Summary
Процедуры для микропланшетов на основе описаны для колориметрического или флуорометрического анализа внеклеточной активности фермента. Эти процедуры позволяют для быстрого анализа такой деятельности в большом количестве проб окружающей среды в пределах приемлемого периода времени.
Abstract
Большая часть питательных веществ и переработки газа в природных средах происходит благодаря активности внеклеточных ферментов, опубликованным микроорганизмов. Таким образом, измерение активности этих внеклеточных ферментов может дать понимание скоростей процессов на уровне экосистем, таких как органического разложения вещества или азота и минерализации фосфора. Анализы внеклеточной ферментативной активности в пробах окружающей среды обычно включают подвергая образцы искусственных колориметрических или флуорометрическими субстратов и отслеживания скорости гидролиза субстрата. Здесь мы опишем микропланшета на основе методов для этих процедур, которые позволяют анализ большого количества образцов в течение короткого периода времени. Образцы подвергают взаимодействию с искусственных субстратах в 96-луночные микропланшеты или глубокий луночный микропланшет блоков, и активность фермента впоследствии определяется поглощения или флуоресценции полученного конечного продукта с использованием обычного микропланшетов Ридг или флуорометр. Такие процедуры высокой пропускной не только облегчит проведение сравнений между пространственно отдельных участках или экосистем, но и существенно снизить затраты на таких анализов за счет снижения общих объемов реагентов, необходимых на образец.
Introduction
Микроорганизмы, такие как бактерии и грибы получить питательные вещества и углерод из сложных органических соединений за счет производства внеклеточных ферментов. Эти ферменты обычно гидролиза полимеров на более мелкие субъединицы, которые могут быть приняты в клетку. Таким образом, в экологической уровне эти микробные внеклеточных ферментов отвечают за большую часть питательных веществ минерализации и разложения органических веществ вещества, которое происходит в естественных условиях. Ферменты, такие как целлобиогидролазы (СВН) и β-глюкозидазы важны для деградации целлюлозы и работать в унисон, чтобы катализировать гидролиз целлюлозы в глюкозу 1,2, который обеспечивает утилизируемых углерода субстрат для микробного поглощения и ассимиляции. Фермент фосфатазы релизы растворимых неорганических фосфатных групп из органофосфаты, по существу минерализации фосфата и сделать его доступным для использования большинства организмов 3. Другие ферменты, такие как N-ацетилглюкозаминидазы (Nagase), являются importanт к деградации хитина и может сделать как углерод и азот, доступной для микробов приобретения 4.
Одна из процедур анализа микробной внеклеточной ферментативной активности в естественных условиях является использование искусственного п-нитрофенила (р NP), связанные субстратов, подход, который изначально разрабатывался для обнаружения почвы активность фосфатазы 5. Этот подход основан на обнаружении цветной конечного продукта, п-нитрофенола, который выделяется, когда искусственный субстрат гидролизуют с помощью соответствующего фермента. П-нитрофенол может быть впоследствии количественно колориметрическим путем измерения его абсорбцию в пределах 400-410 нм. Этот метод стал применяться для обнаружения других ферментов, таких как Нагасе 6, и был использован в различных исследований, глядя на микробной внеклеточной ферментативной активности в грунтов и отложений 7-9.
Альтернативный подход, который был Originallу разработаны для оценки внеклеточный глюкозидазы в водной среде 10,11 использует 4-метилумбеллиферона (MUB), ссылки на подложках. Конечный продукт выпущен (4-метилумбеллиферона) весьма люминесцентные и могут быть обнаружены с помощью флуорометр с установкой возбуждения / эмиссии вокруг 360/460 нм. Разнообразные MUB-связанных искусственных субстратах доступны, позволяя флуорометрического измерение активности по крайней мере, многих ферментов (например, β-глюкозидазы, целлобиогидролазы, Нагасе, фосфатазы), а могут быть проанализированы с помощью р NP-подложка колориметрического процедуру. Другие микробные внеклеточные ферменты, такие как протеолитических лейцинаминопептидазы, может быть проанализирована с помощью флуорометрически 7-амино-4-метилкумарин (COU), связанных субстратов. Оба MUB-и COU-связанные субстраты были использованы для определения активности фермента в различных наземных и водных образцов 12,13.
В то время как предыдущие исследования имеют DescrIBED флуорометрический или колориметрический микропланшет подходы для определения внеклеточный активность фермента 14; существует необходимость четкого представления о том, как проводить такие анализы. Здесь показано, процедуры проведения высокие методы пропускная способность микропланшета для анализа внеклеточной ферментативной активности в грунтов и отложений с использованием колориметрического р NP-сшитый субстратов подход и в природных водах с использованием флуоресцентного MUB-связанный субстратов техники. Мы делаем ставку на измерении деятельности β-глюкозидазы, Nagase и фосфатазы как эти ферменты могут быть привязаны к углерода, азота, фосфора и велосипедного соответственно. Однако процедуры, описанные здесь, могут быть применены к измерению других внеклеточных ферментов, использующих различные искусственные субстраты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Колориметрический Анализ внеклеточной ферментативной активности в почвах и донных отложениях
1. Подготовка субстрата и буферные растворы для колориметрических анализов активности фермента
- Подготовка 50 мМ ацетатным буфером (рН 5,0-5,5) путем смешивания 50 мл 0,1 М уксусной кислоты (2,87 мл ледяной уксусной кислоты в 500 мл воды), 150 мл 0,1 М ацетата натрия и 200 мл дистиллированной H 2 O. Регулировка рН до 5,0-5,5 с помощью 0,1 М уксусной кислоты, если это необходимо.
- Готовят раствор 1 M гидроксида натрия (NaOH) в дистиллированной H 2 O.
- Подготовьте р NP-связаны подложки решения в 50 мМ ацетатного буфера. Для анализа фосфатазы подготовить 5 мм П NP-фосфат в 50 мМ ацетатного буфера; для анализа β-глюкозидазы подготовить 5 мм П NP-β-глюкопиранозид; для анализа Nagase подготовить 2 мМ PNP-β-N-acetylglucosaminide. Подготовить все решения субстрата в стерильных 15 мл или 50 мл центрифужные пробирки. Растворы можно хранить при температуре 4 ° С в течение 2-3 недель.
2. Определение стандарта конвертировать абсорбцию в р НП концентрации
- Подготовка стандартных растворов п-нитрофенола в 50 мМ ацетатного буфера. Концентрации должна составлять от 0.025-1 мМ.
- Передача три повторов 100 мкл каждой концентрации до прозрачного микропланшет с 96 лунками. Добавьте 10 мкл 1 М NaOH и 190 мкл дистиллированной H 2 O в каждую лунку.
- Запись поглощение при 410 нм с использованием микропланшет-ридера.
- Концентрации размножаются на стандартной кривой на 0,3, чтобы получить мкмоль р NP за 300 мкл реакционного объема. Постройте кривую поглощения против мкмоль р НП. Наклон кривой служит коэффициент преобразования (С), которые относятся к поглощению мкмоль р НП в каждой реакции фермента.
3. Проведение Анализ фермента
- Для почве, получая суспензию каждого анализируемого образца в стерильной 15 мл центрифужную пробирку на концданию примерно 1 г / мл -1 использованием 50 мМ ацетатным буфером. Для отложений, добавить достаточно ацетатный буфер, чтобы сделать суспензию легко pipettable. Точный объем суспензии, необходимой будет варьироваться в зависимости от количества ферментов анализировали, но не менее 5 мл рекомендуется. Vortex друг суспензия, пока все комки почвы или отложений не разошлись и обратите внимание на конечный объем.
- Re-вихря друг суспензия и сразу пипетки 150 мкл в каждую из шести скважин на 96-и глубинного блока (рис. 1). Важно тщательно вихря и часто, чтобы поддерживать частицы грунта во взвешенном состоянии. Оставьте по крайней мере две скважины на блок пустые служить в качестве контроля подложки. Примечание: клип конец наконечников пипеток с ножницами до пипетки как почвенные растворы, как правило, забивают советы. Подготовьте один блок 96-а для каждой фермента, который надо анализировать.
- Залить приблизительно 5 мл ацетатного буфера в резервуар пипетки и используют 8-канальную пипетку, чтобы добавить 150 мкл буфера для лАСТ две скважины каждого образца (они будут выборочные управления буфер) и две контрольные лунки субстрата (рис. 1)
- Налейте примерно 10 мл соответствующего раствора р NP-подложки в резервуар пипетки и используют 8-канальную пипетку, чтобы добавить 150 мкл раствора субстрата в первых четырех лунках каждого образца и двух контрольных лунок подложка (рис. 1). Обратите внимание на время как реакция начинается, как только раствор добавляют субстрат.
- Планшеты инкубируют при комнатной температуре (22 ° С) в течение 0,5-4 часов. Точное время инкубации изменяется в зависимости от уровня активности в образцах и фермента дл анализа. Для большинства почв и донных отложений, фосфатазы и β-глюкозидазы требуют инкубации времена 0,5-1,5 ч, в то время как Nagase и другие ферменты требуют инкубации времена> 2 часов.
- В то время как анализы инкубации подготовить четкий 96-луночных микропланшетов на измерить оптическую плотность. Подготовьте планшет для каждого глубинного блока (то есть для каждого еанализировали nzyme). Пипетка 10 мкл 1 М NaOH и 190 мкл дистиллированной воды в каждую лунку микропланшета. Примечание: NaOH замедляет ферментативную реакцию и повышает рН, которое усиливает цвет р НП опубликованном в ходе реакции.
- После инкубации центрифуге блоки 96-а в 2000-5000 мкг в течение 5 мин для осаждения частиц почвы.
- Используйте многоканальную пипетку отозвать 100 мкл из каждой лунки, будьте осторожны, избегайте осадок, и передать его в соответствующую лунку на подготовленного четкого планшетом с 96-а.
- Включите микропланшетного и настроить все необходимое программное обеспечение. Запись поглощение при 410 нм. Если поглощение конкретной скважины выше линейного предела обнаружения ридере, развести, что хорошо 1:01 с водой и повторного измерения. Если поглощение все еще слишком высока, анализ следует повторить с более коротким временем инкубации.
4. Определение сухой массы образцов
- Внесите 1 мл каждого SAMPL е суспензию в предварительно взвешенную алюминиевую чашку.
- Сушат в 75 ° C сушильном шкафу в течение 48 ч и весят. Вычесть вес поддона от этого значения, чтобы получить сухой массы почвы или осадка в 1 мл суспензии. Умножение на коэффициент 0,15 для определения сухой массы образца в 150 мкл в каждую лунку добавляли в ферментном анализе.
5. Расчет ферментативной активности на сухой массы почвы или отложений
- Рассчитать конечную оптическую плотность каждого образца путем вычитания поглощения контрольной пробы из образца для анализа оптической плотности. Если элементы управления подложки имеют высокую оптическую плотность (примерно> 0,060), то вычесть тех, также.
- Рассчитать активность фермента в мкмолей ч -1 г сухой массы -1 из уравнения:
Активность фермента = конечное поглощение / (С х время инкубации х образец сухой массы)
Люминесцентная Анализ внеклеточной ферментативной активности в природных водах
TLE "> 1. Подготовка основания, Standard, и буферные растворы флуорометрического Анализы активности фермента- Подготовка 200 мкМ растворов MUB-связанных субстратов (например, 4-MUB-β-глюкопиранозид, 4-MUB-фосфат, 4-MUB-N-ацетил-β-D-глюкозаминида) растворением соответствующего субстрата в стерильной (в автоклаве) дистиллированной H 2 O в 15 мл стерильные или 50 мл центрифужные пробирки. Оберните трубки в алюминиевой фольгой, чтобы исключить свет и хранить в холодильнике до использования. Подложки должны быть стабильными в течение по крайней мере 1 недели при хранении в этом случае.
- Подготовить стандартный MUB путем исходного раствора 100 мкМ 4-метилумбеллиферона в стерильной дистиллированной H 2 O. Храните в холодильнике в янтаре или обернутого фольгой бутылки. Непосредственно перед применением разбавл ют 100 мкМ исходного раствора на 1/10 в стерильной H 2 O, чтобы сделать рабочий раствор 10 мкм для ферментных анализов.
- Подготовка исходного раствора 100 мМ бикарбонатного буфера при растворении 8,4 г NaHCO <суб> 3 в 1 LH 2 O и в автоклаве. Развести эту исходного раствора 1/20 в стерильной H 2 O при необходимости сделать рабочего раствора 5 мм для ферментных анализов.
2. Организация Водные Образцы на 96-Well Черного микроплиты
- Организация планшет для каждого фермента следующее примере, показанном на рисунке 2. Обратите внимание, что способствует надлежащей реализации репликации, стандартов и контроля, эта процедура может анализе деятельности одного фермента до девяти проб воды на одном 96-а черный микропланшет.
- Налейте приблизительно 5 мл первого образца в пипетку резервуара и используют 8-канальную пипетки в pipette200 мкл во все лунки в колонке 1 микропланшета (ов). Утилизация использованных наконечников и повторите по мере необходимости для каждого образца воды, чтобы заполнить столбцы 1-9.
3. Настройка Sample, Стандартный, Quench, и субстрат управления
- Настройка управления для учета образцов, стандартныхс, субстрат и закалки на том же черном микропланшет как образцов (рис. 2).
- Примеры управления содержат пробы воды и бикарбоната буфер, и не используются в расчетах деятельности, но продемонстрирует чтения согласованности на протяжении всего эксперимента. Элементы управления закалки состоять из пробы воды и стандартного количества флуоресцентного тега и используются для измерения дифракции флуоресценции в образце воды. Субстрат и стандартные элементы управления состоят из подложки или сшитые или стандартный флуоресцентной метки, соответственно, и бикарбонатного буфера.
- Налейте приблизительно 5 мл 5 мМ бикарбонатного буфера в чистую пипетки резервуара. 50 мкл буфера в стрипы с 1 по 9 в строках D и Е, чтобы сформировать два повторить скважин управления образца на образец. Советы Изменить пипеток затем передать 200 мкл бикарбонатная в лунки 10 по 12 в строках и Х.
- Уменьшите окружающее освещение затемнением или выключения Лиghts как флуоресцентного стандарта является светочувствительным.
- Налейте приблизительно 5 мл 10 мкМ 4-метилумбеллиферона в чистую пипетки резервуара. 50 мкл в стрипы с 1 по 12 в строке H, и в лунки с 1 по 9 на строки G и F, чтобы сформировать три повторов управления закалки на образец и общих стандартных элементов управления. Либо поместить планшет в темноте или накрыть непрозрачной крышкой, чтобы уменьшить свет деградации MUB.
- Включите флуорометра и настройки все необходимое программное обеспечение, чтобы быть готов читать перед добавлением субстрата. Примечание: некоторые флуорометр луковицы могут потребовать времени для разогрева на 3 мин и более.
- Налейте приблизительно 5 мл соответствующей MUB-связанного субстрата (например, 4-MUB-фосфат) в чистую пипетки резервуара. Используйте пипетки 12-канальный, чтобы 50 мкл в стрипы с 1 по 12 в строке A, и в лунки с 1 по 9 рядами В и С образуют три дублирующие тесты для каждого образца и три элемента управления подложки. Immediatelу перейдите к шагу 4.1, флуоресценцию записи.
4. Запись флуоресценции
- Read начальное флуоресценции сразу же после субстрата дополнение к микропланшета. После прочтения флуоресценцию, инкубировать планшет при комнатной температуре (22 ° C) или в темное время суток или покрыт непрозрачным крышкой, чтобы уменьшить свет деградации MUB.
- Время инкубации требуется измерить максимальное потенциальную активность фермента в образце воды будет зависеть от концентрации фермента в образце. Так как это ранее неизвестные анализ завершен, микропланшет должны быть считаны в нескольких временных шагов. Как правило, чтение с интервалом в 10-15 мин в течение 1 ч является приемлемым для многих ферментов, хотя образцы с очень высокой активностью в определенных ферментов может достигнуть максимума до 10 мин.
- Продолжить чтение флуоресценцию в микропланшет в ваших заданные интервалы в течение не менее 1 часа. Не забудьте сохранить микропланшет с покрытием или в темноте между чтениис.
5. Расчет ферментативной активности на объем воды
- Для каждого образца в каждом временном интервале расчета: значит первоначальный образец флуоресценции (скважины D и E), средняя конечная флуоресценции образца (скважины переменного тока), средняя стандартная флуоресценции (скважин H10-11), а средняя утолить флуоресценции управления (скважин FG).
- Для каждого интервала времени, рассчитывают активность фермента в нмоль ч -1 -1 мл по формуле:
Активность фермента = (средний флуоресценцию образца - значит первоначальный флуоресценцию образца) / ((имею в виду стандартные флуоресценции / 0,5 моль) х (средний утолить флуоресценции управления / означает стандартные флуоресценции) х (0,2 мл) х (время в час))
- Изучите значения деятельности, рассчитанные для каждого временного шага. Определить окончательную потенциальную деятельность с временной шаг с высокой активностью. Если значения активности продолжать расти, то может потребоваться более поздние временные шаги, если значения активности падают ThrougХаут ход в бегах, а затем запустить снова с более короткими шагами по времени. Финал деятельность в нмоль субстрата потребляется ч -1 мл -1, но можно масштабировать до выразить как мкмоль ч -1 L -1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Почвы и водные отложения обычно имеют заметное количество внеклеточной ферментативной активности в результате приложенных микробных сообществ (биопленки), растущих на поверхности частиц. 3 показано, как эта деятельность будет меняться в зависимости от размера частиц, полученных с поверхности осадка третий поток порядок в северной Миссисипи, США. Предыдущее исследование показало, что бактериальные сообщества на осадочных частиц из этого потока могут быть разделены на три группы в зависимости от молекулярного анализа их структуры сообщества: те, на 0,063 частиц мм, тех, кто на 0,125, 0,25 и 0,5 мм частиц, а те, на 1 мм частицы 15. Анализ образцов в внеклеточной активности фермента подтверждает этот вывод; с фосфатазы (фиг.3А) быть похожа на 0,125, 0,25 и 0,5 мм частиц, но намного выше на 1 и 0,063 мм фракций при измерении с помощью NP-сшитый технику подложки с. Оугие ферменты, такие как β-глюкозидазы (рис. 3б), и Nagase (рис. 3C) показывают, что аналогичные пики на самых мелких частиц, но не повышен на частицы размером 1 мм, подчеркивая тот факт, что различные ферменты могут показать различные экологические распределения, и они могут быть выяснены с помощью этого теста. Бары относительно низкие ошибок показывают, что колориметрические анализы активности фермента на отложениях воспроизводимым и, таким образом, поддаются статистическому анализу при сравнении различных проб окружающей среды.
Природные воды, как правило, имеют более низкий внеклеточный активность фермента на мл, чем почвы или отложения сделать на г. Таким образом, они должны быть проанализированы флуорометрически помощью MUB-связанных субстратов. 4 показано, как активность фосфатазы ферментов (рис. 4А), β-глюкозидазы (рис. 4В), и Nagase (рис. 4С) изменяется с глубиной в мелком озере в северной Миссисипи, СШАА. озеро (Boondoggle Lake), как известно, питательное вещество бедных 16, который также предложено относительно высокой активности фосфатазы (фиг.4А), фермент, который микроорганизмы продуцируют с целью получения фосфата от органических соединений. Для всех трех ферментов анализировали образцы, собранные на поверхности воды (0 см) и 50 см глубиной показал подобную деятельность, в то время как деятельность был возведен в 100 см образца. Этот образец был по существу взяты из раздела вода-осадок, и присутствие частиц осадка в образце вероятно приходится на более высокой активностью видно в этом примере, особенно для β-глюкозидазы и Нагасе. Как и в случае п NP субстратов, бары низкий ошибок показывают, что даже всего три повторных показаний, воспроизводимость флуорометрических анализов с помощью MUB субстраты высока.
Обратите внимание, что установки для рисунке 4 в нмоль субстрата потребляемых в то время как те, для рисунке 3в мкмоль субстрата потребляется, даже если за размер блока сопоставима (или на мл или за г). Это подчеркивает тот факт, что почвы и донных отложениях, как правило, имеют гораздо более высокую активность, чем внеклеточный природных вод (деятельность каждого конкретного фермента на рисунке 3 примерно на 10-100x выше, чем деятельности эквивалентной фермента на рисунке 4). Это также свидетельствует о повышенной чувствительности MUB-связанного техники подложки, и необходимость использования этого метода для опробования внеклеточный активность фермента в пробах воды.
Рисунок 1. Предлагаемые компоновка блоков 96-а глубокой скважины для анализа внеклеточного активности фермента в почвах или отложениях с использованием колориметрических р NP-связаны секubstrate техника. Каждый хорошо должны получить в общей сложности 300 мкл, состоящий из образца суспензии, раствора субстрата, или ацетатного буфера в зависимости от того является он пример работы, контрольный образец или контроль субстрат.
Рисунок 2. Предлагаемые расположение 96-а черный микропланшеты для анализа внеклеточного ферментативной активности в пробах воды с использованием флуорометрического MUB-связанный технику субстрата. Девять образцы могут быть расположены вертикально на тарелке (А) каждой занимая восемь скважин. Эти восемь скважин используются для выборки трасс, управления образца, и утолить управления в то время как остальные скважины используются для управления подложки и стандартов MUB (B).
Рисунок 3. Внеклеточный активность фермента на различных размеров поверхности частиц осадка, собранных из небольшого потока в северо Миссисипи, США. Каждый размер частиц фракцию анализировали на активность фосфатазы (A), β-глюкозидазы (B), и Нагасе (C) после р NP-субстрат колориметрический процедура. Активность сообщается в мкмоль субстрата потребляемой ч -1 г сухой массы осадка -1 и среднее (+ SE) из трех повторных показаний в частицах.
Рисунок 4. Внеклеточной активности фермента в воде, принятым на трех дифобнаружению разных глубинах (0, 50, и 100 см) из мелкого озера на севере Миссисипи, США. воды анализировали на активность фосфатазы (А), β-глюкозидазы (B), и Nagase (С) после MUB-подложку флуорометрический процедура. Активность сообщается в нмоль субстрата потребляемых ч -1 мл воды -1 и среднее (+ SE) из трех повторных показаний в образце.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Определение активности различных микробных внеклеточных ферментов в почвах и донных отложениях может предоставить полезную информацию в темпах питательной минерализации и переработки органического вещества 17. Однако почвы может изменяться в их уровней влажности, поэтому важно, чтобы стандартизировать активность на сухой вес почвы. Это требует дополнительной стадии сушки (обычно двух дней) после просто измерения ферментативной активности. Таким образом, в отличие от анализов активности фермента в пробах воды, которые обеспечивают почти мгновенно результатов, надежные анализы активности фермента в почве и донных отложениях занять несколько дней. Для некоторых почвах, он может даже быть более подходящим для выражения активности на грамм органического вещества или золы сухой массы, требующей дополнительной стадии озоления (обычно 2 ч при 500 ° С) за процедуры сушки. Несмотря на это, наиболее важным шагом в колориметрического анализа почвы или отложений активности фермента является вывод супернатанта из глубокой скважины блока Following центрифугирование в конце инкубационного периода. Поскольку эта процедура опирается на измерения поглощения, даже наличие нескольких бродячих частиц почвы в конечном микропланшет может привести к ложным результатам. Более высокие скорости центрифугирования (> 5000 XG) может помочь смягчить эту проблему, но по нашему опыту роторов центрифуг, которые принимают микропланшеты обычно имеют вращательные пределы ниже этого порога, а сами блоки не могут терпеть гораздо более высокие скорости. По существу, это частности шаг пипетки требует сочетания ухода и скорость в использовании пипетки многоканальный быстро передавать необходимое количество супернатанта из блока глубокой скважины для микропланшет.
Анализы внеклеточной ферментативной активности в пробах воды не имеют ни необходимость высыхания, ни стадии центрифугирования последнего, так как и реакцию фермент-субстрат и измерение флюоресценции конечного продукта происходить в том же микропланшете. Как таковые, эти аssays, как правило, быстрее и может первоначально появляются легче бежать. Тем не менее, у них есть свои собственные ограничения в том, что, когда это возможно, стандарт MUB и MUB-связанные основания не должны подвергаться воздействию света. По нашему опыту, затемняя свет столько, сколько возможно в течение пипетки и инкубации микропланшетов в темноте (или покрытые непрозрачной крышкой) является необходимостью. Поскольку эти анализы также требуют пластины для чтения в различные моменты времени, это часто приводит к необходимости очень быстрого переключения между пластинами, когда опробование нескольких ферментов в то же время. Например, для того, чтобы анализе девять проб воды для деятельности одновременно (то есть с использованием шести различных планшетов) шести ферментов, становится необходимым, чтобы прочитать тарелке каждые 2 мин в течение 1 часа для того, чтобы гарантировать, что каждый человек пластина обновляется каждые 10 -15 мин (в данном случае, каждые 12 минут). Необходимо соблюдать осторожность, чтобы отслеживать конкретного пластины читается, а также для того, чтобы жидкость не пролилась сюдам пластину, как она передается в и из микропланшетов флуорометре. Когда опробование нескольких ферментов сразу, это также важно иметь в виду время, необходимое для микропланшетного на самом деле читать тарелку и шататься чтения интервалы соответственно. Последняя проблема с флуоресцентным анализе внеклеточной ферментативной активности в пробах воды является при работе с образцами, которые мутным. Пробы воды, которые содержат взвешенные частицы следует встряхнуть перед первоначально вливаются в пипетки водохранилища и смешивают снова выведя и извлечение с пипетки до грузят на микропланшет. Более высокие числа частиц в образце также обычно приводит к большей тушения флуоресцентного сигнала, а также важность контроля закалки для каждого образца не может быть подчеркнуто достаточно.
В то время как MUB-и р NP-связанные субстраты обычно показывают максимальные значения похожи V для окружающей среды ферментов, М значений Кможет отличаться, и ферменты, такие как β-глюкозидаз и фосфатазы может иметь более высокое сродство к MUB-связанных субстратов, чем их р НП-связаны аналогов 14. Поэтому MUB-связанные субстраты, вероятно, будут более чувствительны, чем те, которые связаны с р Н.П., которая предполагает, что они были бы лучшим выбором для использования при измерении активности фермента в почвах и донных отложениях. Однако флуорогенный конечный продукт, что измеряется во MUB анализов подлежит потенциального закалкой в некоторых почвенных экстрактов, и показания флуоресценции может быть неустойчивым течением времени 12. Грунт и наносы также, как правило, имеют более высокий внеклеточный активность фермента, чем природных вод, так что повышенная чувствительность из флуорометрическими MUB-связанных анализов может предложить небольшое преимущество над колориметрических методов р НП Учитывая потенциальные проблемы с тушением при анализе определенные почвы. В качестве примечания, р НП-связаны субстратов и стандарта р НП сам, как правило, более affordaBLE, чем их коллеги MUB; дополнительный повод для их использования, если бюджетные ограничения применяются.
Возможно, наиболее важным аспектом в состоянии для анализа микробного внеклеточный активность фермента в водной и наземной средах является то, что в то время как эти методы измерения микробных физиологические процессы, эти процессы оказывают прямое влияние на преобразования уровня экосистемы углерода и питательных веществ. Темпы разложения органического вещества были непосредственно связаны с деятельностью внеклеточных целлюлазы в отложениях 18,19, так что быстрые измерения активности фермента потенциально способствовать определению мгновенной на места скоростей распада анализа проб окружающей среды в. Использование высоких подходы пропускная микропланшета позволяет одновременного измерения активности фермента в больших количества образцов, чем более типичных подходов одного трубки, так что различия в активности фермента (и, в процессах уровне экосистемы) в соотвОНСЕ таких факторов, как глубина 20 или экологических возмущений 9,21 может быть рассмотрен. Точно так же, анализы ферментов, участвующих в круговороте питательных веществ, таких как фосфатазы и Nagase, может дать ответ на ограничение питательных веществ в специфических условиях, например, относительную важность органического фосфора в органического азота в процессе разработки почвы 8.
Потому что активность ферментов, были измерены в пробах окружающей среды на протяжении тридцати лет, сравнения между исследований с использованием передовых мета-анализ в настоящее время становится возможным. Такие исследования показывают, что, в глобальном масштабе, активности фермента, и, следовательно, темпов разложения органических веществ и питательных минерализации, привязаны к рН, наличие подложки и питательной стехиометрии 17. В то же время, использование протокола на основе микропланшетов начала, чтобы обеспечить анализ образцов мелкого масштаба в ферментативной активности с использованием методов отображения геостатистических 22
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Acknowledgments
Финансирование аспектов этой работы была предоставлена различных источников, включая США Департамент сельского хозяйства Удельный соглашение о сотрудничестве 58-6408-1-595 и Национального научного фонда (премии 1049911).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS AND MATERIALS | |||
| Glacial acetic acid | Various suppliers | ||
| Sodium acetate | Various suppliers | ||
| Sodium hydroxide | Various suppliers | ||
| p-Nitrophenol | Fisher | BP612-1 | Alternates available |
| p-Nitrophenyl (pNP)-phosphate | Sigma | N3234 | pNP-substrate |
| pNP-β-glucopyranoside | Sigma | N7006 | pNP-substrate |
| pNP-β-N-acetylglucosaminide | Sigma | N9376 | pNP-substrate |
| Clear 96-well microplates | Fisher | 12-563-301 | Alternates available |
| 96-well deep well blocks | Costar | 3958 | Alternates available |
| Aluminum weigh pans | Various suppliers | ||
| Sterile 15 ml centrifuge tubes | Various suppliers | ||
| Sterile 50 ml centrifuge tubes | Various suppliers | ||
| 4-Methylumbelliferone | Sigma | M1381 | |
| 4-Methylumbelliferyl (MUB)-phosphate | Sigma | M8883 | MUB-substrate |
| 4-MUB-glucopyranoside | Sigma | M3633 | MUB-substrate |
| 4-MUB-N-acetylglucosaminide | Sigma | M2133 | MUB-substrate |
| Sodium bicarbonate | Various suppliers | ||
| Black 96-well microplate | Costar | 3792 | |
| Pipette reservoir | Various suppliers | ||
| EQUIPMENT | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Centrifuge rotor | Eppendorf | A-4-81 | For microplates/deep-well blocks |
| Microplate reader | BioTek | Synergy HT | Alternates available |
| Microplate fluorometer | BioTek | FLx 800 | Alternates available |
| 8-channel pipettor | Various suppliers | ||
References
- Ljungdahl, L. G., Eriksson, K. -E. Ecology of microbial cellulose degradation. Advances in microbial ecology. 8, 237-299 (1985).
- Sinsabaugh, R. L., Antibus, R. K., Linkins, A. E., Mclaugherty, C. A., Rayburn, L., Repert, D., Weiland, T. Wood decomposition over a first-order watershed: mass loss as a function of lignocellulase activity. Soil biology and biochemistry. 24, 743-749 (1992).
- Dalal, R. C. Soil organic phosphorus. Advances in agronomy. 29, 83-113 (1977).
- Sinsabaugh, R. L., Moorhead, D. L. Resource allocation to extracellular enzyme production: a model for nitrogen and phosphorus control of litter decomposition. Soil biology and biochemistry. 26, 1305-1311 (1995).
- Tabatabai, M. A., Bremner, J. M. Use of p-nitrophenyl phosphate for assay of soil phosphatase activity. Soil biology and biochemistry. 1, 301-307 (1969).
- Parham, J. A., Deng, S. P. Detection, quantification and characterization of β-glucosaminidase activity in soil. Soil biology and biochemistry. 32, 1183-1190 (2000).
- Kuperman, R. G., Carreiro, M. M. Soil heavy metal concentrations, microbial biomass and enzyme activities in a contaminated grassland ecosystem. Soil biology and biochemistry. 29, 179-190 (1997).
- Olander, L. P., Vitousek, P. M. Regulation of soil phosphatase and chitinase activity by N and P availability. Biogeochemistry. 49, 175-190 (2000).
- Jackson, C. R., Vallaire, S. C. Effects of salinity and nutrient enrichment on microbial assemblages in Louisiana wetland sediments. Wetlands. 29, 277-287 (2009).
- Hoppe, H. -G. Significance of exoenzymatic activities in the ecology of brackish water: measurements by means of methylumbelliferyl-substrates. Marine ecology progress series. 11, 299-308 (1983).
- Somville, M. Measurement and study of substrate specificity of exoglucosidase activity in eutrophic water. Applied and environmental microbiology. 48, 1181-1185 (1984).
- Freeman, C., Liska, G., Ostle, N. J., Jones, S. E., Lock, M. A. The use of fluorogenic substrates for measuring enzyme activity in peatlands. Plant and soil. 175, 147-152 (1995).
- Sinsabaugh, R. L., Findlay, S., Franchini, P., Fischer, D. Enzymatic analysis of riverine bacterioplankton production. Limnology and oceanography. 42, 29-38 (1997).
- Marx, M. -C., Wood, M., Jarvis, S. C. A microplate fluorometric assay for the study of enzyme diversity in soils. Soil biology and biochemistry. 33, 1633-1640 (2001).
- Jackson, C. R., Weeks, A. Q. Influence of particle size on bacterial community structure in aquatic sediments as revealed by 16S rRNA gene sequence analysis. Applied and environmental microbiology. 74, 5237-5240 (2008).
- Canion, A. K., Ochs, C. The population dynamics of freshwater armored dinoflagellates in a small lake in Mississippi. Journal of freshwater ecology. 20, 617-626 (2005).
- Sinsabaugh, R. L., Lauber, C. L., et al. Stoichiometry of soil enzyme activity at global scale. Ecology letters. 11, 1252-1264 (2008).
- Jackson, C. R., Foreman, C. M., Sinsabaugh, R. L. Microbial enzyme activities as indicators of organic matter processing rates in a Lake Erie coastal wetland. Freshwater biology. 34, 329-342 (1995).
- Jackson, C. R., Vallaire, S. C. Microbial activity and decomposition of fine particulate organic matter in a Louisiana cypress swamp. Journal of the north american benthological society. 26, 743-753 (2007).
- Jackson, C. R., Liew, K. C., Yule, C. M. Structural and functional changes with depth in microbial communities in a tropical Malaysian peat swamp forest. Microbial ecology. 57, 402-412 (2009).
- Rietl, A. J., Jackson, C. R. Effects of the ecological restoration practices of prescribed burning and mechanical thinning on soil microbial enzyme activities and leaf litter decomposition. Soil biology and biochemistry. 50, 47-57 (2012).
- Smart, K. A., Jackson, C. R. Fine scale patterns in microbial extracellular enzyme activity during leaf litter decomposition in a stream and its floodplain. Microbial ecology. 58, 591-598 (2009).
