Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

ניתוח של חלבון נגיפי ממוקד חלקיקים מובא לHER2 + גידולים

doi: 10.3791/50396 Published: June 18, 2013

Summary

מאמר זה מפרט את הנהלים לניתוח הדמיה אופטי של nanoparticle גידול הממוקד, HerDox. בפרט, שימוש מפורט של מכשיר ההדמיה multimode לאיתור גידול מיקוד והערכת חדירת גידול מתואר כאן.

Abstract

Nanoparticle HER2 + גידול הממוקד, HerDox, מציג הצטברות גידול מועדפת ואבלציה גידול בצמיחה במודל חיה של סרטן HER2 +. HerDox נוצר על ידי הרכבה עצמית שאינם קוולנטיים של חלבון חדירת תאי גידול ממוקד עם סוכן כימותרפיה, דוקסורוביצין, באמצעות מקשר חומצות גרעין קטן. שילוב של electrophilic, עיבור, ואינטראקציות oligomerization להקל על הרכבה עצמית לחלקיקי ננומטר 10-20 עגולים. HerDox מציג יציבות בדם, כמו גם באחסון ממושך בטמפרטורות שונות. משלוח מערכתי של HerDox בתוצאות נושאות גידולים בעכברים במוות תאי גידול ללא תופעות לוואי לגילוי לרקמה שאינה סרטנית, כוללים לב והכבד (שעובר נזק מסומן על ידי דוקסורוביצין לא ממוקד). HER2 גובה מאפשר מיקוד לתאים המבטא את הקולטן לגורם הגדילה באפידרמיס האנושי, ומכאן גידולים HER2 רמות גבוהות מוצגות תערוכת הצטברות גדולה יותר של HerDox לעומת ביטויי תאיםלשיר רמות נמוכות יותר, הן במבחנה ובחי. הדמיה עוצמת הקרינה בשילוב עם ניתוח ספקטרלי confocal ואתרו אפשרה לנו לאמת בגידול vivo מיקוד וחדירה של תאי גידול של HerDox לאחר משלוח מערכתי. כאן אנו פירוט השיטות להערכתנו גידול מיקוד באמצעות ההדמיה multimode לאחר משלוח מערכתי.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

גידול במיקוד של כימותרפיה יש את הפוטנציאל לחסל את התאים סרטניים במינון נמוך יותר בהשוואה לתרופות לא ממוקדות, כי יותר מהטיפול יכול לצבור נמסר ליעד, ולא להפיץ לרקמה שאינה סרטנית. ככל שהמצב זה האחרון הייתי לדלל את היעילות של התרופה ולכן דורש מינונים גבוהים יותר כדי להיות יעילים, מיקוד גידול יש שני יתרונות טיפוליים ובטיחות מעל טיפול שאינו ממוקד סטנדרטי.

מיקוד כימותרפיה ידי אנקפסולציה בחלקיקים עצמי התאספו מאפשר התרופה להישאר ללא שינוי כימי בניגוד לתרופות שמקושרות קוולנטית למולקולות מיקוד. כהצמדה כזו יש הפוטנציאל לשנות את הפעילות של שניהם בסמים ומיקוד המולקולה; הרכבה שאינה קוולנטיים מאפשרת עוצמה תרופה להישמר.

הראינו בעבר שהרומן של שלוש מרכיב, מורכב עצמי התאספו, HerDox, מטרות HER2 + גידולים 1. HerDox נוצר דרך אינטראקציות שאינן קוולנטיים בין חלבון קולט מחייב תא החדירה, HerPBK10, והסוכן כימותרפיות, דוקסורוביצין (DOX), באמצעות מקשר חומצות גרעין קטן. HerPBK10 נקשר לקולטן גורם האנושי צמיחת אפידרמיס (שלה) ומעורר אנדוציטוזה קולטן בתיווך 2-4, תוך חדירת קרום endosomal נעשה באמצעות שילוב של אדנווירוס-נגזר פנטון בסיס חלבון capsid 4-6. תחום טעון חיובי בחלבון מאפשר לחומצת גרעין 4 מחייב, 5, שדרכו Dox-DNA intercalated יכול להיות מועבר למשלוח ממוקד. Electrophilic, עיבור, ואולי אינטראקציות oligomerization חלבון להקל על הרכבה עצמית לחלקיקי ננומטר 10-20 עגולים כי הם יציבים בדם ומתחת לאחסון ממושך בטמפרטורות שונות 1. העדפת מיקוד אליה2 + תאים סרטניים הוא הקל על ידי זיקת יגנד המשופרת כאשר HER2 הוא גבוה.

המחקרים הקודמים שלנו הראו כי המשלוח מערכתי של הצטברות מועדפת HerDox תשואות בגידולים מעל הרקמה שאינה סרטנית ולא ממוקדים, בהשוואה ל1 Dox, וחדירה לתאי גידול in vivo 7. יש לנו ציינו שמשחרר HerDox Dox לאחר כניסת תא גידול, ומאפשר הצטברות Dox לתוך הגרעין 1. גידולים הצטברות מופיעה לתאם עם רמת הקולטן, כמו גידולים המבטאים-HER2 נמוכים יחסית לצבור פחות HerDox בהשוואה לאלו עם רמות גבוהות יותר יחסית 1 HER2. יתר על כן, ריכוז המוות של התאים היעיל מציג מתאם הפוך עם HER2 תצוגה בשורות תאים סרטניים המבטאות תא שטח שונה HER2 רמות 1. HerDox מפגין יתרון טיפולי ובטיחות מעל Dox לא ממוקד, לא כהריגת גידול מתרחשת במינון מעל 10 פעמים נמוכות יותר בהשוואה לuntarסמים וgeted מניב שום השפעה לרעה על גילוי לב (אקו וזוהה על ידי כתם היסטולוגית) או כבד (זוהה על ידי Tunel כתם) רקמה, בניגוד לDox לא ממוקד 1. למרות גזירתו מחלבון הקופסית נגיפית, HerPBK10 מפגין שום immunogenicity להבחין ברמות טיפוליות 2. ואילו נוגדנים קיימים מראש לכל אדנווירוס יכולים לזהות HerPBK10, הם לא הצליחו למנוע תא מחייב 2.

נפח גידול נמדד לאורך הזמן הוא שיטה סטנדרטית של הערכת יעילות טיפולית של תרופות ממוקדות, וכבר מועסק להערכת היעילות הטיפולית של HerDox. להשלים עם גישה זו in vivo ההדמיה עוצמת הקרינה vivo לשעבר אפשר לנו להעריך טוב יותר את יעילות מיקוד 7. יש לנו משולב באופן ספציפי בתחום ההדמיה confocal באתרו של גידולים ניכרים עם ניתוח ספקטרלי של Dox הקרינה כדי לוודא שאין HerDoxלא נצבר רק בגידולי in vivo אבל חדרו לתוך תאים סרטניים וDOX מועבר לתוך הציטופלסמה לבין הגרעין 7. ניתוח ספקטרלי כמו כן אפשר לנו להבחין בין הקרינה Dox מautofluorescence 7.

כאן אנו מדגימים בפירוט רב יותר את הגישה שלנו להערכת HerDox in vivo לאחר משלוח מערכתי, והכי חשוב, להערכת מיקוד באמצעות שיטות הדמיה multimode וניתוחים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. משלוח מערכתי בvivo

  1. מערבבים מספיק HerDox עם תמיסת מלח סטרילית להשוות 0.2 מ"ל של מינון מ"ג / ק"ג 0.004 של HerDox לכל זריקה למשך 6-8 גידולים בשבוע ישנים נו / נו עכברי נושאים הבילטראליים תת עורי כנף עוקץ xenograft.
  2. לצייר בעדינות את תערובת HerDox לתוך מזרק אינסולין 3/10 סמ"ק המצויד במחט 29G, הימנעות בועות.
  3. הרדמה היא מושרה על ידי חשיפת isoflurane קצרה בחדר אינדוקציה מצויד בהדחת מערכת גז (ספיקות חמצן:, ריכוז 0.5-1 ליטר / דקה isoflurane: 3-4% (או נמוך יותר).
  4. הזרק את התערובת כולה לוריד הזנב של עכבר הרדים (0.2 מ"ל להזרקה). הזרקת IV יכולה גם להתבצע בעכבר מאופק, ללא הרדמה.
  5. חזור על זריקות באותו העכבר במשך שישה ימים רצופים נוספים, פעם ביום.

2. דימות פלואורסצנטי בvivo

ההצטברות של HerDox הקרינה בגידולים יכוליםלהתגלות על ידי ביום האחרון של זריקה (יום 7) באמצעות imager multimode. ההליכים המפורטים להלן כרוכים בשימוש במערכת המאקרו תאורה וזיהוי מותאמת אישית (איור 1) 8.

  1. הפעל Multimode בImager האופטי vivo.
  2. בחר פליטת bandpass מסנן (590 ננומטר ± 30 ננומטר) מתאימה לגילוי הקרינה דוקסורוביצין.
  3. הפעל ריתוך ארגון קריפטון לייזר ולמקם את מסנן bandpass עירור (488 ננומטר ± 10 ננומטר) בנתיב האופטי לייזר.
  4. הפעל את מערכת ההרדמה ולאחר מכן למקם את עכבר לתוך תא ההרדמה (ספיקות חמצן:, ריכוז 0.5-1 ליטר / דקה isoflurane: 3-4% (או נמוך) מצוידות במערכת הדחה גז.
  5. העבר את העכבר מחדר ההרדמה לחדר ההדמיה של Multimode בImager האופטי vivo כאשר העכבר הוא מורדם.
  6. הנח nosecone מעל האף של העכבר ולפתוח את הזרימה לנהל anesthe הרציףSIA במהלך רכישת תמונה (שיעורי זרימת חמצן: 0.5-1 ליטר / דקה, ריכוז isoflurane: 2-3% (או נמוכים יותר).
  7. לרכוש תמונות הקרינה באמצעות זמן חשיפה של 5-15 שניות.
  8. ביצוע ניתוח ועיבוד תמונה כולל תיקון רקע או התאמת ניגוד.

3. דימות פלואורסצנטי Ex vivo

ניתן הדמיה HerDox הקרינה בגידולים ואיברים ספציפיים (כולל כבד, כליות, טחול, לב, ושרירי שלד) נבצרו מעכברים מורדמים ב24 שעות לאחר ההזרקה (יום 7) הסופית של HerDox.

  1. הפעל Multimode בImager האופטי vivo.
  2. בחר פליטת bandpass מסנן (580 ננומטר ± 20 ננומטר) לגילוי הקרינה דוקסורוביצין.
  3. הפעל ריתוך ארגון קריפטון לייזר ולמקם את מסנן bandpass עירור (488 ננומטר ± 10 ננומטר) בנתיב האופטי לייזר.
  4. גידולי מקום ואיברים ספציפיים מסודרים על צלחת פטרי להדמיה הקאמרית OF Multimode בImager האופטי vivo.
  5. לרכוש תמונות הקרינה של רקמות באמצעות זמן חשיפה של 5-15 שניות. דוגמה לרכישת תמונת הקרינה ראשונית שמוצגת באיור 2 א. חזור על אותו באמצעות צלחת פטרי ריקה, שישמש כרקע (איור 2b).
  6. ביצוע ניתוח ועיבוד תמונה כולל תיקון רקע או התאמת ניגוד. דוגמה לתמונה תיקן מוצגת באיור 2 ג, וכתוצאה מחיסור של איור 2b מהאיור 2a.

4. בConfocal ההדמיה באתרו של גידולים

בהדמית confocal אתר מאפשר זיהוי וניתוח של הצטברות גידול HerDox ברמה התאית.

  1. הפעל מיקרוסקופ לייקה confocal SPE.
  2. בחר אור לייזר ננומטר 488 לעירור של אורכי גל דוקסורוביצין ופליטה (560-620 ננומטר) לדוקסורוביציןגילוי הקרינה.
  3. בחר אובייקטיבי 40X או 63X וטיפת שמן טבילה בעדשה האובייקטיבית.
  4. לחלץ גידולים טריים מעכברים שקיבלו בעבר מורדמים טיפולי HerDox ומדומים, כמתואר בהליך 2.
  5. גידולים מניחים על צלחת פטרי על קרח, כדי למנוע השפלה רקמות, ולאחר מכן להעביר את הגידולים לתא דלתא T להדמית confocal.
  6. לרכוש תמונות confocal של גידולים בעומקי מוקדים רציפים (גודל צעד: 1 מיקרומטר, עובי: 20 מיקרומטר). דוגמה של רצף תמונות-נרכשו לאורך ציר Z-מוצגת באיור 3, פנל שמאלי.
  7. בצע העצמה מקסימלית Z-הקרנה של תמונות. הקרנת העצמה המרבית של Z-מוערם תמונות מוצגת באיור 3, פנל ימני.
  8. חישוב מתכוון עוצמות הקרינה של העצמה מקסימלית Z - הקרנת תמונות. ממוצעת עוצמות הקרינה של תמונות מעל השדה הכללי של תצוגה היו לחשבד באמצעות ImageJ.

5. דימות ספקטרלי רציומטרי וניתוח

הדמיה רפאים רציומטרי וניתוח מאפשר אפליה בין Dox הקרינה וautofluorescence.

  1. כוח בסריקת לייזר מיקרוסקופ confocal פלואורסצנטי.
  2. תרכוש 15 תמונות של גידולי HerDox שטופלו ומטופל בעומק שצוין בטווח של 510-650 הרפאים ננומטר, עם גודל צעד של 10 ננומטר, ועירור ב 488 ננומטר אור באמצעות מיקרוסקופ confocal לייקה SPE.
  3. הכן פתרון מיקרומטר 100 של דוקסורוביצין.
  4. לבצע הדמיה רפאים של פתרון דוקסורוביצין מיקרומטר 100 כדי להשיג את החתימה הספקטרלית הטהורה של Dox הקרינה (טווח ספקטרום: 510-650 ננומטר, גודל צעד: 10 ננומטר). תוצאות אופייניות של רכישת תמונה מהדמית רפאים וכתוצאה מספקטרום הקרינה זממו כמו גרף מוצגים באיור 4.
  5. לרכוש את החתימה הספקטרלית autofluorescence מג תמונהאופה (טווח ספקטרום: 510-650 ננומטר, גודל צעד: 10 ננומטר) שהושגה על ידי הדמיה רפאים של גידולים שלא טופלו. תוצאות אופייניות של רכישת תמונה מהדמית רפאים וכתוצאה מספקטרום הקרינה זממו כמו גרף מוצגים באיור 5.
  6. לייצר ארבע חתימות רפאים התייחסות (autofluorescence הטהור, 0.1.doxorubin 0.9. Autofluorescence, 0.2. דוקסורוביצין 0.8. Autofluorescence, 0.3.doxorubin 0.7. Autofluorescence) באמצעות התכנית שפיתחנו 9. עקומה טיפוסית מראה ארבע חתימות רפאים התייחסות מוצגת באיור 6.
  7. לבצע סיווג ספקטרלי של תמונות כפי שהוגדר על ידי החתימה ספקטראלית התייחסות דרך למדוד מרחק אוקלידי באמצעות התכנית שפיתחנו בעבר 9.
  8. בצע unmixing רפאים ליניארית של דימויים אלה באמצעות תכנית רפאים unmixing (Plug-in בImageJ) פיתחנו 7, 10, לשם השוואה להדמית הרפאים ratiometric והניתוח. דוארxample של הפרדת הקרינה HerDox מautofluorescence ידי unmixing הרפאים יניארי מוצג באיור 7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

איור 1 מציג את אב טיפוס בimager האופטי vivo, שנבנה לצורך רכישת תמונה תחת שיטות מרובות, כולל עוצמת הקרינה, רפאים, כל החיים, confocal 2 פוטונים, התוך חיוני, והדמיה פליטת אור. בנוסף, המצלמה מקוררת גבוהה רגישה וקווי לייזר בהספק גבוהים שולבו במערכת זו תשואות גבוהות יותר בהשוואה תמונות הקרינה בניגוד למערכות הדמיה אופטיות מסחריות 11, במיוחד עבור באיתור vivo של הקרינה דוקסורוביצין. לפיכך, מערכת זו הייתה קריטית לשימוש במחקר הנוכחי כדי לרכוש נקודות נתונים משלימות מרובות בהערכת HerDox in vivo.

הקרינה הגבוהה הגידול שמוצגת באיור 2 היא טיפוסית לאחר לידה מערכתית של HerDox, ומעיד על מיקוד גידול המועדף שלה. הקרינה התגלתה בשרירי השלד היא לא טיפוסית ועלולה לגרום לכאן ולכאןחריגות מ 'בהליך ההזרקה (כלומר הזרקה קרובה מדי לגוף). איכותי, יש לו את התמונה שמוצגת באיור 2a רקע נמוך. עם זאת, כדי לבצע ניתוח כמותי של עוצמות הקרינה הרקמות היחסיות, יש צורך לבצע תיקון רקע באמצעות צלחת ריקה, כפי שמוצג באיור 2b. זה יכול לגרום "רקע תיקן" תמונה שמוצגת באיור 2 ג שיש לו אות רקע גבוהה יותר בקצה של התמונה בהשוואה למקורית (איור 2 א) משום שתמונת הרקע (איור 2b) יש עוצמות נמוכות יותר בקצה תמונה. וכך, בעוד תיקון רקע יכול להניב עליית אות בקצה התמונה, זה הוא צעד הכרחי לניתוח כמותי שלאחר מכן.

על מנת לקבל הערכה כמותית של הצטברות HerDox בגידולים, תמונות הקרינה confocal התקבלו במוקדים שוניםעומק באתר ואחריו בעוצמה המרבית Z-הקרנה של תמונות (איור 3), ורכישה של עוצמת הקרינה הממוצעת של התמונה המוקרנת. התמונה שתתקבל מכילה את המידע על הצטברות HerDox המעמקים-z המצוינים בכל פיקסל, ולכן הממוצע של עוצמות הקרינה משקף כולל הצטברויות HerDox בגידולים בעומקים שונים כמותית.

כדי להבחין בין הקרינה HerDox מautofluorescence בגידולים וכמותית להפלות שתיים עם סגוליות גבוהות, הדמיה רפאים ratiometric וניתוח בוצע. החתימות ספקטרליות הטהורות לדוקסורוביצין וautofluorescence מתקבל על ידי הדמיה רפאים מומחשות באיורים 4 ו -5, בהתאמה. חתימה ספקטראלית התייחסות (איור 6) נוצרו גם על ידי ערבוב יחסים של חתימה ספקטראלית הטהורה באמצעות התכנית שפיתחנו 9 שונים. כל refereNCE חתימה הספקטרלית כאן מייצגת הקרינה היחסית של HerDox הצטברו בגידולים ביחס לautofluorescence. את תמונות סיווג ספקטרלי (הנתונים לא הוצגו במאמר זה) הראו הצטברויות HerDox כמותיים טובות יותר 7 בהשוואה לתמונה הצרופה הרפאים מתקבלות על ידי שימוש בחתימה ספקטראלית התייחסות הטהורה (איור 7). איורים 4-7 לייצג ממצאים אופייניים בעת ביצוע הדמיה רפאים ratiometric וניתוח.

איור 1
איור 1. בimager האופטי vivo. יש להשתמש במערכת הדמיה אופטית עם עוצמת הקרינה, חיים רפאים, הקרינה ויכולות הדמיה confocal intravital. מערכת ההדמיה האופטית multimode משמשת כאן מוצגת, וכבר describ אד בעבר 8. תמונה מסופקת עם אישור סוג של עסקי מדיה BV פרינגר מדע ו: הוואנג, JY, et al, מול.. ההדמיה Biol., 14, 431-42 (2012).

איור 2
איור 2. תמונות עוצמת הקרינה נציג של איברים פנימיים וגידולים שחולצו מעכבר קבלת HerDox. רקמות וגידולים נבצרו מעכברים מורדמים ב24 שעות לאחר ההזרקה (יום 7) הסופית של תמונות עוצמת הקרינה HerDox לפני ואחרי תיקון הרקע (ב) מיוצגים על ידי (א) ו (ג), בהתאמה. לחצו כאן לצפייה גדולה יותר להבין.

עבור: לשמור-together.within עמודים = "תמיד"> איור 3
איור 3. העצמה המקסימלית Z-הקרנה של תמונות המתקבלות בz-מעמקים רציפים. את התמונות שנערמו מוצגות בפינה השמאלית מייצגות את סריקות confocal של רקמת גידול שהושג בעומקי 1 מיקרומטר רציפים. התמונה בפינה הימנית מציגה את האוסף של התמונות שנערמה בצד השמאל.

איור 4
איור 4. רכישת חתימה הספקטרלית טהורה לדוקסורוביצין. לאחר את התמונות של פתרון דוקסורוביצין התקבלו באורכי גל רציפים בתוך 510-650 ננומטר, בצעד בגודל של 10 ננומטר (משמאל), החתימה הספקטרלית הטהורה לדוקסורוביצין הושג שימוש בתכנית שפיתחנו. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 5
איור 5. רכישת חתימה הספקטרלית טהורה לautofluorescence. לאחר שהתמונות של גידול לא טופל התקבלו באורכי גל רציפים בתוך 510-650 ננומטר, בצעד בגודל של 10 ננומטר (משמאל), החתימה הספקטרלית הטהורה לautofluorescence הושגה באמצעות התכנית שפיתחנו. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

load/50396/50396fig6.jpg "/>
איור 6. ארבע חתימות רפאים התייחסות להדמית רפאים ratiometric וניתוח. החתימות ספקטרליות התייחסות נוצרו על ידי ערבוב את החתימה ספקטראלית הטהורה באמצעות התכנית שפיתחנו. הקו המוצק בצבע ירוק מייצג autofluorescence הטהור, הקו המוצק בצבע אדום מייצג 0.1.doxorubin 0.9. Autofluorescence, הקו המוצק בצבע כחול מייצג 0.2. דוקסורוביצין 0.8. autofluorescence, והקו המוצק בצבע ציאן 0.3.doxorubin 0.7. autofluorescence, בהתאמה. איור הוא לשכפל משל המחברים עבודה הקודמת: הוואנג, JY, et al, PLoS ONE 7 (4), (2012)...

איור 7
איור 7. הקרינה ברקמות HerDox לפני ואחרי ערבוב בלתי רפאים. לאחר קבלת החתימות ספקטרליות של Dox וautofluorescence, האותות DOX דואר מופרדים באמצעות 12,13 ערבוב בלתי רפאים ליניארי. האיור מציג את התמונה המעורבת autofluorescence וHerDox לפני ערבוב בלתי רפאים ותמונת HerDox נפרדה לאחר ערבוב בלתי רפאים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

DOX הקרינה ניתן להבחין בvivo באמצעות imager multimode כאשר גידולים תת עורית. עם זאת, המינון טיפולי היעיל של HerDox (0.004 מ"ג / ק"ג) הוא מתחת לסף הגילוי לאחר מנה אחת. לעומת זאת, לאחר 7 זריקות יומיות (1x/day למשך 7 ימים), הצטברות הגידול והשימור של החלקיקים מספיק כדי לאפשר הדמיה של הקרינה Dox.

זה קריטי כשעובדים עם Dox או כל fluorophore אחר בתחום ההדמיה vivo כי הוא השתמש בטכניקה נקיות. מטפטף על החלק החיצוני של העכבר יש להימנע, כimager יזהה את הקרינה בצד החיצוני של העור מבלי להפלות בין אם Dox הוא חיצוני או פנימי. באופן דומה, זיהום Dox את הכפפות יכול להשאיר סימני ניאון בצד החיצוני של העכבר במהלך טיפול בבעלי חיים, ובכך גורם לזיהוי הקרינה שגוי.

במערכת האופטית אופניים,קרן לייזר היא מנוצל לעירור של HerDox. יש קרן לייזר בדרך כלל פרופיל גאוס. לפיכך, לעירור אחיד של דגימות של עניין, מפזרים אופטיים מנוצלים. יחד עם זאת, אור לייזר המפוזר במקצת משמר פרופיל קרן גאוס. לפיכך, לניתוח כמות אידיאלי, יש לבצע תיקון רקע. את התמונות לפני שתקנו ורקע יש בדרך כלל לעומק של 16 סיביות. לכן, לפני שהתיקון מתבצע הרקע, עומק התמונה צריך להיות מומר ל32 סיביות על מנת להימנע משגיאות לא רצויות מהפער בין עומק תמונת תמונות תוצאתי וקלט.

ברכישה של תמונת רקע, נייר שחור (Artagain) הושם בעבר על צלחת הדמיה על מנת למנוע השתקפויות תאורה לפני ביצוע דימות פלואורסצנטי. עם זאת, מאחר שהמצלמה היא רגישה מאוד, אותות רקע נמוכים מנייר השחור התגלו על ידי המצלמה. לכן, על הרקעאותות שמוצגים באיור 2 באו מנייר השחור ולא מצלחת פטרי ריקה.

ריכוז גבוה של פתרון דוקסורוביצין נוצל כדי להשיג חתימה ספקטראלית טהורה ברמת דיוק גבוהה. אנחנו עוד בחן החלטות רפאים שבמערכת מסוגלת לזהות מספיק הקרינה מהדגימה לייצר חתימה ספקטראלית אמינות. כתוצאה מכך, ברזולוציה ספקטרלית הייתה מכוונת ל10 ננומטר. כאן מצאנו כי מיקרוסקופ תחת ההגדרה של החלטות רפאים גבוהות יותר (<10 ננומטר) אינו יכול לזהות הקרינה מספיק כדי להניב חתימה ספקטראלית אמינות. עם חתימה ספקטראלית הטהורה, אנחנו יכולים ליצור כמה חתימות רפאים ratiometric (איור 6). בפרט, אנו יכולים להבחין כמותית אותות הקרינה HerDox מautofluorescence על ידי החתימה ספקטראלית ratiometric בהתאמה 7. התמונה הצרופה הרפאים שהושגה עם החתימה הספקטרלית הטהורהים (איור 7) היה דומה לתמונה שסווגה על ידי שתי חתימות הרפאים התייחסות (הכחולים:. 0.2.Dox 0.8 Autofl וירוק:.. Autofl). בסך הכל, ההדמיה confocal / רפאים ratiometric סיפק מידע כמותי נוסף על הצטברות HerDox בתאים סרטניים באתרו עם רזולוציה גבוהה, ובכך לאמת את השימושיות שלה בניתוח של חלקיקים נמסרו HER2 + גידולים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחבר, דניאל פרקש, הוא יו"ר של הדמיה מולקולרית ספקטרלי. יש החוקרים שנותרו ללא אינטרסים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו מומנה על ידי מענקים לLKM-K מהמוסד הלאומי לבריאות / מכון הלאומי לסרטן (R01CA129822 וR01CA140995). ד"ר מדינה-Kauwe מודה ג ריי, מ 'M-Kauwe וד Revetto להמשך תמיכה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fluorescence laser scanning confocal microscope Leica SPE
In Vivo Optical Imager Spectral Molecular Imaging Multimode In Vivo Optical Imager
Doxorubicin-HCl Sigma-Aldrich D4035
Nude (NU/NU) mouse, female, 6-8 week Charles River Strain code 088
MDA-MB-435 human HER2+ tumor cells NCI-Frederick Cancer DCTD Tumor/Cell Line Repository 0507292
3/10 cc insulin syringe U-100 with 29G x 1/2" Ultra-FineIV permanently attached needle BD 309301
Delta T chamber Bioptechs 04200417B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Agadjanian, H., Chu, D., et al. Chemotherapy Targeting by DNA Capture in Viral Protein Particles. Nanomedicine. 7, (3), 335-352 (2012).
  2. Agadjanian, H., Ma, J., et al. Tumor detection and elimination by a targeted gallium corrole. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, (15), 6105-6110 (2009).
  3. Agadjanian, H., Weaver, J. J., et al. Specific delivery of corroles to cells via noncovalent conjugates with viral proteins. Pharm. Res. 23, (2), 367-377 (2006).
  4. Medina-Kauwe, L. K., Maguire, M., et al. Non-viral gene delivery to human breast cancer cells by targeted Ad5 penton proteins. Gene Therapy. 81753-81761 (2001).
  5. Medina-Kauwe, L. K., Kasahara, N., et al. 3PO, a novel non-viral gene delivery system using engineered Ad5 penton proteins. Gene Therapy. 8795-8803 (2001).
  6. Rentsendorj, A., Xie, J., et al. Typical and atypical trafficking pathways of Ad5 penton base recombinant protein: implications for gene transfer. Gene Ther. 13, (10), 821-836 (2006).
  7. Hwang, J. Y., Park, J., et al. Multimodality Imaging In vivo for Preclinical Assessment of Tumor-Targeted Doxorubicin Nanoparticles. PLoS ONE. 7, (4), e34463 (2012).
  8. Hwang, J. Y., Wachsmann-Hogiu, S., et al. A Multimode Optical Imaging System for Preclinical Applications In Vivo: Technology Development, Multiscale Imaging, and Chemotherapy Assessment. Mol. Imaging Biol. (2011).
  9. Hwang, J. Y., Gross, Z., et al. Ratiometric spectral imaging for fast tumor detection and chemotherapy monitoring in vivo. J. Biomed. Opt. 16, (6), 066007 (2011).
  10. Fujimoto, J. G., Farkas, D. L. Biomedical Optical Imaging. Oxford University Press. New York. (2009).
  11. Hwang, J. Y., Moffatt-Blue, C., et al. Multimode optical imaging of small animals: development and applications. Proc. of SPIE. 6411, (2007).
  12. Ducros, M., Moreaux, L., et al. Spectral unmixing: analysis of performance in the olfactory bulb in vivo. PLoS One. 4, (2), e4418 (2009).
  13. Zimmermann, T. Spectral imaging and linear unmixing in light microscopy. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 95245-95265 (2005).
ניתוח של חלבון נגיפי ממוקד חלקיקים מובא לHER2 + גידולים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hwang, J. Y., Farkas, D. L., Medina-Kauwe, L. K. Analysis of Targeted Viral Protein Nanoparticles Delivered to HER2+ Tumors. J. Vis. Exp. (76), e50396, doi:10.3791/50396 (2013).More

Hwang, J. Y., Farkas, D. L., Medina-Kauwe, L. K. Analysis of Targeted Viral Protein Nanoparticles Delivered to HER2+ Tumors. J. Vis. Exp. (76), e50396, doi:10.3791/50396 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter