Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Hedefli Viral Protein analizi HER2 + tümörler için teslim Nanopartiküller

doi: 10.3791/50396 Published: June 18, 2013

Summary

Bu makalede, tümör hedefli nanoparçacık, Herdox optik görüntüleme analizi için prosedürler. Özellikle, hedef ve tümör penetrasyon değerlendirilmesi tümör tespit için çoklu görüntüleme cihazı ayrıntılı kullanımı burada açıklanmıştır.

Abstract

HER2 + tümör hedefli bir nanoparçacık, Herdox, HER2 + kanseri olan bir hayvan modelinde tümör tercihli birikimi ve tümör büyümesini ablasyon sergiler. Herdox küçük bir nükleik asit bağlayıcı yoluyla, kemoterapi ajanı, ve doksorubisin, bir tümör hücresi hedefli penetrasyon proteininin kovalent olmayan bir montajı ile oluşur. Elektrofilik, ardalanması ve oligomerizasyonu etkileşimleri bir arada turu 10-20 nm parçacıklar halinde kendinden montaj kolaylaştırır. Herdox farklı sıcaklıklarda kan hem de uzun süreli depolama stabilitesi gösterir. Kalp ve karaciğer (hedefsiz doksorubisin ile işaretlenmiş zarar görür olan) da dahil olmak üzere tümör olmayan doku tespit edilebilir bir yan etkileri, tümör-hücre ölümü, tümör taşıyan farelere sonuçları Herdox sistemik olarak verilmesine. HER2 yükseklik ekspres hücreleri ile karşılaştırıldığında bu nedenle yüksek seviyelerde HER2 gösteren tümörlerin Herdox daha fazla birikimi gösteren, insan epidermal büyüme faktörü reseptörü ifade eden hücrelere hedefleme kolaylaştırırin vitro ve in vivo olarak daha düşük seviyelerde, şarkı. Yerinde konfokal ve spektral analiz ile birlikte floresan görüntüleme bizi hedef in vivo tümör ve sistemik doğumdan sonra Herdox tümör hücre nüfuz doğrulamak için izin verdi. Sistemik doğumdan sonra çok modlu görüntüleme ile hedef tümör değerlendirmek için burada detaylı bizim yöntemleri.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tümör hedefleme kemoterapi teslim tedavinin daha çok tümör olmayan doku dağıtmak daha da istenilen hedefe birikir, çünkü hedefsiz ilaçlara göre daha düşük dozda kanser hücrelerinin ortadan kaldırmak için bir potansiyele sahiptir. Ikinci durum, ilacın etkinliğinin sulandırmak ve böylece daha yüksek dozlarda etkili olmasını gerektirecektir olarak, tümör hedefleme standart olmayan hedefli tedavi üzerinde her iki tedavi ve güvenlik avantajı vardır.

Kendi kendini monte nanopartiküller içine kapsülleme ile, kemoterapi hedefleme ilaç, kimyasal olarak kovalent hedefleme moleküllerine bağlı ilaçların aksine değiştirilmemiş kalmasını sağlar. Bu tür bir bağlantı, uyuşturucu ve hedefleme molekülünün her ikisi de aktivitesini değiştirmek için potansiyele sahiptir; kovalent olmayan bir montaj ilaç kudretini muhafaza edilmesini sağlar.

Daha önce yeni üç bileşenli, kendini monte kompleksi, Herdox, HER2 + tümörlerin hedef göstermiştir 1 de dahil olmak üzere, normal doku koruyucu iken tümör büyüme ablasyon ortaya çıkarır. Herdox reseptör bağlanma hücre penetrasyon proteini HerPBK10 ve kemoterapötik ajan arasındaki kovalent olmayan etkileşim yoluyla oluşan küçük bir nükleik asit bağlayıcı yoluyla doksorubisin (Dox). Endozomal membran penetrasyonu, adenovirüs-türetilmiş Penton baz kapsid proteini 4-6 arasında birleşme yoluyla gerçekleştirilir ise HerPBK10, insan epidermal büyüme faktörü reseptörü (HER) bağlar ve 2-4 reseptör aracılı endositoz tetikler. Protein üzerindeki pozitif yüklü bir etki nükleik asit DNA-interkalate Dox hedeflenmiş dağılım için nakledilebileceği üzerinden bağlama 4, 5, sağlar. Elektrofilik, ardalanması, ve muhtemelen protein oligomerizasyonu etkileşimleri farklı sıcaklıklarda 1 kan ve uzun saklama koşulları altında kararlı yuvarlak 10-20 nm parçacıklar halinde kendinden montaj kolaylaştırır. Tercihli HER hedefliyorHER2 yükseldiğinde 2 + tümör hücrelerinin gelişmiş afinite ligandı tarafından kolaylaştırılır.

Daha önceki çalışmalar, tümör olmayan doku üzerinde tümörlerde ve karşılaştırma Herdox verim birikmesidir sistemik olarak verilmesine in vivo 7 tümör hücrelerine DOX, 1, ve penetrasyon hedefsiz için göstermiştir. Biz gözlemledim ki tümör hücre girmesinden sonra Herdox bültenleri Dox, çekirdeği 1 içine Dox birikimi sağlar. Tümör-birikimi nispeten düşük HER2-ifade tümörleri nispeten daha yüksek HER2 seviyeleri 1 olanlara göre daha az Herdox biriktikçe, reseptör seviyesi ile uyumlu görünüyor. Dahası, etkin bir şekilde hücre ölümü konsantrasyonu farklı hücre yüzeyi HER2 seviyeleri 1 ifade eden tümör hücre çizgileri üzerinde HER2 ekran ile ters bir ilişki sergiler. Tümör öldürme 10-kat daha düşük dozda üzerinde gerçekleşir olarak Herdox Tar göre, hedefsiz Dox üzerinde tedavi ve güvenlik avantajı sergilergeted uyuşturucu ve hedefsiz Dox 1 aksine, kalp (ekokardiyografi ve histolojik leke ile tespit edilir) ya da karaciğer (leke TÜNEL ile tespit edilir) dokusu üzerinde tespit edilebilir bir yan etki üretmektedir. Bir viral kapsid protein kendi türetme rağmen, HerPBK10 terapötik seviyelerde 2 saptanabilir immünojenitesi sergiler. Bütün adenovirüs için önceden var olan antikorlar HerPBK10 tanıyabilir Oysa, onlar 2 bağlayıcı hücre önlemek mümkün değildir.

Zaman içinde ölçülen tümör hacminin hedeflenen tedavi terapötik etkinliğinin değerlendirilmesinde standart bir yöntemdir ve Herdox terapötik etkinliğini değerlendirmek için istihdam edilmiştir. In vivo ve ex vivo floresan görüntüleme ile bu yaklaşım ilave daha iyi verim 7 hedef değerlendirmek için izin verdi. Biz özellikle bu Herdox hiçbir doğrulamak için Dox floresan spektral analizi ile eksize tümörlerin yerinde konfokal görüntüleme entegre vart sadece in vivo tümörlerin biriken ama sitoplazma ve çekirdek 7 içine tümör hücreleri ve teslim Dox nüfuz. Spektral analiz ayrıca bize otofloresansı 7 Dox floresan ayırt sağladı.

Burada sistemik doğumdan sonra in vivo Herdox değerlendirilmesi için daha ayrıntılı olarak yaklaşımımızı göstermek, ve en önemlisi, değerlendirmek için çok modlu görüntüleme yöntemleri ve analizleri ile hedef.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. In vivo sistemik olarak verilmesine

  1. 6-8 haftalık nu / nu fare deri altı açısı taraflı yan ksenograft tümörler için enjeksiyon başına Herdox bir 0.004 mg / kg dozda, 0.2 ml eşit steril tuzlu su ile yeterli Herdox karıştırın.
  2. Yavaşça kabarcıklar kaçınarak, 29G iğnesi ile donatılmış bir 3/10 cc şırınga içine insülin Herdox karışımı çizin.
  3. 0.5-1 L / dk, izofluran konsantrasyonu:% 3-4 (veya daha düşük) Anestezi bir gazı tahliye sistemi (Oksijen akış oranları ile donatılmış bir indüksiyon odasında kısa izofluran maruz indüklenir.
  4. Bir anestezi fare (enjeksiyon başına 0.2 mi) bir kuyruk damarı içine tüm karışımı enjekte edilir. IV enjeksiyonu da ölçülü, anestezisiz fare gerçekleştirilebilir.
  5. Günde bir, altı ardışık gün boyunca aynı fare enjeksiyon tekrarlayın.

2. In vivo Floresans Görüntüleme

Tümörlerde Herdox floresan birikimi canBir çok modlu kamera kullanarak enjeksiyon son günü (Günlük 7) ile saptanabilir edilebilir. Aşağıdaki işlemleri özel bir makro-aydınlatma ve algılama sistemi (Şekil 1) 8 kullanımını gerektirecektir.

  1. In vivo Optik Görüntüleyici olarak Çoklu açın.
  2. Doksorubisin floresan tespiti için uygun bir emisyon bant geçiren filtre (590 nm ± 30 nm) seçin.
  3. Argon-Kripton Lazer açın ve lazer optik yolda bir uyarım bant geçiren filtre (488 nm ± 10 nm) yerleştirin.
  4. Anestezi sistemi açın ve daha sonra anestezi odası (Oksijen akış hızı bir fare yerleştirin: 0.5-1 L / dk, izofluran konsantrasyonu:% 3-4 (veya daha düşük) bir gazı tahliye sistemi ile donatılmıştır.
  5. Anestezi odasından fare anestezi in vivo Optik Görüntüleyici olarak Çoklu mod ve görüntüleme odasına fare aktarın.
  6. Fare burun üzerinde bir roket ucu konisi yerleştirin ve sürekli anestezi yönetmek için akış açıkgörüntü alımı sırasında sia (Oksijen akış hızı: 0.5-1 L / dk, izofluran konsantrasyonu:% 2-3 (veya daha düşük).
  7. 5-15 sn bir pozlama süresi ile floresan görüntüler elde.
  8. Arka plan düzeltme veya kontrast ayarı da dahil olmak üzere görüntü analizi ve işleme gerçekleştirin.

3. Floresan Görüntüleme ex vivo

Herdox floresan tümörler ve belirli organlarda görüntülü olabilir (karaciğer de dahil olmak üzere, böbrek, dalak, kalp ve iskelet kası) Herdox son (Günlük 7) enjeksiyondan sonra 24 saat de ötenazi farelerden alınan hasat.

  1. In vivo Optik Görüntüleyici olarak Çoklu açın.
  2. Doksorubisin floresan tespiti için bir emisyon bant geçiren filtre (580 nm ± 20 nm) seçin.
  3. Argon-Kripton Lazer açın ve lazer optik yolda bir uyarım bant geçiren filtre (488 nm ± 10 nm) yerleştirin.
  4. Yeri tümörler ve belirli organları görüntüleme odasına o bir Petri-tabağına düzenlenmişf in vivo Optik Görüntüleyici olarak Multimode.
  5. 5-15 sn bir pozlama süresi ile dokuların floresan görüntüler elde. Başlangıç ​​floresans görüntü elde etme için bir örnek, Şekil 2a'da gösterilmiştir. Arka Plan (Şekil 2b) olarak görev yapacak olan, Petri-çanak boş kullanarak aynı tekrarlayın.
  6. Arka plan düzeltme veya kontrast ayarı da dahil olmak üzere görüntü analizi ve işleme gerçekleştirin. Düzeltilmiş bir görüntü örneği Şekil 2a, Şekil 2b çıkarılması sonucu, Şekil 2c'de gösterilmektedir.

4. Tümörler yerinde Konfokal Görüntüleme olarak

Yerinde konfokal görüntüleme hücresel düzeyde algılama ve Herdox tümör birikimi analiz sağlar.

  1. Leica SPE konfokal mikroskop açın.
  2. Doksorubisin için doksorubisin ve emisyon dalga boyları (560-620 nm) uyarma için 488 nm lazer ışığı seçinfloresan algılama.
  3. Objektif lens üzerinde 40X veya 63X objektif ve damla immersiyon seçin.
  4. Prosedür 2'de tarif edildiği gibi önceden Herdox ve sahte alınan tedaviler ötenazi farenin taze tümörleri Ayıklama.
  5. Buz üzerinde bir Petri-tabak yerleştirin tümörler doku bozulmasını önlemek ve daha sonra konfokal görüntüleme için Delta T odasına tümörler aktarmak için.
  6. Sıralı odak derinliği (: 1 mikron, kalınlığı: 20 mikron adım boyutu) de tümörlerin konfokal görüntüler elde. Z ekseni boyunca ardışık olarak-elde edilen görüntü bir örnek Şekil 3, sol panel gösterilmiştir.
  7. Maksimum yoğunluk görüntüleri z projeksiyon gerçekleştirin. Z-yığılmış görüntülerin maksimum yoğunluk projeksiyonu Şekil 3, sağ panelde gösterilir.
  8. . Maksimum yoğunluğun floresan yoğunlukları Z ortalama hesaplama - görünüm genel alan üzerinde görüntü floresan yoğunlukları ortalama projeksiyon görüntüleri hesaplamak edildid ImageJ kullanarak.

5. Oranlı metrik Spektral Görüntüleme ve Analiz

Oranlı metrik spektral görüntüleme ve analiz Dox floresan ve otofloresans arasında ayrımcılık sağlar.

  1. Floresan konfokal mikroskop tarama bir lazer güç.
  2. Bir adım 10 nm boyutu ve bir Leica SPE konfokal mikroskop kullanılarak 488 nm ışık uyarma ile, 510-650 nm spektral aralığında belirli bir derinlikte Herdox-tedavi edilen ve edilmeyen tümörler 15 görüntüler elde.
  3. Doksorubisin bir 100 mcM çözüm hazırlayın.
  4. Dox floresan (: 510-650 nm, bir adım boyutu: 10 nm spektral aralığı) saf spektral imza elde etmek için 100 mcM doksorubisin çözümün spektral görüntüleme gerçekleştirin. Bir grafik Şekil 4'te gösterildiği gibi spektral görüntüleme ve floresan spektrumu çıkan görüntü elde etme tipik sonuçlar çizilmiştir.
  5. Bir görüntü c otofloresans spektral imza Edinmeube (spektral aralığı: 510-650 nm, bir adım boyutu: 10 nm) tedavi edilmemiş tümörlerin spektral görüntüleme ile elde edilen. Gösteren bir grafiktir, Şekil 5'te gösterildiği gibi spektral görüntüleme ve floresan spektrumu çıkan görüntü elde etme tipik sonuçlar çizilmiştir.
  6. Biz 9 geliştirilen programı kullanarak dört referans spektral imzaları (saf otofloresansı, 0.1.doxorubin +0.9. Otofloresansı, 0.2. Doksorubisin +0.8. Otofloresansı, 0.3.doxorubin +0.7. Otofloresans) oluşturun. Dört referans spektral imzaları gösteren tipik bir eğrisi Şekil 6'da gösterilmektedir.
  7. Daha önce 9 geliştirilen program kullanılarak Öklid uzaklık ölçüsü üzerinden referans spektral imzaları tarafından tanımlanan görüntülerin spektral sınıflandırılması gerçekleştirin.
  8. Rasyometrik spektral görüntüleme ve analiz için karşılaştırma için biz 7 geliştirilmiş bir spektral Karışmama programı (ImageJ plug-in), 10, kullanarak bu görüntülerin doğrusal spektral Karışmama gerçekleştirin. Bir elineer spektral Karışmama göre otofloresans ikinci Herdox floresan ayırma xample Şekil 7 'de gösterilmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Şekil 1 floresan, spektral, ömür boyu, 2-foton, içi hayati konfokal ve biyoparlaklık görüntüleme dahil olmak üzere birden fazla yöntemleri altında görüntü elde etme amacıyla, için inşa edilmiştir in vivo optik görüntüleyici prototip, gösterir. Buna ek olarak, bu sistem dahil soğutmalı yüksek duyarlı kamera ve yüksek güçlü lazer çizgileri özellikle doksorubisin floresan in vivo tespiti için ticari optik görüntüleme sistemleri 11 ile karşılaştırıldığında daha yüksek kontrast floresan görüntüler, verir. Bu nedenle, bu sistem, in vivo olarak Herdox değerlendirilmesinde çok tamamlayıcı veri noktası elde etmek için mevcut çalışmasında kullanılmak için önemli idi.

Şekil 2'de gösterildiği gibi yüksek tümör floresan Herdox sistemik olarak verilmesine sonra tipik, ve tümör hedefleme tercihli göstergesidir. Iskelet kaslarında tespit edilen floresan atipik ileri ve geri sonuçlanabilirenjeksiyon prosedürü m anomaliler (yani vücuda çok yakın enjekte). Kalitatif olarak, Şekil 2a'da gösterildiği gibi, düşük arka plan görüntüsü vardır. Ancak göreli doku floresans yoğunlukları bir nicel analizini yapmak için, bu, Şekil 2b'de gösterilen boş bir çanak bir arka plan düzeltmesi gerçekleştirmek için gereklidir. Bu kıyasla, görüntünün kenarından daha yüksek bir arka plan sinyali, Şekil 2c'de gösterildiği gibi bir "arka plan düzeltilmiş" görüntü ile sonuçlanabilir, orijinal (Şekil 2a) arka plan görüntüsü (Şekil 2b) kenarında düşük yoğunlukları vardır, çünkü görüntü. Arka plan düzeltme, görüntünün kenarında bir sinyal artış verebilir iken Böylece, bu daha sonraki kantitatif analiz için gerekli bir adımdır.

Tümörlerde Herdox birikim nicel bir değerlendirmesini elde etmek amacıyla, konfokal floresan görüntü farklı odak elde edildiin situ derinlikleri maksimum yoğunluk görüntüleri z projeksiyon (Şekil 3) ve yansıtılan görüntünün ortalama floresan yoğunluğu elde edilmesi takip eder. Ortaya çıkan görüntü her piksel için belirtilen z kalınlıkları fazla Herdox birikimi bilgilerini içerir, ve böylece floresan yoğunluklarının ortalaması nicelik olarak farklı derinliklerde tümörlerde genel Herdox birikimleri yansıtır.

Tümörlerde otofloresans gelen Herdox floresan ayırt ve kantitatif yüksek özgüllük, rasyometrik spektral görüntüleme ve analiz ile iki ayrımcılık uygulandı. Doksorubisin ve spektral görüntüleme elde otofloresans için saf spektral imzaları, sırasıyla Şekil 4 ve 5 'de gösterilmiştir. Referans spektral imzaları (Şekil 6) da biz 9 geliştirilen program kullanarak saf spektral imzaları farklı oranlarda karıştırılarak oluşturuldu. Her referespektral imza burada otofloresans ile ilgili tümörlerde biriken Herdox göreceli floresan temsil nce. Spektral sınıflandırma görüntüleri (veri bu yazıda gösterilen değildi) saf referans spektral imzaları (Şekil 7) kullanılarak elde edilen spektral karıştırılmamış görüntüye göre daha iyi nicel Herdox birikimleri 7 gösterdi. Rasyometrik spektral görüntüleme yaparken 4-7 Şekil tipik bulguları temsil ve analiz.

Şekil 1
Şekil 1. Vivo optik görüntüleyici olarak. Floresan, spektral, floresans ömrü ve intravital konfokal görüntüleme yetenekleri ile optik görüntüleme sistemi kullanılmalıdır. Burada kullanılan modlu optik görüntüleme sistemi gösterilir ve describ olmuştured daha önce 8. Hwang, JY, ve diğerleri, Mol:. Resim Springer Bilim ve Business Media BV tür izni ile sağlanır. Görüntüleme Biol., 14, 431-42 (2012).

Şekil 2,
Şekil 2. Herdox alan bir fareden elde iç organ ve tümörlerin Örnek floresan yoğunluğu görüntüler. Dokular ve tümörler önce Herdox Floresans şiddeti görüntülerin son (Günlük 7) enjeksiyon sonrası ve (b) (a) ve (c), sırasıyla tarafından temsil edilmektedir arka plan düzeltme sonrası 24 saatte ötenazi farelerden alınan hasat edildi. büyük görmek için tıklayınız rakam .


Şekil 3,. Sıralı z-derinliklerde elde edilen görüntülerin maksimum yoğunluğu z-projeksiyon. Solda gösterilen yığılmış görüntüleri sıralı 1 mikron derinliklerde elde edilen tümör dokusunun konfokal tarama temsilcisi vardır. Sağdaki resim soldaki yığılmış görüntülerin derleme gösterir.

Şekil 4,
Şekil 4. Doksorubisin için saf spektral imza alımı. Doksorubisin çözüm görüntüleri 10 nm adım boyutu (sol), doksorubisin elde edildi için saf spektral imza ile, 510-650 nm içinde ardışık dalga boylarında elde edildikten sonra Geliştirdiğimiz programı kullanarak. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 5,
Şekil 5,. Otofloresansı için saf spektral imza alımı. Tedavi edilmeyen tümör görüntüleri 10 nm adım boyutu (solda), otofloresans için saf spektral imza geliştirdiğimiz programı kullanılarak elde edilmiştir. Ile, 510-650 nm içinde ardışık dalga boylarında elde edildikten sonra büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

load/50396/50396fig6.jpg "/>
6 Şekil. Rasyometrik spektral görüntüleme ve analiz için dört referans spektral imzaları. Referans spektral imzaları geliştirdiğimiz programı kullanarak saf spektral imzaları karıştırılarak oluşturuldu. Yeşil renkli düz çizgi saf otofloresans temsil, kırmızı renkli düz çizgi 0.1.doxorubin +0.9 temsil eder. Otofloresansı, mavi renkli düz çizgi 0,2 temsil eder. doksorubisin +0.8. otofloresansı, ve mavi renkli düz çizgi 0.3.doxorubin +0.7. otofloresansı, sırasıyla. Hwang, JY, ve diğerleri, PLoS One 7 (4), (2012):.. Şekil yazarların önceki işten yeniden üretilir.

Şekil 7
Şekil 7. Spektral un-karıştırma öncesi ve sonrası dokuda Herdox floresan. Dox ve otofloresansı, inci spektral imzaları alındıktan sonraE Dox sinyallerinin spektral doğrusal olmayan karıştırma 12,13 kullanılarak ayrılır. Şekil otofloresans ve Herdox karışık görüntü gösterir spektral un-karıştırma ve ayrılan Herdox görüntü spektral un-karıştırma önce sonra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dox floresan tümörler subkutan olduğunda çoklu görüntüleyicisi kullanılarak in vivo olarak tespit edilebilir. Bununla birlikte, Herdox terapötik olarak etkili doz (0.004 mg / kg) tek bir dozdan sonra aşağıdaki algılama eşiğidir. Buna karşılık, 7 günlük enjeksiyonu (7 gün boyunca 1x/day) sonrasında, parçacığın tümör birikimi ve tutma Dox flöresanının görsellenmesin sağlamak için yeterlidir.

Dox veya temiz tekniği kullanılan in vivo görüntüleme için başka bir fluorofor ile çalışma zaman önemlidir. Görüntüleyici Dox dış ya da iç olup olmadığını ayırt olmadan derinin dış floresan algılar olarak fare dışında damlalar, kaçınılmalıdır. Benzer şekilde, eldiven Dox kirlenme dolayısıyla hatalı floresan algılama neden, hayvan taşıma sırasında fare dışında floresan işaretleri bırakabilir.

Çoklu optik sistem olarak,Lazer ışını Herdox uyarılması için kullanılmaktadır. Lazer ışını, tipik olarak bir Gauss bir profile sahiptir. Bu nedenle, ilgi örneklerin tip uyarma için, optik difüzör kullanılmaktadır. Bununla birlikte, dağınık lazer ışığı biraz bir Gauss ışın profili korur. Bu nedenle, ideal bir kantitatif analizi için, arka plan düzeltmesi gerçekleştirilmelidir. Önce düzeltilmiş ve arka plan görüntüleri genellikle 16 bit derinliğe sahip. Arka plan düzeltme yapılmadan önce nedenle, görüntü derinliği çıkan ve giriş görüntüleri arasında görüntü derinliği tutarsızlık istenmeyen hataları önlemek için 32 bit dönüştürülmesi gerekir.

Bir arka plan görüntüsü edinimi, siyah bir kağıt (Artagain) daha önce floresan görüntüleme gerçekleştirmeden önce aydınlatma yansımaları önlemek için bir görüntüleme plaka konulmuştur. Kamera son derece hassas olduğundan Ancak, siyah-kağıt düşük arka plan sinyalleri kamera tarafından tespit edildi. Bu nedenle, arka planŞekil 2 'de gösterilen sinyaller siyah kağıt ziyade Petri kabı, boş geldi.

Doksorubisin çözüm bir yüksek konsantrasyon yüksek doğruluk ile saf spektral imzaları elde etmek için kullanılmıştır. Bu sistemin daha da güvenilir bir spektral imza üretmek için yeterli numune floresan tespit edebilme yeteneğine sahip olan spektral çözünürlük incelenmiştir. Sonuç olarak, spektral çözünürlük 10 nm'ye ayarlanmıştır. Burada daha yüksek spektral çözünürlük (<10 nm) ayarı altında mikroskop güvenilir spektral imzaları vermeye yeterli floresan tespit edemeyeceği bulundu. Saf spektral imzaları ile, birkaç rasyometrik spektral imzaları (Şekil 6) oluşturabilir. Özellikle, kantitatif ilgili rasyometrik spektral imzaları 7 tarafından otofloresansı gelen Herdox floresan sinyalleri ayırt olabilir. Saf spektral imza ile elde edilen spektral karışmamış görüntüs (Şekil 7) iki referans spektral imzaları ile gizli görüntü benzerdi (mavi:. 0.2.Dox +0.8 Autofl ve Yeşil:.. Autofl). Toplamda, rasyometrik spektral / konfokal görüntüleme böylece HER2 + tümörlerin teslim nanopartiküller analizinde yararlılığını doğrulayarak, yüksek çözünürlüklü yerinde tümör hücrelerinde Herdox birikimi hakkında daha fazla nicel bilgi verdi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazar, Daniel Farkas, Spektral Moleküler Görüntüleme Başkanıdır. Kalan Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması var.

Acknowledgments

Bu çalışma Sağlık / Ulusal Kanser Enstitüsü (R01CA129822 ve R01CA140995) Ulusal Enstitüleri LKM-K hibe tarafından finanse edildi. Dr Medine-Kauwe sürekli destek C. Rey, M. M-Kauwe ve D. Revetto teşekkür eder.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fluorescence laser scanning confocal microscope Leica SPE
In Vivo Optical Imager Spectral Molecular Imaging Multimode In Vivo Optical Imager
Doxorubicin-HCl Sigma-Aldrich D4035
Nude (NU/NU) mouse, female, 6-8 week Charles River Strain code 088
MDA-MB-435 human HER2+ tumor cells NCI-Frederick Cancer DCTD Tumor/Cell Line Repository 0507292
3/10 cc insulin syringe U-100 with 29G x 1/2" Ultra-FineIV permanently attached needle BD 309301
Delta T chamber Bioptechs 04200417B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Agadjanian, H., Chu, D., et al. Chemotherapy Targeting by DNA Capture in Viral Protein Particles. Nanomedicine. 7, (3), 335-352 (2012).
  2. Agadjanian, H., Ma, J., et al. Tumor detection and elimination by a targeted gallium corrole. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, (15), 6105-6110 (2009).
  3. Agadjanian, H., Weaver, J. J., et al. Specific delivery of corroles to cells via noncovalent conjugates with viral proteins. Pharm. Res. 23, (2), 367-377 (2006).
  4. Medina-Kauwe, L. K., Maguire, M., et al. Non-viral gene delivery to human breast cancer cells by targeted Ad5 penton proteins. Gene Therapy. 81753-81761 (2001).
  5. Medina-Kauwe, L. K., Kasahara, N., et al. 3PO, a novel non-viral gene delivery system using engineered Ad5 penton proteins. Gene Therapy. 8795-8803 (2001).
  6. Rentsendorj, A., Xie, J., et al. Typical and atypical trafficking pathways of Ad5 penton base recombinant protein: implications for gene transfer. Gene Ther. 13, (10), 821-836 (2006).
  7. Hwang, J. Y., Park, J., et al. Multimodality Imaging In vivo for Preclinical Assessment of Tumor-Targeted Doxorubicin Nanoparticles. PLoS ONE. 7, (4), e34463 (2012).
  8. Hwang, J. Y., Wachsmann-Hogiu, S., et al. A Multimode Optical Imaging System for Preclinical Applications In Vivo: Technology Development, Multiscale Imaging, and Chemotherapy Assessment. Mol. Imaging Biol. (2011).
  9. Hwang, J. Y., Gross, Z., et al. Ratiometric spectral imaging for fast tumor detection and chemotherapy monitoring in vivo. J. Biomed. Opt. 16, (6), 066007 (2011).
  10. Fujimoto, J. G., Farkas, D. L. Biomedical Optical Imaging. Oxford University Press. New York. (2009).
  11. Hwang, J. Y., Moffatt-Blue, C., et al. Multimode optical imaging of small animals: development and applications. Proc. of SPIE. 6411, (2007).
  12. Ducros, M., Moreaux, L., et al. Spectral unmixing: analysis of performance in the olfactory bulb in vivo. PLoS One. 4, (2), e4418 (2009).
  13. Zimmermann, T. Spectral imaging and linear unmixing in light microscopy. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 95245-95265 (2005).
Hedefli Viral Protein analizi HER2 + tümörler için teslim Nanopartiküller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hwang, J. Y., Farkas, D. L., Medina-Kauwe, L. K. Analysis of Targeted Viral Protein Nanoparticles Delivered to HER2+ Tumors. J. Vis. Exp. (76), e50396, doi:10.3791/50396 (2013).More

Hwang, J. Y., Farkas, D. L., Medina-Kauwe, L. K. Analysis of Targeted Viral Protein Nanoparticles Delivered to HER2+ Tumors. J. Vis. Exp. (76), e50396, doi:10.3791/50396 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter