Summary
Mikro baserade förfaranden beskrivs för kolorimetrisk eller fluorometrisk analys av extracellulär enzymaktivitet. Dessa förfaranden möjliggör en snabb analys av sådan verksamhet i ett stort antal miljöprover inom en hanterbar tidsram.
Abstract
En stor del av näringsomsättning och kol bearbetning i naturliga miljöer sker genom verksamheten vid extracellulära enzymer som frigörs av mikroorganismer. Således kan mäta aktiviteten av dessa extracellulära enzymer ge insikter i andelen ekosystem nivå processer, exempelvis nedbrytningen av organiskt material eller kväve-och fosformineralisering. Analyser av extracellulär enzymaktivitet i miljöprover vanligtvis att utsätta proverna till artificiella kolorimetriska eller fluorometriska substrat och spåra takten substrathydrolys. Här beskriver vi mikrobaserade metoder för dessa förfaranden som tillåter analys av ett stort antal prover inom en kort tidsram. Prover tilläts reagera med artificiella substrat inom 96-brunnars mikroplattor eller djup brunn mikro block, och enzymaktiviteten bestäms därefter genom absorption eller fluorescens av den resulterande slutprodukten med användning av en typisk mikrotiterplatta Reader eller fluorometer. Sådana hög genomströmning förfaranden inte bara underlätta jämförelser mellan rumsligt skilda platser eller ekosystem, men också avsevärt minska kostnaderna för sådana analyser genom att minska de totala reagensvolymer som behövs per prov.
Introduction
Mikroorganismer, såsom bakterier och svampar erhålla näringsämnen och kol från komplexa organiska föreningar genom produktionen av extracellulära enzymer. Dessa enzymer hydrolyserar vanligen polymerer i mindre subenheter som kan tas in i cellen. Därför, på en ekologisk nivå, dessa mikrobiella extracellulära enzymer är ansvariga för mycket av närings mineralisering och nedbrytningen av organiskt material som förekommer i naturliga miljöer. Enzymer såsom cellobiohydrolas (CBH) och β-glukosidas är viktiga för cellulosanedbrytning och arbetar unisont för att katalysera hydrolysen av cellulosa till glukos 1,2, vilket ger ett användbart kolsubstrat för mikrobiell upptag och assimilering. Enzymet fosfatas släpper lösliga oorganiska fosfatgrupper från organiska fosforföreningar, huvudsakligen mineraliserings fosfat och göra den tillgänglig för användning av de flesta organismer 3. Andra enzymer, såsom N-acetylglukosaminidas (NAGas), är important i kitin nedbrytning och kan göra både kol och kväve för mikrobiell förvärv 4.
En av metoderna för analys av mikrobiell extracellulär enzymaktivitet i naturliga miljöer är att använda konstgjorda p-nitrofenyl (p NP) länkade substrat, en metod som ursprungligen utvecklades för att upptäcka jord fosfatasaktivitet 5. Detta tillvägagångssätt förlitar sig på detektion av en färgad slutprodukt, p-nitrofenol, som frigörs när det artificiella substratet hydrolyseras av ett lämpligt enzym. Den p-nitrofenol kan därefter kvantifieras kolorimetriskt genom att mäta dess absorbans vid ca 400-410 nm. Metoden har sedan använts för att upptäcka andra enzymer såsom NAGas 6, och har använts i olika studier att titta på mikrobiell cellulära enzymaktivitet i mark och sediment 7-9.
Ett alternativt tillvägagångssätt som var originally utvecklats för att bedöma cellulära glukosidasaktivitet i vattenmiljöer 10,11 använder sig av 4-metylumbelliferon (MUB) länkade substrat. Slutprodukten släpps (4-metylumbelliferon) är mycket fluorescerande och kan detekteras med användning av en fluorometer med excitering / emission inställning runt 360/460 nm. En mångfald MUB-länkade artificiella substrat finns tillgängliga, vilket medger den fluorometriska mätningen av aktiviteten av åtminstone så många enzymer (t.ex. β-glukosidas, cellobiohydrolas, Nagase, fosfatas) som kan analyseras med användning av p NP-substrat kolorimetrisk procedur. Andra mikrobiella extracellulära enzymer, såsom proteinnedbrytande leucinaminopeptidas, kan analyseras fluorometriskt med användning av 7-amino-4-metylkumarin (COU) kopplade substrat. Både MUB-och COU-länkade substrat har använts för att bestämma enzymaktivitet i olika land-och vattenmiljöer prover 12,13.
Även tidigare studier har described fluorometriska eller kolorimetrisk mikro metoder för att bestämma cellulära enzymaktivitet 14, det finns ett behov av en tydlig redovisning av hur man genomför sådana analyser. Här visar vi rutiner för hög genomströmning mikrotekniker för analys av extracellulär enzymaktivitet i mark och sediment med hjälp av kolorimetriska p NP bundna substrat strategi och i naturliga vatten med hjälp av fluorescerande MUB bundna substrat teknik. Vi fokuserar på mätning av verksamheten i β-glukosidas, NAGas, och fosfatas eftersom dessa enzymer kan knytas till kol, kväve och fosfor cykling, respektive. Emellertid kan de förfaranden som beskrivs här tillämpas på mätning av andra extracellulära enzymer med användning av olika artificiella substrat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Kolorimetrisk analys av extracellulärt enzym aktivitet i mark och sediment
1. Beredning av substrat och buffertlösningar för Kolorimetriska analyser av enzymaktivitet
- Förbered 50 mM acetatbuffert (pH 5,0 till 5,5) genom att blanda 50 ml 0,1 M ättiksyra (2,87 ml isättika i 500 ml vatten), 150 ml 0,1 M natriumacetat och 200 ml destillerat H2O Justera pH till 5,0-5,5 med 0,1 M ättiksyra vid behov.
- Bered en lösning av 1 M natriumhydroxid (NaOH) i destillerat H2O
- Förbered p NP bunden substratlösningar i 50 mM acetatbuffert. För att analysera fosfatas förbereda 5 mM p NP-fosfat i 50 mM acetatbuffert, att analysera β-glukosidas förbereda 5 mM p NP-β-glukopyranosid, att analysera NAGas förbereda 2 mM pNP-β-N-acetylglucosaminide. Förbered alla substrat lösningar i sterila 15 ml eller 50 ml centrifugrör. Lösningar kan förvaras vid 4 ° C i 2-3 veckor.
2. Fastställande av en standard för att konvertera Absorbans till p NP Koncentration
- Bered standardlösningar av p-nitrofenol i 50 mM acetatbuffert. Koncentrationerna bör variera 0,025-1 mM.
- Överför tre replikat av 100 pl av varje koncentration till en klar 96-håls mikroplatta. Tillsätt 10 | il 1 M NaOH och 190 | al destillerat H2O till varje brunn.
- Record-absorbans vid 410 nm med användning av en mikroplattläsare.
- Multiplicera koncentrationer i standardkurvan med 0,3 för att få umol p NP per 300 pl reaktionsvolym. Rita en kurva av absorbansen mot umol p NP. Lutningen på kurvan fungerar som den omräkningsfaktor (C) som kommer att avse absorbansen att umol p NP i varje enzymreaktionen.
3. Utförande av den enzymanalys
- För jord, beredning av en uppslamning av varje prov som skall analyseras i ett sterilt 15 ml centrifugrör vid ett concentration om cirka 1 g / ml -1 använder 50 mM acetatbuffert. För sediment, tillsätt tillräckligt acetatbuffert för att göra slammet lätt pipettable. Den exakta volymen av uppslamningen som behövs kommer att variera beroende på vilket antal enzymer analyserades, men ett minimum på 5 ml. Vortex varje slurry tills alla klumpar av jord eller sediment har spridda och notera den slutliga volymen.
- Åter virvel varje uppslamning och omedelbart pipettera 150 pl i vardera av sex brunnar på en 96-brunnars Deepwell block (figur 1). Det är viktigt att vortexa grundligt och ofta för att hålla jordpartiklar i suspension. Lämna minst två brunnar per block tomma för att tjäna som substrat kontroll. Notera: klipp slutet av pipettspetsar med sax innan pipettering som jord slam tenderar att täppa tips. Bered en 96-brunnsblock för varje enzym som skall analyseras.
- Häll i ca 5 ml acetatbuffert i en pipett reservoar och använda en 8-kanals pipett för att lägga till 150 | il av bufferten till last två brunnar av varje prov (dessa kommer att vara provbuffert kontroller) och de två substratkontrollbrunnarna (Figur 1)
- Häll ca 10 ml av den lämpliga p NP-substratlösningen till en pipett reservoar och använda en 8-kanals pipett för att lägga till 150 pl av substratlösning till de första fyra brunnar för varje prov och de två substratkontrollbrunnarna (Figur 1). Notera den tid som reaktionen startar så snart som substratlösningen tillsätts.
- Inkubera plattorna vid rumstemperatur (22 ° C) under 0,5 till 4 timmar. Exakt inkubationstid varierar beroende på aktivitetsnivå i prover och enzymet som skall analyseras. För de flesta jordar och sediment, fosfatas-och β-glukosidas kräver inkubationstider på 0,5-1,5 tim, medan NAGas och andra enzymer kräver inkubationstider av> 2 tim.
- Även analyser inkubation förbereda klar 96-håls mikro att läsa absorbansen. Förbered en mikroplatta för varje Deepwell blocket (dvs. för varje enzyme analyseras). Pipettera 10 | il 1 M NaOH och 190 | al destillerat vatten till varje brunn i mikroplattan. Anm: NaOH saktar den enzymatiska reaktionen och höjer pH som förstärker färgen på p NP frigörs under reaktionen.
- Efter inkubation centrifugeras 96-brunnsblock vid 2000-5000 x g under 5 min för att pelletera jordpartiklar.
- Använd en flerkanalspipett att återkalla 100 l från varje brunn, var noga med att undvika att pellets, och överföra den till motsvarande väl på förberedd klar 96 brunnar mikro.
- Slå på mikroplattläsare och ställa in alla nödvändiga program. Record-absorbans vid 410 nm. Om absorbansen av en speciell väl är över den linjära detektionsgränsen för den plattläsare, späd att väl 1:01 med vatten och re-åtgärd. Om absorbansen är fortfarande för hög, bör analysen upprepas med en kortare inkubationstid.
4. Fastställande av torr massa av prover
- Pipettera 1 ml av varje sampl e slam i en i förväg vägd aluminiumpanna.
- Torka i en 75 ° C torkugn under 48 h och vägs därefter. Subtrahera vikten av pannan från detta värde för att få torrvikt jord eller sediment i 1 ml av slammet. Multiplicera med en faktor på 0,15 för att bestämma torrvikt prov på 150 l läggs till varje brunn i enzymanalysen.
5. Beräkning av enzymaktivitet per torrvikt jord eller sediment
- Beräkna slutligt absorbansen för varje prov genom att subtrahera kontrollprovet absorbans från provanalys absorbans. Om substratkontroller har hög absorbans (ungefär> 0,060) sedan subtrahera dem också.
- Beräkna enzymaktivitet i mikromol hr -1 g torrvikt -1 från ekvationen:
Enzymaktivitet = Slut absorbans / (C x inkubationstid x prov torrvikt)
Fluorescerande analys av extracellulärt enzym aktivitet i naturliga vatten
tle "> 1. Beredning av substrat, Standard, och buffertlösningar för fluorometriska Analyser av enzymaktivitet- Bered 200 pM lösningar av MUB-bundna substrat (t ex 4-MUB-β-glukopyranosid, 4-MUB-fosfat, 4-MUB-N-acetyl-β-D-glukosaminid) genom upplösning av det lämpliga substratet i steril (autoklaverad) destillerat H2O i sterila 15 ml eller 50 ml centrifugrör. Wrap rör i aluminiumfolie för att utesluta ljus och förvara i kylskåp före användning. Substrat skall vara stabil i minst 1 vecka om den förvaras på det här sättet.
- Bered en MUB standard genom att göra en förrådslösning av 100 | iM 4-metylumbelliferon i sterilt destillerat H2O Förvara i kylskåp i bärnsten eller folie förpackade flaskan. Omedelbart före användning späddes 100 | iM förrådslösning av 1/10 i sterilt H2O för att göra en arbetslösning av 10 pM för enzymanalyser.
- Bered en förrådslösning av 100 mM bikarbonat-buffert genom upplösning av 8,4 g NaHCOa <sub> 3 in 1 LH 2 O och autoklavering. Späd denna stamlösning 1/20 i steril H 2 O som behövs för att göra en arbetslösning av 5 mM för enzymanalyser.
2. Ordna vattenprover på en 96-brunnars svart Microplate
- Organisera en mikroplatta för varje enzym efter det som visas i figur 2 exempel. Observera att tillåta adekvat replikering, standarder och kontroller, kan denna procedur analysera aktiviteten av ett enzym för upp till nio vattenprover på en 96-väl svart mikroplatta.
- Häll ca 5 ml av det första provet i en pipett reservoar och använda en 8-kanals pipett till pipette200 pl i alla brunnar i kolumn 1 i mikro (s). Kasta använda pipettspetsar och upprepa efter behov för varje vattenprov för att fylla spalter 1-9.
3. Ställa in Sample, Standard, Släcka, och substrat Controls
- Ställ in kontroller för att redogöra för prover, standards, substrat och härdning på samma svart mikroplatta som proverna (Figur 2).
- Prov kontroller innehåller prov vatten och bikarbonat buffert, och används inte i verksamhetsberäkningar men kommer att visa läsning konsekvent under hela experimentet. Kontrollerna dämpningen består av vattenprov och ett standardbelopp på den fluorescerande etikett och används för att mäta diffraktion av fluorescens i vattenprovet. Substrat och standardkontroller är uppbyggda av antingen substratbunden eller standarden fluorescerande markör, respektive, och bikarbonatbuffert.
- Häll ca 5 ml 5 mM bikarbonat buffert i en ren pipett reservoar. Pipettera 50 | il buffert till brunnarna 1 till 9 i rader D och E för att bilda två replikera brunnar i prov kontroller per prov. Byt pipettspetsar överför sedan 200 l av bikarbonat buffert i brunnarna 10 till 12 i rader A och H.
- Minska omgivande ljus genom dimma eller stänga av lights som fluorescerande standard är ljuskänsligt.
- Häll ca 5 ml 10 ^ M 4-metylumbelliferon i en ren pipett reservoar. Överför 50 pl i brunnarna 1 till 12 i rad H, och i brunnar 1 till 9 i rad G och F för att bilda tre replikat av dämpningen kontroller per prov och övergripande kontroller standard. Antingen placera mikro i mörker eller täcka med en ogenomskinlig lock för att minska ljus nedbrytning av MUB.
- Slå på fluorometern och ställa in alla nödvändiga program för att vara redo att läsa innan du lägger på underlaget. Obs: vissa fluorometerenheter lökar kan kräva en uppvärmningstid av 3 min eller mer.
- Häll i ca 5 ml av den lämpliga MUB bundet substrat (t.ex. 4-MUB-fosfat) till en ren pipett reservoar. Använd en 12-kanals pipett för att pipettera 50 | il i brunnarna 1 genom 12 i rad A och in i brunnarna 1 till 9 i raderna B och C för att bilda tre upprepade analyser för varje prov och tre substrat kontroller. Immediately vidare till steg 4.1, inspelning fluorescens.
4. Inspelning Fluorescens
- Läs den ursprungliga fluorescens omedelbart efter substrat förutom mikroplattan. Efter att ha läst fluorescens, inkubera mikroplattan vid RT (22 ° C) antingen i mörker eller täckta med ett ogenomskinligt lock för att minska ljusnedbrytning av MUB.
- Den inkubationstid som krävs för att mäta den maximala potentiella enzymaktivitet i ett vattenprov som beror på enzymkoncentrationen i provet. Eftersom detta är okänt före analysen är slutförd kommer mikroplattan måste läsas på flera tidssteg. Vanligtvis läser i intervall om 10-15 minuter under loppet av 1 timme är acceptabelt för många enzymer, även om prover med mycket hög aktivitet för vissa enzymer kan kulminera före 10 min.
- Fortsätt läsa fluorescens i mikroplattan vid dina utsedda intervaller i minst 1 timme. Se till att hålla mikroplattan täcks eller i mörker mellan läsninger.
5. Beräkning av enzymaktivitet per volym vatten
- För varje prov vid varje tidsintervall beräkna: menar första urvalet fluorescens (brunnar D och E), den genomsnittliga sista provet fluorescens (brunnar AC), den genomsnittliga standard fluorescens (brunnar H10-11), och den genomsnittliga släcka kontroll fluorescens (brunnar FG).
- För varje tidsintervall, beräkna enzymaktivitet i nmol hr -1 ml -1 ur ekvationen:
Enzymaktivitet = (medelvärde provfluorescens - betyda initial prov fluorescens) / ((medelvärde standard fluorescens / 0,5 mol) x (medelvärde släcka kontroll fluorescens / medelvärde standard fluorescens) x (0,2 ml) x (tid i timmar))
- Undersök aktivitetsvärden som beräknas för varje tidssteg. Bestäm slutlig potentiell aktivitet från tidssteg med den högsta aktiviteten. Om aktivitetsvärden fortsätter att öka sedan senare tidssteg kan behövas, om aktivitetsvärden faller rakt igenomHout loppet av körningen, kör sedan igen med kortare tidssteg. Slut aktivitet i nmol substrat konsumeras hr -1 ml -1 men kan skalas upp för att uttrycka som fimol hr -1 L -1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Jord-och vattensediment har normalt betydande halter av extracellulär enzymaktivitet till följd av bifogade mikrobiella samhällen (biofilmer) som växer på ytan av partiklar Figur 3 visar hur denna verksamhet varierar beroende på storleken av partiklar som erhållits från ytsediment av en tredje. För ström i norra Mississippi, USA. En tidigare studie har visat att bakteriesamhällen på sedimentpartiklar från denna ström kan delas in i tre olika grupper baserat på molekylär analys av deras samhällsstrukturen: de på 0.063 mm partiklar, de på 0,125, 0,25 och 0,5 mm partiklar, och de på 1 mm partiklar 15. Analys av mönster i extracellulär enzymaktivitet stöder denna slutsats, med fosfatas (Figur 3A) är liknande på 0,125, 0,25 och 0,5 mm partiklar men mycket högre på 1 och 0.063 mm fraktioner mätt med hjälp av p NP bundna substratteknik. Ovriga enzymer såsom β-glukosidas (Figur 3B), och NAGas (figur 3C) visar liknande toppar på de finaste partiklarna, men är inte förhöjd på 1 mm partiklar, belyser det faktum att olika enzymer kan visa olika miljö distributioner och dessa kan vara belysas med hjälp av denna analys. Staplarna relativt låga fel visar att kolorimetriska analyser av enzymaktivitet på sediment är reproducerbara och därmed mottagliga för statistisk analys när man jämför olika miljöprover.
Naturliga vatten tenderar att ha lägre extracellulär enzymaktivitet per ml än mark och sediment gör per gram. Som sådana bör de analyseras fluorometriskt med användning MUB-bundna substrat. Figur 4 visar hur aktiviteten av enzymer fosfatas (Figur 4A), β-glukosidas (Figur 4B), och NAGas (Figur 4C) varierar med djupet i en grund sjö i norra Mississippi, USAA. sjö (Boondoggle Lake) är känt för att vara näringsfattiga 16, vilket också antyds av den relativt höga aktiviteten hos fosfatas (Figur 4A), ett enzym som mikroorganismer producera för att förvärva fosfat från organiska föreningar. För alla tre enzymerna analyserade prover som samlats in vid vattenytan (0 cm) och 50 cm djup visade liknande aktivitet, medan aktiviteten höjdes i 100 cm provet. Detta prov var i huvudsak tagen från den vattensediment gränssnitt, och närvaron av sedimentpartiklar i provet svarar troligen för den högre aktiviteten ses i detta prov, speciellt för β-glukosidas och NAGas. Som med de p NP substrat, barerna låg fel visar att även med bara tre likadana avläsningar, är hög reproducerbarhet av fluorometriska analyser med hjälp MUB substrat.
Observera att enheter för figur 4 är i nmol substrat konsumeras medan de för figur 3är i ^ mol substrat förbrukas, även om enhetsstorlek är jämförbar (antingen per ml eller per g). Detta belyser det faktum att mark och sediment tenderar att ha mycket högre extracellulär aktivitet än naturliga vatten (verksamheten i varje specifikt enzym i figur 3 är ungefär 10-100x högre än verksamheten i motsvarande enzym i Figur 4). Det visar också den ökade känsligheten hos MUB bunden substratteknik, och nödvändigheten av att använda denna teknik för analys av extracellulär enzymaktivitet i vattenprover.
Figur 1. Förslag på layout av 96-väl djupt borrhål block för analysen av extracellulär enzymaktivitet i mark eller sediment med hjälp av kolorimetriska p NP bundna substrate teknik. Varje brunn bör få totalt 300 pl, bestående av prov uppslamning, substratlösning, eller acetatbuffert beroende på huruvida det är en provkörning, kontrollprov, eller substrat kontroll.
Figur 2. Förslag på layout av 96-väl svart mikroplattor för analysen av extracellulär enzymaktivitet i vattenprover med hjälp av fluorometriska MUB bundna substratteknik. Nio prover kan ordnas vertikalt på plattan (A) var och en upptar åtta brunnar. Dessa åtta brunnar används för provkörningar, provkontroller, och släcka kontroller medan resterande brunnar används för substrat kontroller och MUB standarder (B).
Figur 3. Extracellulär enzymaktiviteten på olika storlekar av ytansedimentpartiklar som samlats in från en liten ström i norr Mississippi, USA. Varje partikelstorleksfraktion analyserades för aktiviteten av fosfatas (A), β-glukosidas (B), och NAGas (C) efter den p NP-substrat kolorimetrisk procedur. Aktivitet redovisas i mikromol substrat konsumeras hr -1 g torrvikt sediment -1 och är medelvärdet (+ SE) tre likadana avläsningar per partikelstorleksfraktion.
Figur 4. Extracellulär enzymaktivitet i vatten tas vid tre difka djup (0, 50, och 100 cm) från en grund sjö i norr Mississippi, USA. Vatten analyserades för aktiviteten av fosfatas (A), β-glukosidas (B), och NAGas (C) efter den MUB-substrat fluorometrisk procedur. Aktivitet redovisas i nmol substrat konsumeras h -1 ml vatten -1 och är medelvärdet (+ SE) tre likadana avläsningar per prov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fastställande av aktiviteten av en mängd olika mikrobiella cellulära enzymer i mark och sediment kan ge värdefulla insikter om andelen näringsämnen mineralisering och organiskt material bearbetning 17. Emellertid kan jordar varierar i sina fuktnivåer, så det är viktigt att standardisera aktivitet till jord torrvikt. Detta kräver ett ytterligare torkningssteg (typiskt av två dagar) utöver att bara mätning av enzymaktivitet. Således, i motsats till analyser av enzymaktivitet i vattenprover som ger nära momentana resultat, pålitliga analyser av enzymaktivitet i jord och sediment ta några dagar. För vissa jordar kan det till och med vara mer lämpligt att uttrycka aktivitet per gram organiskt material eller askfri torrvikt, som kräver ett ytterligare inaskning steg (vanligen 2 timmar vid 500 ° C) bortom torkförfarandet. Oavsett, är det mest kritiska steget i den kolorimetriska analysen av jord eller sediment enzymaktivitet indragning av supernatanten från djupa brunnar blockera ffter centrifugering vid slutet av inkubationsperioden. Eftersom detta förfarande bygger på mätning av absorbans, kan till och med förekomsten av några herrelösa jordpartiklar i den slutliga mikro leda till falska resultat. Högre centrifugeringshastighet (> 5.000 xg) skulle kunna bidra till att mildra detta problem, men vår erfarenhet centrifugrotorer som accepterar mikroplattor vanligtvis har roterande gränser under denna tröskel, och blocken själva kanske inte tolerera mycket högre hastigheter. I huvudsak kräver denna speciella pipetteringssteg en kombination av vård och hastighet för att använda en flerkanalig pipett för att snabbt överföra den erforderliga mängden av supernatanten från den djupa brunnar block till mikroplattan.
Analyser av extracellulär enzymaktivitet i vattenprover varken har behov av en torkningsperiod eller centrifugeringssteget, varvid den senare eftersom både enzym-substrat-reaktionen och mätning av fluorescensen av slutprodukten sker i samma mikroplatta. Som sådana dessa enssays är oftast snabbare och kan inledningsvis verkar lättare att köra. Men de har sina egna begränsningar i det, när det är möjligt, bör MUB standard och MUB-länkade substrat inte utsättas för ljus. I vår erfarenhet, mörkläggning lamporna lika mycket en möjlighet under pipettering och inkubera mikro i mörker (eller täckt med ett ogenomskinligt lock) är en nödvändighet. Eftersom dessa analyser kräver även plattorna som skall läsas vid flera tidpunkter, ofta resulterar detta i att det behövs en mycket snabb växling mellan plattorna vid analys av ett flertal enzymer samtidigt. Till exempel, i syfte att analysera nio vattenprover för aktiviteten av sex enzymer samtidigt (dvs. med användning av sex olika mikroplattor), blir det nödvändigt att läsa en platta varje 2 min under 1 h, för att säkerställa att varje enskild platta avläses varje 10 -15 min (i det här fallet var 12 min). Man måste vara försiktig för att hålla reda på den speciella plattan läses, samt att se till att ingen vätska spills tillbakam plattan när den överförs till och från mikroplattan fluorometer. Vid analys av ett flertal enzymer på en gång, är det också viktigt att tänka på den tid som det tar för mikroplattläsare för att faktiskt läsa plattan och att sprida läsa intervaller därefter. Ett sista problem med den fluorescerande analys av extracellulär enzymaktivitet i vattenprover är vid arbete med prover som är grumliga. Vattenprover som innehåller suspenderade partiklar skall skakas innan initialt häller i pipetten behållaren och blandas på nytt genom att dra tillbaka och mata ut med pipetten innan det lastas på mikroplattan. Högre tal av partiklar i ett prov som också typiskt resulterar i större dämpning av den fluorescerande signalen, och vikten av härdningskontroll för varje prov kan inte nog betonas.
Medan MUB-och p NP-länkade substrat visar vanligtvis liknande V-max värden för miljö enzymer, K m-värdenkan skilja sig åt, och enzymer såsom β-glukosidaser och fosfataser kan ha högre affinitet för MUB bundna substrat än deras p NP bundna analoger 14. Därför MUB-länkade substrat sannolikt är känsligare än de som kopplas till p NP, vilket tyder på att de skulle vara ett bättre val för att använda vid mätning av enzymaktivitet i mark och sediment. Men det fluorogena slutprodukten som mäts under MUB analyser är föremål för potentiell släckning i vissa jordextrakt, och fluorescens avläsningar kan vara instabil över tiden 12. Mark och sediment också tenderar att ha högre extracellulär enzymaktivitet än naturliga vatten, så den ökade känsligheten hos de fluorometriska MUB-länkade analyser kan erbjuda lite fördel över de kolorimetriska p NP metoder med tanke på de potentiella problemen med släckning vid analys av vissa jordar. Som en liten not, p NP bundna substrat och p NP själva standarden är generellt mer affordaligt än sina MUB motsvarigheter, ytterligare ett skäl för deras användning om budgetbegränsningar gäller.
Den kanske viktigaste aspekten av att kunna analysera mikrobiell cellulära enzymaktivitet i akvatiska och terrestra miljöer är att medan dessa tekniker mäter mikrobiella fysiologiska processer, dessa processer har en direkt påverkan på ekosystemnivå omvandlingar av kol och näringsämnen. Priser på nedbrytningen av organiskt material har direkt samband med den verksamhet av extracellulära cellulaser i sediment 18,19, så att snabba mätningar av enzymaktivitet potentiellt lättare att fastställa momentana in situ nedbrytningshastigheten i miljöprover. Med hjälp av hög genomströmning mikro metoder möjliggör samtidig mätning av enzymaktivitet i större antal prover än mer typiska enda rör metoder, så att variation i enzymaktivitet (och i förlängningen i ekosystemnivå processer) i response till faktorer såsom djup 20 eller miljömässiga störningar 9,21 kan undersökas. Likaså analyser av enzymer involverade i näringscykler, såsom fosfatas och NAGas, kan ge insikter i näringsbegränsning i specifika miljöer, till exempel, den relativa betydelsen av organisk fosfor till organiskt kväve under markutveckling 8.
Eftersom enzymaktiviteter har uppmätts i miljöprover i över trettio år, är jämförelser mellan studier med avancerade metaanalyser blir nu möjlig. Sådana studier tyder på att, på global skala, enzymaktivitet, och därför klassar av nedbrytningen av organiskt material och näringsämnen mineralisering, är knutna till pH, substrat tillgänglighet och närings stökiometri 17. Samtidigt har användningen av en mikroplattbaserat protokoll börjat att medge analys av finskaliga mönster i enzymaktivitet med användning av geostatistiska kartläggningstekniker 22
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Finansieringen för delar av detta arbete kom från olika källor inklusive Förenta staternas Department of Agriculture Specifik kooperativa avtal 58-6408-1-595 och National Science Foundation (utmärkelse 1.049.911).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS AND MATERIALS | |||
| Glacial acetic acid | Various suppliers | ||
| Sodium acetate | Various suppliers | ||
| Sodium hydroxide | Various suppliers | ||
| p-Nitrophenol | Fisher | BP612-1 | Alternates available |
| p-Nitrophenyl (pNP)-phosphate | Sigma | N3234 | pNP-substrate |
| pNP-β-glucopyranoside | Sigma | N7006 | pNP-substrate |
| pNP-β-N-acetylglucosaminide | Sigma | N9376 | pNP-substrate |
| Clear 96-well microplates | Fisher | 12-563-301 | Alternates available |
| 96-well deep well blocks | Costar | 3958 | Alternates available |
| Aluminum weigh pans | Various suppliers | ||
| Sterile 15 ml centrifuge tubes | Various suppliers | ||
| Sterile 50 ml centrifuge tubes | Various suppliers | ||
| 4-Methylumbelliferone | Sigma | M1381 | |
| 4-Methylumbelliferyl (MUB)-phosphate | Sigma | M8883 | MUB-substrate |
| 4-MUB-glucopyranoside | Sigma | M3633 | MUB-substrate |
| 4-MUB-N-acetylglucosaminide | Sigma | M2133 | MUB-substrate |
| Sodium bicarbonate | Various suppliers | ||
| Black 96-well microplate | Costar | 3792 | |
| Pipette reservoir | Various suppliers | ||
| EQUIPMENT | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Centrifuge rotor | Eppendorf | A-4-81 | For microplates/deep-well blocks |
| Microplate reader | BioTek | Synergy HT | Alternates available |
| Microplate fluorometer | BioTek | FLx 800 | Alternates available |
| 8-channel pipettor | Various suppliers | ||
References
- Ljungdahl, L. G., Eriksson, K. -E. Ecology of microbial cellulose degradation. Advances in microbial ecology. 8, 237-299 (1985).
- Sinsabaugh, R. L., Antibus, R. K., Linkins, A. E., Mclaugherty, C. A., Rayburn, L., Repert, D., Weiland, T. Wood decomposition over a first-order watershed: mass loss as a function of lignocellulase activity. Soil biology and biochemistry. 24, 743-749 (1992).
- Dalal, R. C. Soil organic phosphorus. Advances in agronomy. 29, 83-113 (1977).
- Sinsabaugh, R. L., Moorhead, D. L. Resource allocation to extracellular enzyme production: a model for nitrogen and phosphorus control of litter decomposition. Soil biology and biochemistry. 26, 1305-1311 (1995).
- Tabatabai, M. A., Bremner, J. M. Use of p-nitrophenyl phosphate for assay of soil phosphatase activity. Soil biology and biochemistry. 1, 301-307 (1969).
- Parham, J. A., Deng, S. P. Detection, quantification and characterization of β-glucosaminidase activity in soil. Soil biology and biochemistry. 32, 1183-1190 (2000).
- Kuperman, R. G., Carreiro, M. M. Soil heavy metal concentrations, microbial biomass and enzyme activities in a contaminated grassland ecosystem. Soil biology and biochemistry. 29, 179-190 (1997).
- Olander, L. P., Vitousek, P. M. Regulation of soil phosphatase and chitinase activity by N and P availability. Biogeochemistry. 49, 175-190 (2000).
- Jackson, C. R., Vallaire, S. C. Effects of salinity and nutrient enrichment on microbial assemblages in Louisiana wetland sediments. Wetlands. 29, 277-287 (2009).
- Hoppe, H. -G. Significance of exoenzymatic activities in the ecology of brackish water: measurements by means of methylumbelliferyl-substrates. Marine ecology progress series. 11, 299-308 (1983).
- Somville, M. Measurement and study of substrate specificity of exoglucosidase activity in eutrophic water. Applied and environmental microbiology. 48, 1181-1185 (1984).
- Freeman, C., Liska, G., Ostle, N. J., Jones, S. E., Lock, M. A. The use of fluorogenic substrates for measuring enzyme activity in peatlands. Plant and soil. 175, 147-152 (1995).
- Sinsabaugh, R. L., Findlay, S., Franchini, P., Fischer, D. Enzymatic analysis of riverine bacterioplankton production. Limnology and oceanography. 42, 29-38 (1997).
- Marx, M. -C., Wood, M., Jarvis, S. C. A microplate fluorometric assay for the study of enzyme diversity in soils. Soil biology and biochemistry. 33, 1633-1640 (2001).
- Jackson, C. R., Weeks, A. Q. Influence of particle size on bacterial community structure in aquatic sediments as revealed by 16S rRNA gene sequence analysis. Applied and environmental microbiology. 74, 5237-5240 (2008).
- Canion, A. K., Ochs, C. The population dynamics of freshwater armored dinoflagellates in a small lake in Mississippi. Journal of freshwater ecology. 20, 617-626 (2005).
- Sinsabaugh, R. L., Lauber, C. L., et al. Stoichiometry of soil enzyme activity at global scale. Ecology letters. 11, 1252-1264 (2008).
- Jackson, C. R., Foreman, C. M., Sinsabaugh, R. L. Microbial enzyme activities as indicators of organic matter processing rates in a Lake Erie coastal wetland. Freshwater biology. 34, 329-342 (1995).
- Jackson, C. R., Vallaire, S. C. Microbial activity and decomposition of fine particulate organic matter in a Louisiana cypress swamp. Journal of the north american benthological society. 26, 743-753 (2007).
- Jackson, C. R., Liew, K. C., Yule, C. M. Structural and functional changes with depth in microbial communities in a tropical Malaysian peat swamp forest. Microbial ecology. 57, 402-412 (2009).
- Rietl, A. J., Jackson, C. R. Effects of the ecological restoration practices of prescribed burning and mechanical thinning on soil microbial enzyme activities and leaf litter decomposition. Soil biology and biochemistry. 50, 47-57 (2012).
- Smart, K. A., Jackson, C. R. Fine scale patterns in microbial extracellular enzyme activity during leaf litter decomposition in a stream and its floodplain. Microbial ecology. 58, 591-598 (2009).
