Análisis de la proteína viral dirigida Nanopartículas Entregado a tumores HER2 +
Summary
Este artículo detalla los procedimientos para el análisis de imágenes ópticas de las nanopartículas de tumor específico, Herdox. En particular, se describe aquí el uso detallada del dispositivo de formación de imágenes multimodo para la detección de tumor de la orientación y la evaluación de la penetración del tumor.
Abstract
La nanopartícula HER2 + del tumor-específica, Herdox, exhibe acumulación tumoral-preferencial y la ablación de tumores de crecimiento en un modelo animal de cáncer de HER2 +. Herdox está formado por no covalente de auto-ensamblaje de una proteína de penetración celular específica del tumor con el agente de quimioterapia, doxorubicina, a través de un pequeño conector de ácido nucleico. Una combinación de electrofílico, intercalación y las interacciones oligomerización facilitar autoensamblaje en redondo 10-20 nm partículas. Herdox muestra una estabilidad en la sangre, así como en el almacenamiento prolongado a temperaturas diferentes. El suministro sistémico de Herdox en ratones portadores de tumores da como resultado la muerte de las células del tumor, sin efectos adversos detectables en el tejido no tumoral, incluyendo el corazón y el hígado (que se someten a daño marcado por la doxorubicina no dirigidos). HER2 elevación facilita orientación a las células que expresan el receptor del factor de crecimiento epidérmico humano, por lo tanto, los tumores se presentan niveles elevados de HER2 presentan una mayor acumulación de Herdox en comparación con las células de expresióncantar niveles más bajos, tanto in vitro como in vivo. La intensidad de fluorescencia de imagen combinada con el análisis y confocal espectral situ nos ha permitido verificar en el tumor vivo focalización y la penetración de células tumorales de Herdox después de la administración sistémica. A continuación te detallamos los métodos de evaluación de tumor de la orientación a través de imágenes multimodo después de la administración sistémica.
Introduction
Tumor-targeting de la quimioterapia tiene el potencial de eliminar las células cancerosas en dosis más baja en comparación a las drogas no orientados, debido a que más de la terapia administrada se puede acumular en su destino previsto, en lugar de distribuir al tejido no tumoral. A medida que la última situación sería diluir la eficacia de la droga y por lo tanto requieren dosis más altas para ser eficaz, tumor-alcance tiene tanto ventajas terapéuticas y de seguridad más de un tratamiento no específico estándar.
Orientación de la quimioterapia mediante encapsulación en nanopartículas auto-ensambladas permite que el fármaco permanezca sin modificar químicamente en contraste con fármacos que se unen covalentemente a moléculas de direccionamiento. Como tal vinculación tiene el potencial de alterar la actividad de ambos el medicamento y la molécula diana; montaje no covalente permite que la potencia del fármaco a ser retenido.
Hemos demostrado anteriormente que la novela de tres componentes, complejos auto-ensamblado, Herdox, se dirige a los tumores HER2 + <em> In vivo y provoca la ablación de tumores de crecimiento sin afectar al tejido normal, incluyendo el corazón 1. Herdox se forma a través de interacciones no covalentes entre la proteína de unión al receptor celular-penetración, HerPBK10, y el agente quimioterapéutico, doxorubicina (Dox), a través de un pequeño conector de ácido nucleico. HerPBK10 se une el factor de crecimiento epidérmico humano (HER) y desencadena la endocitosis mediada por el receptor 2-4, mientras que la penetración de membrana endosomal se lleva a cabo a través de la incorporación de derivados de adenovirus-pentón base de proteína de la cápside 4-6. Un dominio cargado positivamente en la proteína de unión de ácidos nucleicos permite a los 4, 5, a través del cual Dox ADN-intercalado puede ser transportado para la administración dirigida. Electrofílica, intercalación, y posiblemente interacciones oligomerización de proteínas facilitan autoensamblaje en redondo 10-20 nm partículas que son estables en la sangre y en el almacenamiento prolongado a temperaturas diferentes 1. Orientación preferencial a HER2 + células tumorales se ve facilitada por la afinidad de ligando de HER2 mejorada cuando se eleva.
Nuestros estudios previos han demostrado que la administración sistémica de los rendimientos Herdox acumulación preferencial en los tumores de más de tejido no tumoral y en comparación con untargeted Dox 1, y la penetración en las células tumorales in vivo 7. Hemos observado que las liberaciones Herdox Dox después de la entrada de células tumorales, lo que permite la acumulación de Dox en el núcleo 1. Tumor-acumulación parece que se correlaciona con el nivel del receptor, como tumores relativamente bajos que expresan HER2 se acumulan menos Herdox comparación con aquellos con niveles comparativamente más altos HER2 1. Por otra parte, la concentración eficaz la muerte celular presenta una correlación inversa con HER2 visualización en líneas de células tumorales que expresan HER2 superficie celular diferentes niveles 1. Herdox presenta una ventaja terapéutica y la seguridad sobre Dox no directo, como el asesinato del tumor se produce en más de la dosis 10 veces menor en comparación con el untardrogas geted y produce ningún efecto adverso detectable en el corazón (detectado por ecocardiografía y tinción histológica) o tejido del hígado (detectado por tinción de TUNEL), en contraste con Dox no directo 1. A pesar de su derivación de una proteína de la cápside viral, HerPBK10 no exhibe inmunogenicidad detectable a niveles terapéuticos 2. Mientras que los anticuerpos pre-existentes a adenovirus conjunto pueden reconocer HerPBK10, no son capaces de impedir la unión de células 2.
El volumen del tumor medido con el tiempo es un método estándar para evaluar la eficacia terapéutica de terapias dirigidas, y se ha empleado para evaluar la eficacia terapéutica de Herdox. Como complemento de este enfoque con in vivo y ex vivo de imágenes de fluorescencia de intensidad nos ha permitido evaluar mejor la eficiencia del objetivo 7. Hemos integrado específicamente en situ imagen confocal de los tumores extirpados con el análisis espectral de Dox fluorescencia para verificar que no Herdoxt sólo acumula en tumores in vivo, pero penetró en las células tumorales y Dox entregado en el citoplasma y el núcleo 7. El análisis espectral, además, nos ha permitido distinguir la fluorescencia Dox de autofluorescencia 7.
Aquí se demuestra en mayor detalle nuestro enfoque para evaluar Herdox in vivo después de la administración sistémica, y lo más importante, para la evaluación de orientación a través de métodos y análisis de imágenes multimodo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dox fluorescencia puede ser detectable in vivo utilizando el generador de imágenes multimodo cuando los tumores son subcutánea. Sin embargo, la dosis terapéuticamente eficaz de Herdox (0,004 mg / kg) está por debajo del umbral de detección después de una sola dosis. En contraste, después de 7 inyecciones diarias (1 vez al día durante 7 días), la acumulación del tumor y la retención de la partícula es suficiente para permitir la visualización de la fluorescencia Dox.
Es …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por donaciones a LKM-K de los Institutos Nacionales de Salud / Instituto Nacional del Cáncer (R01CA129822 y R01CA140995). Dr. Medina-Kauwe gracias C. Rey, M. M-Kauwe y D. Revetto de apoyo.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Fluorescence laser scanning confocal microscope | Leica | SPE | |
| In Vivo Optical Imager | Spectral Molecular Imaging | Multimode In Vivo Optical Imager | |
| Doxorubicin-HCl | Sigma-Aldrich | D4035 | |
| Nude (NU/NU) mouse, female, 6-8 week | Charles River | Strain code 088 | |
| MDA-MB-435 human HER2+ tumor cells | NCI-Frederick Cancer DCTD Tumor/Cell Line Repository | 0507292 | |
| 3/10 cc insulin syringe U-100 with 29G x 1/2″ Ultra-FineIV permanently attached needle | BD | 309301 | |
| Delta T chamber | Bioptechs | 04200417B |
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