Summary
Procedure su micropiastra sono descritte per l'analisi colorimetrica o fluorimetrica dell'attività enzimatica extracellulare. Tali procedure consentono la rapida saggio di tale attività in un gran numero di campioni ambientali in tempi gestibile.
Abstract
Gran parte del ciclo dei nutrienti e lavorazione del carbonio in ambienti naturali avviene attraverso l'attività degli enzimi extracellulari rilasciati da microrganismi. Così, misurazione dell'attività di questi enzimi extracellulari può dare intuizioni aliquote di processi livello dell'ecosistema, quali la decomposizione della materia organica o azoto e fosforo mineralizzazione. I saggi di attività enzimatica extracellulare nei campioni ambientali tipicamente coinvolgono esponendo i campioni a substrati colorimetrici o fluorimetrici artificiali e il monitoraggio del tasso di idrolisi del substrato. Qui si descrivono i metodi su micropiastra per queste procedure che consentano l'analisi di un gran numero di campioni in un breve lasso di tempo. I campioni vengono lasciati reagire con substrati artificiali entro 96 pozzetti o pozzo profondo blocchi micropiastre, e l'attività enzimatica viene successivamente determinati mediante assorbimento o fluorescenza del prodotto finale risultante utilizzando un tipico Reade micropiastrar o fluorimetro. Tali procedure ad alto rendimento facilitare non solo i confronti tra siti o ecosistemi spazialmente separati, ma anche di ridurre sostanzialmente il costo di tali dosaggi, riducendo i volumi complessivi dei reagenti necessari per campione.
Introduction
Microrganismi come batteri e funghi ottengono nutrienti e il carbonio di composti organici complessi attraverso la produzione di enzimi extracellulari. Questi enzimi idrolizzano tipicamente polimeri in subunità più piccole che possono essere presi in cella. Pertanto, a livello ecologico, questi enzimi extracellulari microbici sono responsabili di gran parte della mineralizzazione dei nutrienti e la decomposizione della materia organica che si verifica in ambienti naturali. Enzimi come cellobioidrolasi (CBH) e β-glucosidasi sono importanti per la degradazione della cellulosa e lavorare all'unisono per catalizzare l'idrolisi di cellulosa in glucosio 1,2, che fornisce un substrato di carbonio utilizzabile per l'assorbimento e l'assimilazione microbica. L'enzima fosfatasi rilascia gruppi fosfati inorganici solubili da organofosfati, essenzialmente mineralizzanti fosfato e renderlo disponibile per l'uso da maggior parte degli organismi 3. Altri enzimi, come N-acetilglucosaminidasi (NAGase), sono important in degrado chitina e può fare sia il carbonio e l'azoto disponibile per acquisizione microbica 4.
Una delle procedure per il saggio di attività enzimatica extracellulare microbica in ambienti naturali è l'uso di p-nitrofenil artificiale (p NP) substrati collegati, un approccio che è stato originariamente sviluppato per rilevare l'attività della fosfatasi terreno 5. Questo approccio si basa sul rilevamento di un prodotto finale colorato, p-nitrofenolo, che viene rilasciato quando il substrato artificiale viene idrolizzato dall'enzima appropriato. Il p-nitrofenolo può essere successivamente quantificato colorimetro misurando la sua assorbanza a circa 400-410 nm. Questo metodo è stato poi applicato a rilevare altri enzimi come NAGase 6, ed è stato utilizzato in vari studi guardando microbica attività enzimatica extracellulare in terreni e sedimenti 7-9.
Un approccio alternativo che era originally sviluppato per valutare l'attività glucosidasi extracellulare in ambienti acquatici 10,11 fa uso di 4-metilumbelliferone (MUB) substrati collegati. Il prodotto finale rilasciato (4-metilumbelliferone) è altamente fluorescente e può essere rilevato utilizzando un fluorimetro con un'impostazione eccitazione / emissione intorno a 360/460 nm. Una varietà di substrati artificiali MUB-legati sono disponibili, permettendo la misurazione fluorimetrica dell'attività di almeno tanti enzimi (ad esempio β-glucosidasi, cellobioidrolasi, Nagase, fosfatasi) come può essere dosati utilizzando la procedura colorimetrica p NP-substrato. Altri enzimi extracellulari microbici, quali la leucina aminopeptidasi proteina-degradanti, possono essere dosati fluorometrically usando 7-ammino-4-metil (COU) substrati collegati. Sia MUB-e substrati COU-legati sono stati utilizzati per determinare l'attività enzimatica in vari campioni terrestri e acquatici 12,13.
Mentre gli studi precedenti hanno described micropiastra fluorometrico o colorimetrico approcci per determinare l'attività enzimatica extracellulare 14, c'è la necessità di una chiara presentazione di come condurre tali analisi. Qui mostriamo le procedure per lo svolgimento di tecniche ad alta velocità micropiastra per l'analisi dell'attività enzimatica extracellulare in suoli e sedimenti che utilizzano l'approccio substrati NP-linked p colorimetrica e nelle acque naturali, utilizzando la tecnica di fluorescenza substrati MUB-linked. Ci concentriamo sulla misurazione delle attività di β-glucosidasi, NAGase, e fosfatasi come questi enzimi possono essere legati al carbonio, azoto, fosforo e ciclismo, rispettivamente. Tuttavia, le procedure qui descritte possono essere applicate alla misurazione di altri enzimi extracellulari usando differenti substrati artificiali.
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Protocol
L'analisi colorimetrica di extracellulare Enzyme Activity in terreni e sedimenti
1. Preparazione del substrato e Soluzioni tampone per analisi colorimetriche di Enzyme Activity
- Preparare H 50 mM tampone acetato (pH 5,0-5,5) mescolando 50 ml di 0,1 M di acido acetico (2,87 ml di acido acetico glaciale in 500 ml di acqua), 150 ml di acetato di sodio 0,1 M, e 200 ml di acqua distillata 2 O. Regolare il pH a 5,0-5,5 con 0.1 M di acido acetico, se necessario.
- Preparare una soluzione di 1 M di idrossido di sodio (NaOH) in H 2 O distillata O.
- Preparare le soluzioni di substrato NP-linked p in 50 mM tampone acetato. Per eseguire il test della fosfatasi preparare 5 mM p NP-fosfato in 50 mM tampone acetato, per saggiare β-glucosidasi preparare 5 mM p NP-β-glucopiranoside, per saggiare NAGase preparare 2 mM pNP-β-N-acetylglucosaminide. Preparare tutte le soluzioni del substrato in sterili da 15 ml o 50 ml provette da centrifuga. Le soluzioni possono essere conservati a 4 ° C per 2-3 settimane.
2. Determinazione di una standard per convertire assorbanza a p NP Concentrazione
- Preparare soluzioni standard di p-nitrofenolo in 50 mM tampone acetato. Le concentrazioni dovrebbero spaziare 0,025-1 mm.
- Trasferimento tre repliche di 100 ml di ciascuna concentrazione ad una chiara micropiastra a 96 pozzetti. Aggiungere 10 ml di NaOH 1 M e 190 microlitri distillata H 2 O a ciascun pozzetto.
- Record assorbanza a 410 nm usando un lettore di micropiastre.
- Concentrazioni di moltiplicarsi in curva standard di 0.3 per ottenere μmoles p NP 300 per volume di reazione microlitri. Tracciare una curva di assorbanza vs micromol di p NP. La pendenza della curva serve come fattore di conversione (C) che si riferiranno assorbanza a micromol di p NP in ciascuna reazione enzimatica.
3. Condurre il Enzyme Assay
- Per il suolo, preparare un impasto di ogni campione da dosare in una sterile provetta da centrifuga da 15 ml a Concentrazionezione di circa 1 g / ml -1 usando 50 mM di tampone acetato. Per i sedimenti, aggiungere tampone acetato sufficiente a rendere l'impasto facilmente pipettable. L'esatto volume di slurry necessaria varierà a seconda del numero di enzimi dosati, ma è consigliato un minimo di 5 ml. Vortex ogni impasto fino a quando tutte zolle di terreno o nel sedimento sono dispersi e notare il volume finale.
- Re-vortice ogni slurry e pipettare immediatamente 150 ml in ciascuna delle sei pozzetti su un blocco 96 pozzetti Deepwell (Figura 1). È importante vortice accuratamente e frequentemente per mantenere in sospensione le particelle del terreno. Lasciare almeno due pozzetti per blocco vuoto per servire come controllo substrato. Nota: ritagliare il fine di punte per pipette con le forbici prima di dispensare come fanghi suolo tendono a intasare punte. Preparare un blocco a 96 pozzetti per ciascun enzima da dosare.
- Versare circa 5 ml di tampone acetato in un serbatoio pipetta e usare una pipetta a 8 canali per aggiungere 150 ml di buffer alla last due pozzetti di ciascun campione (questi saranno i controlli tampone campione) e le due pozzetti di controllo substrato (Figura 1)
- Versare circa 10 ml della soluzione di NP-substrato p appropriato in un serbatoio pipetta e usare una pipetta a 8 canali per aggiungere 150 microlitri della soluzione di substrato per i primi quattro pozzetti di ciascun campione e le due pozzetti di controllo substrato (Figura 1). Notare il tempo come la reazione inizia non appena viene aggiunta la soluzione di substrato.
- Incubare le piastre a temperatura ambiente (22 ° C) per 0,5-4 ore. Tempo di incubazione può variare a seconda del livello di attività in campioni e l'enzima da dosare. Per la maggior parte dei terreni e sedimenti, fosfatasi e β-glucosidasi richiedono tempi di incubazione di 0,5-1,5 ore, mentre NAGase e di altri enzimi richiedono tempi di incubazione di> 2 ore.
- Mentre i test sono incubando preparare chiari 96 pozzetti per leggere l'assorbanza. Preparare una micropiastra per ogni blocco Deepwell (vale a dire per ogni enzyme analizzati). Pipettare 10 ml 1 M NaOH e 190 ml di acqua distillata in ciascun pozzetto della micropiastra. Nota: NaOH rallenta la reazione enzimatica e solleva il pH che esalta il colore della NP p rilasciato durante la reazione.
- Dopo l'incubazione, centrifugare i blocchi da 96 pozzetti a 2,000-5,000 xg per 5 minuti per far sedimentare particelle di terreno.
- Utilizzare una pipetta multicanale a ritirare 100 microlitri di ogni bene, facendo attenzione ad evitare il pellet, e trasferirlo al corrispondente bene preparata chiaro micropiastra a 96 pozzetti.
- Accendere il lettore per micropiastre e configurare il software necessario. Record assorbanza a 410 nm. Se l'assorbanza di un particolare bene è superiore al limite di rilevazione lineare del lettore di piastre, che ben diluire 1:1 con acqua e ri-misura. Se assorbanza è ancora troppo elevato, il test deve essere ripetuto con un tempo di incubazione più breve.
4. Determinazione della massa a vuoto dei Campioni
- Pipettare 1 ml di ciascuna sampl e impasto in una teglia di alluminio pre-pesate.
- Secco in un forno di essiccazione a 75 ° C per 48 ore e pesare. Sottrarre il peso della vaschetta da questo valore per ottenere la massa secca di terreno o nel sedimento in 1 ml di slurry. Moltiplicare per un fattore di 0,15 per determinare la massa secca del campione nei 150 microlitri aggiunti a ciascun pozzetto nel saggio enzimatico.
5. Calcolo del Enzyme Activity per lavaggio di massa di terreno o nel sedimento
- Calcola assorbanza finale di ogni campione sottraendo l'assorbanza di controllo campione dalla assorbanza analisi del campione. Se i controlli substrato hanno un elevato assorbimento (circa> 0.060) quindi sottrarre anche quelli.
- Calcola attività enzimatica in μmoles hr -1 g massa secca -1 dall'equazione:
L'attività enzimatica = assorbanza finale / (C x tempo di incubazione x campione secco di massa)
Analisi fluorescente di extracellulare Enzyme Activity in acque naturali
tle "> 1. Preparazione del substrato, Standard e Soluzioni tampone per le analisi fluorimetrica di Enzyme Activity- Preparare 200 pM soluzioni di substrati MUB-collegati (ad esempio 4-MUB-β-glucopiranoside, 4-MUB-fosfato, 4-MUB-N-acetil-β-D-glucosaminide) disciogliendo il substrato adatto in sterile (autoclave) distillata H 2 O in sterili da 15 ml o 50 ml provette da centrifuga. Avvolgere i tubi in alluminio per escludere la luce e conservare in frigorifero prima dell'uso. Substrati devono essere stabili per almeno 1 settimana se conservato in questo modo.
- Preparare uno standard MUB facendo una soluzione stock di 100 micron 4 metilumbelliferone in sterile distillata H 2 O. Conservare in frigorifero in ambra o bottiglia stagnola avvolto. Immediatamente prima dell'uso, diluire la soluzione 100 mM stock di 1/10 in H 2 O sterile per ottenere una soluzione di lavoro di 10 pM per saggi enzimatici.
- Preparare una soluzione stock di 100 mM tampone bicarbonato sciogliendo 8,4 g di NaHCO <sub> 3 in 1 LH 2 O e autoclave. Diluire questa soluzione a 1/20 in H 2 O sterile come necessario per ottenere una soluzione di lavoro di 5 mm per saggi enzimatici.
2. Organizzazione di campioni di acqua su un 96-Well Nero micropiastre
- Organizzare una micropiastra per ciascun enzima seguendo l'esempio illustrato nella Figura 2. Si noti che consenta replica adeguata, standard e controlli, questa procedura può saggiare l'attività di un singolo enzima fino a nove campioni di acqua su una micropiastra a 96 pozzetti nero.
- Versare circa 5 ml del primo campione in un serbatoio pipetta e usare una pipetta a 8 canali per pipette200 microlitri in tutti i pozzetti nella colonna 1 della micropiastra (s). Eliminare i puntali delle pipette usate e ripetere se necessario per ogni campione di acqua per riempire le colonne 1-9.
3. Impostazione di Campione, standard, spegnere, e controlli substrato
- Impostare i controlli per tenere conto di campioni, standards, substrato e tempra sulla stessa micropiastra nero come i campioni (Figura 2).
- Controlli a campione contengono acqua campione e tampone bicarbonato, e non vengono utilizzati nei calcoli di attività, ma dimostreranno la lettura coerenza in tutto il corso dell'esperimento. I controlli quench consistono di acqua campione e una quantità standard del tag fluorescente e sono utilizzati per misurare la diffrazione di fluorescenza in acqua campione. Substrato e controlli standard sono costituiti da tampone o-substrato collegato o l'etichetta fluorescente norma, rispettivamente, e bicarbonato.
- Versare circa 5 ml di 5 mM tampone bicarbonato in un serbatoio pipetta pulita. Pipettare 50 ml di tampone nei pozzetti da 1 a 9 nelle righe D ed E per formare due replicare pozzetti di controlli a campione per campione. Ha Cambia pipette poi trasferire 200 ml di tampone bicarbonato per pozzi da 10 a 12 nelle righe A e H.
- Ridurre l'illuminazione ambiente attenuando o spegnendo lillum na come standard fluorescente è sensibile alla luce.
- Versare circa 5 ml di 10 mM 4-metilumbelliferone in un serbatoio pipetta pulita. Dispensare 50 ml nei pozzetti da 1 a 12 in fila H, e in pozzi da 1 a 9 in righe G e F per formare tre repliche di controlli tempra per campione e controlli generali standard. O mettere la micropiastra al buio o coprire con un coperchio opaco per ridurre il degrado luce del MUB.
- Accendere il fluorimetro e set-up tutti i software necessari per essere pronto a leggere prima di aggiungere il substrato. Nota: alcuni bulbi fluorometro possono richiedere un tempo di warm-up di 3 minuti o più.
- Versare circa 5 ml di substrato appropriato MUB-linked (ad esempio 4-MUB-fosfato) in un serbatoio pipetta pulita. Utilizzare una pipetta a 12 canali per pipettare 50 ml in pozzetti da 1 a 12 nella riga A, e in pozzi da 1 a 9 nelle righe B e C per formare tre test ripetuti per ogni campione e tre controlli substrato. IMMEDIATAMENTEy passare al punto 4.1, fluorescenza registrazione.
4. Fluorescenza di registrazione
- Leggere la fluorescenza iniziale subito dopo l'aggiunta del substrato alla micropiastra. Dopo la lettura di fluorescenza, incubare la micropiastra a temperatura ambiente (22 ° C) o al buio o coperto con un coperchio opaco per ridurre il degrado luce di MUB.
- Il tempo di incubazione richiesta per misurare il potenziale massima dell'attività enzimatica in un campione di acqua dipenderà dalla concentrazione dell'enzima all'interno del campione. Poiché questo è sconosciuto prima della analisi è stata completata, la micropiastra dovrà essere letto a diversi intervalli di tempo. Tipicamente, lettura a intervalli di 10-15 minuti nel corso di 1 ora è accettabile per molti enzimi, anche se i campioni con attività molto alta per alcuni enzimi possono picco prima 10 min.
- Continua a leggere la fluorescenza nella micropiastra agli intervalli indicati per almeno 1 ora. Essere sicuri di mantenere la micropiastra coperto o al buio tra la letturas.
5. Calcolo del Enzyme Activity per volume di acqua
- Per ogni campione in ciascun intervallo di tempo calcolare i: significa fluorescenza campione iniziale (pozzetti D ed E), la fluorescenza del campione finale medio (pozzi AC), la fluorescenza media standard (pozzetti H10-11), e la media estinto controllo fluorescenza (pozzi FG).
- Per ogni intervallo di tempo, calcolare l'attività enzimatica in nmoli hr -1 ml -1 dall'equazione:
L'attività enzimatica = (media del campione fluorescenza - media di fluorescenza del campione iniziale) / ((media fluorescenza / 0,5 mol) x forfettari (media placare il controllo di fluorescenza / dire fluorescenza) x forfettari (0,2 ml) x (tempo in ore))
- Esaminare i valori di attività calcolati per ogni passo temporale. Determinare l'attività potenziale finale dal passo temporale con la più alta attività. Se i valori delle attività continuano ad aumentare poi successive fasi temporali possono essere richiesti, se i valori di attività rientrano througHout il corso della corsa, quindi eseguire nuovamente con intervalli di tempo più brevi. Attività Finale è in nmoli di substrato consumato hr -1 ml -1, ma può essere scalata fino a esprimere come μmoles hr -1 L -1.
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Representative Results
Suoli e sedimenti acquatici in genere hanno apprezzabili livelli di attività enzimatica extracellulare come risultato di comunità microbiche allegate (biofilm) cresce sulla superficie delle particelle. Figura 3 mostra come questa attività cambia a seconda delle dimensioni delle particelle ottenute dal sedimento superficie di un terzo Flusso ordine nel nord del Mississippi, USA. Un precedente studio ha dimostrato che le comunità batteriche sulle particelle di sedimenti da questo flusso possono essere suddivise in tre gruppi distinti sulla base di analisi molecolare della loro struttura comunità: quelli in 0.063 particelle mm, quelli su 0.125, 0,25 e 0,5 millimetri di particelle, e di quelli su 1 millimetro le particelle 15. Analisi dei modelli in attività enzimatica extracellulare supporta questa conclusione, con fosfatasi (figura 3A) essendo simile 0,125, 0,25 e 0,5 millimetri particelle ma molto più alti sui 1 e 0,063 millimetri frazioni misurata utilizzando il p NP-linked tecnica substrato. Oenzimi ther come β-glucosidasi (Figura 3B), e NAGase (Figura 3C) mostrano picchi simili sulle particelle più fini, ma non sono elevati su 1 particelle mm, evidenziando il fatto che diversi enzimi possono mostrare diverse distribuzioni ambientali e questi possono essere chiarito da questo test. Le barre di errore relativamente bassi mostrano che saggi colorimetrici dell'attività enzimatica sui sedimenti sono riproducibili e quindi suscettibili di analisi statistica quando si confrontano i diversi campioni ambientali.
Acque naturali tendono ad avere una minore attività enzimatica extracellulare per ml di suoli o sedimenti fanno per g. Come tali, essi devono essere dosati fluorometrically utilizzando substrati MUB-legati. Figura 4 mostra come l'attività di enzimi fosfatasi (Figura 4A), β-glucosidasi (Figura 4B), e NAGase (Figura 4C) varia con la profondità in un lago poco profondo nel nord del Mississippi, Stati UnitiA. Il lago (Boondoggle Lake) è noto per essere povere di nutrienti 16, che è anche suggerita dalla relativamente elevata attività di fosfatasi (Figura 4A), un enzima che producono microrganismi per acquisire fosfato da composti organici. Per tutti e tre gli enzimi saggiati campioni raccolti alla superficie dell'acqua (0 cm) e 50 cm di profondità hanno mostrato attività simile, mentre l'attività è stata elevata nel campione 100 cm. Questo campione è stato prelevato da essenzialmente all'interfaccia acqua-sedimento, e la presenza di particelle di sedimento nel campione probabilmente rappresenta la maggiore attività visto in questo esempio, soprattutto per β-glucosidasi e NAGase. Come con i substrati p NP, le barre di errore basso mostrano che anche con solo tre letture ripetute, la riproducibilità dei saggi fluorimetrica utilizzando substrati MUB è alto.
Si noti che le unità di Figura 4 sono in nmoli di substrato consumati mentre quelli di Figura 3sono in μmoles di substrato consumato, anche se la dimensioni dell'unità è paragonabile (sia per ml o per g). Ciò evidenzia il fatto che i suoli e sedimenti tendono ad avere attività extracellulare molto superiore acque naturali (attività di ciascun enzima specifico in Figura 3 sono di circa 10-100x superiore alle attività dell'enzima equivalente in Figura 4). Esso mostra anche l'aumento della sensibilità della tecnica substrato MUB-legato, e la necessità di utilizzare questa tecnica per saggiare l'attività enzimatica extracellulare in campioni di acqua.
Figura 1. Layout consigliato di blocchi di 96 pozzetti e profondo per il dosaggio dell'attività enzimatica extracellulare in suoli o sedimenti utilizzando le colorimetriche p s NP-linkedtecnica ubstrate. Ciascun pozzetto dovrebbe ricevere un totale di 300 microlitri, fatta di slurry di esempio, la soluzione di substrato, o tampone acetato a seconda se si tratta di un esempio di esecuzione, controllo di esempio, o il controllo substrato.
Figura 2. Layout consigliato di 96 pozzetti nero micropiastre per il dosaggio dell'attività enzimatica extracellulare nei campioni di acqua con la tecnica substrato MUB-linked fluorometrico. Nove campioni possono essere disposti verticalmente sulla piastra (A) che occupano ciascuna otto pozzi. Questi otto pozzi sono utilizzati per corse campione, controlli a campione, e dissetare i controlli, mentre pozzetti rimanenti sono utilizzati per i controlli del substrato e delle norme MUB (B).
Figura 3. Attività enzimatica extracellulare su diverse dimensioni di particelle di sedimento superficiale raccolti da un piccolo flusso nel nord Mississippi, USA. Ogni frazione granulometrica è stata saggiata per l'attività di fosfatasi (A), β-glucosidasi (B), e NAGase (C) dopo l' p NP-substrato procedura colorimetrica. L'attività è riportato in μmoles substrato consumato hr -1 g di massa secca di sedimenti -1 ed è la media (+ SE) di tre letture ripetute ogni frazione granulometrica.
Figura 4. Attività enzimatica extracellulare in acqua prese a tre differenti profondità (0, 50, e 100 cm) da un lago nel nord Mississippi, USA. acqua era saggiati per l'attività di fosfatasi (A), β-glucosidasi (B), e NAGase (C) a seguito del MUB-substrato Procedura di fluorometric. Attività è segnalata in nmoli substrato consumate h -1 ml di acqua -1 ed è la media (+ SE) di tre letture ripetute per campione.
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Discussion
Determinazione delle attività di una varietà di enzimi extracellulari microbiche in suoli e sedimenti può fornire indicazioni utili in tassi di mineralizzazione dei nutrienti e trasformazione di materia organica 17. Tuttavia, i suoli possono variare nei loro livelli di umidità, quindi è importante standardizzare l'attività di suolo peso secco. Ciò richiede una fase di asciugatura addizionale (tipicamente di due giorni) oltre la semplice misurazione dell'attività enzimatica. Pertanto, a differenza di saggi di attività enzimatica in campioni di acqua che forniscono vicino risultati istantanei, saggi di attività enzimatica affidabili nel suolo e sedimenti richiedere alcuni giorni. Per alcuni terreni, può anche essere più appropriato per esprimere l'attività per grammo di materia organica o di massa secca esente da ceneri, che richiede una fase incenerimento supplementare (in genere 2 ore a 500 ° C) al di là del processo di asciugatura. Indipendentemente, il passo più critico nel saggio colorimetrico di suolo o sedimenti attività enzimatica è il ritiro del surnatante dal blocco profondo bene fopo centrifugazione al termine del periodo di incubazione. Poiché questa procedura si basa sulla misurazione di assorbanza, anche la presenza di alcune particelle di terreno randagi nella micropiastra finale può portare a risultati spuri. Velocità di centrifugazione più elevate (> 5.000 xg) potrebbe contribuire a mitigare questo problema, ma nella nostra esperienza rotori centrifuga che accettano micropiastre di solito hanno dei limiti di rotazione inferiori a tale soglia, ed i blocchi stessi non può tollerare velocità molto più elevate. Essenzialmente, questa fase particolare pipettaggio richiede una combinazione di cura e velocità di utilizzare una pipetta multicanale per trasferire rapidamente la quantità necessaria di supernatante dal blocco profondo bene alla micropiastra.
I saggi di attività enzimatica extracellulare in campioni di acqua hanno né la necessità di un periodo di essiccazione né la fase di centrifugazione, il secondo perché sia la reazione e la misurazione della fluorescenza del prodotto finale enzima-substrato avvengono nella stessa micropiastra. Come tali, questi unssays sono in genere più veloci e inizialmente può apparire più facile da eseguire. Tuttavia, essi hanno i loro limiti in quanto, ove possibile, lo standard MUB e substrati MUB-collegati non devono essere esposti alla luce. Nella nostra esperienza, oscuramento delle luci il più possibile durante il pipettaggio e incubazione delle micropiastre al buio (o coperto con un coperchio opaco) è una necessità. Poiché questi saggi richiedono anche le piastre da leggere a vari intervalli di tempo, questo si traduce spesso nella necessità di molto rapida commutazione tra le piastre quando saggiando enzimi multipli allo stesso tempo. Ad esempio, al fine di saggiare nove campioni di acqua per l'attività di sei enzimi simultaneamente (cioè utilizzando sei differenti micropiastre), si rende necessario per leggere una piastra ogni 2 min per 1 ora per assicurare che ogni singola piastra viene letto ogni 10 -15 min (in questo caso, ogni 12 min). Si deve prestare attenzione per tenere traccia della piastra particolare la lettura, nonché per garantire che nessun liquido è filtrato from la piastra quest'ultimo viene trasferito in e fuori del fluorimetro micropiastra. Quando saggiare enzimi multipli contemporaneamente, è anche importante tenere conto del tempo che ci vuole per il lettore di micropiastre per leggere effettivamente la piastra e barcollare lettura intervalli di conseguenza. Una preoccupazione finale con il test di fluorescenza dell'attività enzimatica extracellulare in campioni di acqua è quando si lavora con campioni torbidi. I campioni di acqua che contengono particelle in sospensione deve essere agitata prima di versare inizialmente nel serbatoio pipetta e mescolate di nuovo con il ritiro e l'espulsione con la pipetta prima di essere caricato sulla micropiastra. I numeri più alti di particelle in un campione anche in genere si traduce in una maggiore spegnimento del segnale fluorescente, e l'importanza dei controlli tempra per ogni campione non può essere sottolineato abbastanza.
Mentre substrati MUB-e p-NP legate tipicamente mostrano valori massimi simile V per gli enzimi ambientali, i valori di K mpossono differire, ed enzimi come β-glucosidasi e fosfatasi possano presentare una maggiore affinità per substrati MUB-legati di loro p NP-linked analoghi 14. Pertanto, i substrati MUB-linked sono suscettibili di essere più sensibili di quelli legati alla p NP, il che suggerisce che sarebbe una scelta migliore da adottare quando si misura l'attività enzimatica in suoli e sedimenti. Tuttavia il prodotto finale fluorogenico che viene misurato durante i saggi MUB è soggetto a potenziale tempra in alcuni estratti del suolo, e le letture di fluorescenza può essere instabile nel tempo 12. Suoli e sedimenti tendono anche ad avere maggiore attività enzimatica extracellulare di acque naturali, in modo che la maggiore sensibilità dei fluorimetrici saggi MUB-linked possono offrire poco vantaggio rispetto ai metodi p NP colorimetrici dati i potenziali problemi con spegnimento quando si analizzano alcuni suoli. Come nota a margine, i substrati NP-linked p e lo standard p NP si sono generalmente più affordaBLE rispetto ai loro omologhi MUB; un ulteriore motivo per il loro utilizzo, se si applicano restrizioni di bilancio.
Forse l'aspetto più importante di poter saggiare microbica attività enzimatica extracellulare in ambienti acquatici e terrestri è che, mentre queste tecniche misurano processi fisiologici microbici, questi processi hanno un'influenza diretta sulle trasformazioni a livello di ecosistema di carbonio e sostanze nutritive. Tempi di decomposizione del materiale organico sono state direttamente connesse con l'attività di cellulasi extracellulari nei sedimenti 18,19, in modo che le misurazioni rapide dell'attività enzimatica potenzialmente facilitare la determinazione istantanea in situ tempi di decomposizione in campioni ambientali. Utilizzando approcci High Throughput micropiastra consente la misurazione simultanea di attività enzimatica in un maggior numero di campioni di approcci più tipici singolo tubo, in modo che la variazione di attività enzimatica (e per estensione nei processi livello di ecosistema) in response a fattori come la profondità di 20 o perturbazioni ambientali 9,21 può essere esaminato. Analogamente, saggi di enzimi coinvolti nel ciclismo nutrienti, quali fosfatasi e NAGase, possono fornire intuizioni scarsità di nutrienti in ambienti specifici, per esempio, l'importanza relativa di fosforo organico in azoto organico durante lo sviluppo del suolo 8.
Poiché le attività enzimatiche sono state misurate in campioni ambientali per oltre 30 anni, il confronto tra gli studi che utilizzano avanzati meta-analisi stanno diventando possibile. Tali studi suggeriscono che, ai tassi scala mondiale, l'attività enzimatica, e quindi della decomposizione della materia organica e mineralizzazione dei nutrienti, sono legati al pH, disponibilità substrato, e stechiometria nutrienti 17. Allo stesso tempo, l'uso di un protocollo su micropiastra ha iniziato a consentire l'analisi di modelli in scala fini dell'attività enzimatica utilizzando tecniche di mappatura geostatistiche 22
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
I finanziamenti per gli aspetti di questo lavoro è stato fornito da varie fonti tra cui il Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti specifico Accordo Cooperativo 58-6408-1-595 e la National Science Foundation (premio 1.049.911).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS AND MATERIALS | |||
| Glacial acetic acid | Various suppliers | ||
| Sodium acetate | Various suppliers | ||
| Sodium hydroxide | Various suppliers | ||
| p-Nitrophenol | Fisher | BP612-1 | Alternates available |
| p-Nitrophenyl (pNP)-phosphate | Sigma | N3234 | pNP-substrate |
| pNP-β-glucopyranoside | Sigma | N7006 | pNP-substrate |
| pNP-β-N-acetylglucosaminide | Sigma | N9376 | pNP-substrate |
| Clear 96-well microplates | Fisher | 12-563-301 | Alternates available |
| 96-well deep well blocks | Costar | 3958 | Alternates available |
| Aluminum weigh pans | Various suppliers | ||
| Sterile 15 ml centrifuge tubes | Various suppliers | ||
| Sterile 50 ml centrifuge tubes | Various suppliers | ||
| 4-Methylumbelliferone | Sigma | M1381 | |
| 4-Methylumbelliferyl (MUB)-phosphate | Sigma | M8883 | MUB-substrate |
| 4-MUB-glucopyranoside | Sigma | M3633 | MUB-substrate |
| 4-MUB-N-acetylglucosaminide | Sigma | M2133 | MUB-substrate |
| Sodium bicarbonate | Various suppliers | ||
| Black 96-well microplate | Costar | 3792 | |
| Pipette reservoir | Various suppliers | ||
| EQUIPMENT | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Centrifuge rotor | Eppendorf | A-4-81 | For microplates/deep-well blocks |
| Microplate reader | BioTek | Synergy HT | Alternates available |
| Microplate fluorometer | BioTek | FLx 800 | Alternates available |
| 8-channel pipettor | Various suppliers | ||
References
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- Sinsabaugh, R. L., Antibus, R. K., Linkins, A. E., Mclaugherty, C. A., Rayburn, L., Repert, D., Weiland, T. Wood decomposition over a first-order watershed: mass loss as a function of lignocellulase activity. Soil biology and biochemistry. 24, 743-749 (1992).
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