، مع حجم خطوة من 10 نانومتر (يسار)، والبصمة الطيفية النقي لتم الحصول دوكسوروبيسين باستخدام برنامج وضعنا. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الرقم 5
الشكل 5. الاستحواذ على البصمة الطيفية للتألق ذاتي محض. بعد تم الحصول على الصور من دون علاج ورم في موجات متتابعة ضمن 510-650 نانومتر، مع حجم خطوة من 10 نانومتر (يسار)، تم الحصول على توقيع الطيفي النقي لتألق ذاتي باستخدام برنامج ضعنا. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

load/50396/50396fig6.jpg "/>
الشكل (6). أربعة طيفية إشارة للتصوير الطيفي ratiometric والتحليل. تم إنشاء طيفية إشارة عن طريق خلط طيفية النقي باستخدام برنامج ضعنا. خط الصلبة خضراء اللون يمثل تألق ذاتي محض، خط الصلبة ذات اللون الأحمر يمثل 0.1.doxorubin +0.9. تألق ذاتي، خط صلبة زرقاء اللون يمثل 0.2. دوكسوروبيسين +0.8. تألق ذاتي، والخط الصلبة سماوي اللون 0.3.doxorubin +0.7. تألق ذاتي، على التوالي. ويرد الرقم من عمل المؤلفين السابقة: هوانج، JY، وآخرون، بلوس واحد 7 (4)، (2012)..

الرقم 7
الرقم 7. HerDox مضان في الأنسجة قبل وبعد الطيفية للامم المتحدة لخلط. بعد الحصول على بصمات طيفية دوكس وتألق ذاتي، اليتم فصل الإشارات الإلكترونية دوكس باستخدام خطي الطيفية للامم المتحدة لخلط 12،13. يوضح الشكل صورة مختلطة تألق ذاتي وHerDox قبل الطيفية للامم المتحدة لخلط وصورة HerDox انفصلا بعد الطيفية للامم المتحدة لخلط.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

دوكس مضان يمكن كشفها في الجسم الحي باستخدام تصوير المتعدد عندما الأورام تحت الجلد. ومع ذلك، فإن جرعة علاجية فعالة من HerDox (0.004 ملغ / كلغ) تحت عتبة الكشف بعد جرعة واحدة. في المقابل، بعد 7 حقن يومية (1x/day لمدة 7 أيام)، وتراكم الورم والإبقاء على الجسيمات كافية لتمكين التصور من دوكس مضان.

فمن الأهمية بمكان عند العمل مع دوكس أو أي fluorophore أخرى لفي الجسم الحي التصوير التي تستخدم تقنية نظيفة. وينبغي تجنب يقطر على الجزء الخارجي من الماوس، مثل تصوير سيتم الكشف عن مضان على السطح الخارجي للجلد دون تمييز ما إذا كان دوكس هو خارجي أو داخلي. وبالمثل، يمكن أن تلوث دوكس على قفازات ترك علامات الفلورسنت على السطح الخارجي للفأرة أثناء التعامل مع الحيوانات، والتسبب بالتالي الكشف عن مضان الخاطئة.

في النظام البصري المتعدد، وهوويستخدم شعاع الليزر لإثارة HerDox. شعاع الليزر لديه عادة الشخصي جاوس. وبالتالي، لإثارة موحدة من العينات من الفائدة، وتستخدم الناشرون البصرية. ومع ذلك، وعلى ضوء الليزر منتشر إلى حد ما يحافظ على لمحة شعاع جاوس. وهكذا، على التحليل الكمي المثالي، يجب إجراء تصحيح الخلفية. الصور-تصحيحها قبل والخلفية وعادة ما يكون على عمق 16 بت. لذلك، قبل إجراء تصحيح الخلفية، ينبغي تحويل عمق الصورة إلى 32 بت من أجل تجنب الأخطاء غير المرغوب فيها من التناقض بين عمق الصورة الصور الناتجة والمدخلات.

في اكتساب صورة خلفية، ورقة سوداء (Artagain) وضعت سابقا على صفيحة التصوير من أجل منع انعكاسات الإضاءة قبل تنفيذ التصوير مضان. ومع ذلك، لأن الكاميرا هي حساسة للغاية، تم الكشف عن إشارات خلفية منخفضة من الورق الأسود بواسطة الكاميرا. ولذلك، فإن الخلفيةجاء إشارات هو مبين في الشكل 2 من ورقة سوداء بدلا من من بيتري طبق فارغ.

وقد استخدمت تركيزات عالية من حل دوكسوروبيسين للحصول على بصمات طيفية نقية بدقة عالية. درسنا كذلك إلى قرارات الطيفية التي نظام قادر على الكشف عن مضان ما يكفي من العينة لإنتاج طيفية يمكن الاعتماد عليها. ونتيجة لذلك، تم ضبطها القرار الطيفية إلى 10 نانومتر. هنا وجدنا أن المجهر تحت الإعداد من قرارات الطيفية أعلى (<10 نانومتر) لا يمكن الكشف عن مضان كافية لانتاج طيفية يمكن الاعتماد عليها. مع طيفية خالصة، ونحن يمكن أن تولد عدة طيفية ratiometric (الشكل 6). على وجه الخصوص، ونحن يمكن أن يميز الإشارات كميا مضان HerDox من تألق ذاتي من قبل طيفية ratiometric منها 7. الصورة غير مخلوطة الطيفية التي تم الحصول عليها مع البصمة الطيفية نقيةق (الشكل 7) كانت مشابهة للصورة المصنفة من قبل اثنين من التواقيع الطيفية المرجعية (الزرقاء:. 0.2.Dox +0.8 Autofl والأخضر:. Autofl). وإجمالا، قدمت متحد البؤر / الطيفية التصوير ratiometric المزيد من المعلومات الكمية على تراكم HerDox في الخلايا السرطانية في الموقع مع ارتفاع القرار، وبالتالي التحقق من فائدته في تحليل الجسيمات النانوية تسليمها الى HER2 + الأورام.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

المؤلف، دانيال فاركاس، هو رئيس مجلس إدارة التصوير الجزيئي الطيفي. الكتاب المتبقية ليس لها المصالح المتنافسة.

Acknowledgments

وقد تم تمويل هذا العمل من المنح المقدمة إلى LKM-K من المعاهد الوطنية للصحة / المعهد الوطني للسرطان (R01CA129822 وR01CA140995). د. المدينة المنورة، وذلك بفضل C. Kauwe ري، M. M-Kauwe وD. Revetto لاستمرار الدعم.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fluorescence laser scanning confocal microscope Leica SPE
In Vivo Optical Imager Spectral Molecular Imaging Multimode In Vivo Optical Imager
Doxorubicin-HCl Sigma-Aldrich D4035
Nude (NU/NU) mouse, female, 6-8 week Charles River Strain code 088
MDA-MB-435 human HER2+ tumor cells NCI-Frederick Cancer DCTD Tumor/Cell Line Repository 0507292
3/10 cc insulin syringe U-100 with 29G x 1/2" Ultra-FineIV permanently attached needle BD 309301
Delta T chamber Bioptechs 04200417B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Agadjanian, H., Chu, D., et al. Chemotherapy Targeting by DNA Capture in Viral Protein Particles. Nanomedicine. 7, (3), 335-352 (2012).
  2. Agadjanian, H., Ma, J., et al. Tumor detection and elimination by a targeted gallium corrole. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, (15), 6105-6110 (2009).
  3. Agadjanian, H., Weaver, J. J., et al. Specific delivery of corroles to cells via noncovalent conjugates with viral proteins. Pharm. Res. 23, (2), 367-377 (2006).
  4. Medina-Kauwe, L. K., Maguire, M., et al. Non-viral gene delivery to human breast cancer cells by targeted Ad5 penton proteins. Gene Therapy. 81753-81761 (2001).
  5. Medina-Kauwe, L. K., Kasahara, N., et al. 3PO, a novel non-viral gene delivery system using engineered Ad5 penton proteins. Gene Therapy. 8795-8803 (2001).
  6. Rentsendorj, A., Xie, J., et al. Typical and atypical trafficking pathways of Ad5 penton base recombinant protein: implications for gene transfer. Gene Ther. 13, (10), 821-836 (2006).
  7. Hwang, J. Y., Park, J., et al. Multimodality Imaging In vivo for Preclinical Assessment of Tumor-Targeted Doxorubicin Nanoparticles. PLoS ONE. 7, (4), e34463 (2012).
  8. Hwang, J. Y., Wachsmann-Hogiu, S., et al. A Multimode Optical Imaging System for Preclinical Applications In Vivo: Technology Development, Multiscale Imaging, and Chemotherapy Assessment. Mol. Imaging Biol. (2011).
  9. Hwang, J. Y., Gross, Z., et al. Ratiometric spectral imaging for fast tumor detection and chemotherapy monitoring in vivo. J. Biomed. Opt. 16, (6), 066007 (2011).
  10. Fujimoto, J. G., Farkas, D. L. Biomedical Optical Imaging. Oxford University Press. New York. (2009).
  11. Hwang, J. Y., Moffatt-Blue, C., et al. Multimode optical imaging of small animals: development and applications. Proc. of SPIE. 6411, (2007).
  12. Ducros, M., Moreaux, L., et al. Spectral unmixing: analysis of performance in the olfactory bulb in vivo. PLoS One. 4, (2), e4418 (2009).
  13. Zimmermann, T. Spectral imaging and linear unmixing in light microscopy. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 95245-95265 (2005).
تحليل المستهدفة البروتين الفيروسي النانوية يسلم إلى HER2 + أورام
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hwang, J. Y., Farkas, D. L., Medina-Kauwe, L. K. Analysis of Targeted Viral Protein Nanoparticles Delivered to HER2+ Tumors. J. Vis. Exp. (76), e50396, doi:10.3791/50396 (2013).More

Hwang, J. Y., Farkas, D. L., Medina-Kauwe, L. K. Analysis of Targeted Viral Protein Nanoparticles Delivered to HER2+ Tumors. J. Vis. Exp. (76), e50396, doi:10.3791/50396 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter