Summary
ووصف الإجراءات صفيحة ميكروسكوبية استنادا لتحليل اللونية أو فلوروميتريك من نشاط انزيم خارج الخلية. تسمح هذه الإجراءات للفحص السريع للنشاط من هذا القبيل في أعداد كبيرة من العينات البيئية ضمن إطار زمني يمكن التحكم فيها.
Abstract
الكثير من تدوير المغذيات وتجهيز الكربون في البيئات الطبيعية يحدث من خلال نشاط الانزيمات خارج الخلية الصادرة عن الكائنات الحية الدقيقة. وبالتالي، يمكن قياس نشاط هذه الانزيمات خارج الخلية تعطي نظرة ثاقبة معدلات العمليات مستوى الأنظمة الإيكولوجية، مثل التحلل المواد العضوية أو النيتروجين والفوسفور تمعدن. المقايسات من نشاط انزيم خارج الخلية في العينات البيئية تنطوي عادة تعريض عينات لركائز اللونية أو فلوروميتريك الاصطناعي وتتبع معدل الركيزة التحلل. نحن هنا تصف أساليب صفيحة ميكروسكوبية استنادا لهذه الإجراءات التي تسمح للتحليل عدد كبير من العينات في غضون فترة زمنية قصيرة. ويسمح للعينات لتتفاعل مع ركائز الاصطناعي خلال 96 جيدا microplates أو بئر عميقة كتل صفيحة ميكروسكوبية، ويتم تحديد نشاط انزيم في وقت لاحق عن طريق امتصاص أو مضان من المنتج النهائي مما أدى باستخدام صفيحة ميكروسكوبية ريد نموذجيةص أو التألق. هذه الإجراءات إنتاجية عالية ليس فقط تسهيل المقارنات بين المواقع أو النظم الإيكولوجية منفصلة مكانيا، ولكن أيضا تخفيض كبير في تكلفة هذه المقايسات من خلال تقليل كميات كاشف الشاملة المطلوبة لكل عينة.
Introduction
الكائنات الدقيقة مثل البكتيريا والفطريات الحصول على المواد الغذائية والكربون من المركبات العضوية المعقدة من خلال إنتاج إنزيمات خارج الخلية. هذه الإنزيمات عادة يتحلل البوليمرات في مفارز الصغيرة التي يمكن اتخاذها في الخلية. لذلك، على المستوى البيئي، وهذه الانزيمات خارج الخلية الجرثومية هي المسؤولة عن الكثير من تمعدن المواد الغذائية وتحلل المواد العضوية التي تحدث في البيئات الطبيعية. الانزيمات مثل cellobiohydrolase (CBH) وβ جلوكوزيد مهمة لتدهور السليلوز والعمل في انسجام لتحفيز التحلل من السليلوز إلى جلوكوز 1،2، الذي يوفر ركيزة للاستعمال الكربون لامتصاص الميكروبية والاستيعاب. انزيم الفوسفاتيز تطلق مجموعات الفوسفات غير العضوية القابلة للذوبان من الفوسفات العضوية، التمعدن أساسا الفوسفات وجعلها متاحة للاستخدام من قبل معظم الكائنات الحية 3. الأنزيمات الأخرى، مثل N-acetylglucosaminidase (ناغاسي)، ومهمر في تدهور الكيتين ويمكن أن تجعل كلا من الكربون والنيتروجين المتاحة لاكتساب الجراثيم 4.
واحدة من إجراءات الفحص من نشاط انزيم الميكروبية خارج الخلية في البيئات الطبيعية هو استخدام الاصطناعي البارانتروفنيل (ع NP) ركائز مرتبطة، وهو النهج الذي وضعت أصلا للكشف عن نشاط إنزيم الفوسفاتيز التربة 5. يعتمد هذا النهج على الكشف عن المنتج النهائي الملونة، ف نيتروفينول، والتي يتم تحريرها عندما يتم تحلل الركيزة الاصطناعي بواسطة انزيم المناسبة. للنيتروفينول ع يمكن قياسها كميا في وقت لاحق من خلال قياس الامتصاصية colorimetrically لها في حوالي 400-410 نانومتر. ومنذ ذلك الحين تم تطبيق هذه الطريقة للكشف عن إنزيمات أخرى مثل ناغاسي 6، واستخدمت في دراسات مختلفة تبحث في نشاط انزيم الميكروبية خارج الخلية في التربة والرواسب 7-9.
النهج البديل الذي كان اصلاوضعت ذ لتقييم النشاط جلوكوسيديز خارج الخلية في البيئات المائية 10،11 يجعل من استخدام 4 methylumbelliferone (MUB) ركائز المرتبطة. المنتج النهائي سراح (4 methylumbelliferone) هو الفلورسنت للغاية ويمكن الكشف عن ذلك باستخدام مقياس التألق مع أجواء الإثارة / الانبعاثات حوالي 360/460 نانومتر. هي مجموعة متنوعة من ركائز اصطناعية MUB مرتبطة المتاحة، والسماح قياس فلوروميتريك لنشاط ما لا يقل عن العديد من الإنزيمات (مثل β جلوكوزيد، cellobiohydrolase، ناغاسي، الفوسفاتيز) كما يمكن أن يعاير باستخدام ف NP الركيزة الإجراء اللونية. الانزيمات خارج الخلية الميكروبية الأخرى، مثل البروتين المهينة يسين أمينوببتيداز، يمكن أن يعاير fluorometrically باستخدام 7-الأمينية-4-methylcoumarin (كال) ركائز المرتبطة. وقد استخدمت كل من MUB وركائز كال المرتبطة لتحديد نشاط انزيم في مختلف العينات الأرضية والمائية 12،13.
بينما الدراسات السابقة لها descrنهج ibed صفيحة ميكروسكوبية فلوروميتريك أو اللونية لتحديد نشاط انزيم خارج الخلية 14، وليس هناك حاجة لتقديم عرض واضح لكيفية إجراء مثل هذه المقايسات. نحن هنا لشرح الإجراءات لإجراء تقنيات عالية الإنتاجية صفيحة ميكروسكوبية لتحليل نشاط انزيم خارج الخلية في التربة والرواسب باستخدام النهج ص ركائز مرتبطة NP اللونية في المياه الطبيعية وباستخدام تقنية ركائز MUB المرتبطة الفلورسنت. ونحن نركز على قياس أنشطة β جلوكوزيد، ناغاسي، والفوسفاتيز وهذه الأنزيمات يمكن أن تكون مرتبطة إلى الكربون، والنيتروجين، والفوسفور وركوب الدراجات، على التوالي. ومع ذلك، فإن الإجراءات المذكورة هنا يمكن تطبيقها على قياس الانزيمات خارج الخلية الأخرى باستخدام ركائز اصطناعية مختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تحليل اللونية من خارج الخلية نشاط انزيم في التربة والرواسب
1. إعداد الركيزة العازلة وحلول التحليلات اللونية من نشاط انزيم
- إعداد 50 ملي العازلة خلات (درجة الحموضة 5،0-5،5) عن طريق خلط 50 مل 0.1 M حمض الخليك (2.87 مل حمض الخليك الجليدي في 500 مل من الماء)، 150 مل 0.1 M خلات الصوديوم، و 200 مل المقطر H 2 O. ضبط درجة الحموضة إلى 5،0-5،5 مع 0.1 M حمض الخليك إذا لزم الأمر.
- إعداد محلول من 1 هيدروكسيد الصوديوم M (هيدروكسيد الصوديوم) في H 2 O. المقطر
- إعداد ف مرتبطة NP حلول الركيزة في 50 ملي العازلة خلات. لفحص إنزيم الفوسفاتيز إعداد 5 ملي ص NP-الفوسفات في 50 ملي العازلة خلات؛ لفحص β جلوكوزيد إعداد 5 ملي ص NP-β-glucopyranoside؛ لفحص ناغاسي إعداد 2 مم PNP-β-N-acetylglucosaminide. إعداد جميع الحلول العقيمة الركيزة في 15 مل أو 50 مل أنابيب الطرد المركزي. ويمكن تخزين الحلول في 4 درجات مئوية لمدة 2-3 أسابيع.
2. تحديد معيار لتحويل الامتصاصية ع NP تركيز
- إعداد حلول مستوى ف نيتروفينول في 50 ملي العازلة خلات. ينبغي أن تركيزات تتراوح ،025-1 ملي.
- نقل ثلاثة مكررات من 100 ميكرولتر من كل تركيز واضح على صفيحة ميكروسكوبية 96 جيدا. إضافة 10 ميكرولتر 1 M هيدروكسيد الصوديوم و190 ميكرولتر المقطر H 2 O إلى كل بئر.
- الامتصاصية 410 نانومتر في سجل باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية.
- تركيزات تتكاثر في المنحنى القياسي بنسبة 0.3 في الحصول μmoles ص NP في 300 ميكرولتر حجم رد الفعل. رسم منحنى الامتصاصية مقابل μmole ع NP. المنحدر من منحنى بمثابة عامل التحويل (C) التي من شأنها أن تتصل الامتصاصية لμmole ع NP في كل رد فعل الانزيم.
3. إجراء فحص انزيم
- للتربة، وإعداد الطين من كل عينة إلى أن يعاير في العقيمة 15 مل أنبوب الطرد المركزي في concentrأوجه من حوالي 1 جم / مل -1 باستخدام 50 ملي العازلة خلات. لالرواسب، إضافة المخزن ما يكفي من خلات لجعل الطين pipettable بسهولة. فإن حجم الدقيق الطين اللازمة تختلف وفقا لعدد من الإنزيمات يعاير، ولكن ينصح كحد أدنى من 5 مل. دوامة كل الطين حتى فرقت جميع كتل من التربة أو الرواسب ثم لاحظ الحجم النهائي.
- إعادة دوامة كل الطين وماصة على الفور 150 ميكرولتر في كل من ستة آبار على كتلة 96 جيدا deepwell (الشكل 1). من المهم أن دوامة بدقة وبشكل متكرر من اجل الحفاظ على جسيمات التربة في التعليق. ترك اثنين على الأقل من الآبار في كتلة فارغة لتكون بمثابة الركيزة السيطرة. ملاحظة: مقطع نهاية نصائح ماصة مع مقص قبل pipetting لكما تميل عجائن التربة لتسد النصائح. إعداد كتلة واحدة 96-جيدا لكل انزيم أن يعاير.
- صب حوالي 5 مل من العازلة خلات في خزان ماصة واستخدام pipettor 8 قنوات لإضافة 150 ميكرولتر من العازلة للترAST بئرين من كل عينة (هذه ستكون الضوابط عينة العازلة) واثنين من آبار المراقبة الركيزة (الشكل 1)
- صب حوالي 10 مل من ع الحل المناسب NP-الركيزة في خزان ماصة واستخدام pipettor 8 قنوات لإضافة 150 ميكرولتر من الحل الركيزة إلى الآبار الأربعة الأولى من كل عينة واثنين من آبار المراقبة الركيزة (الشكل 1). لاحظ الوقت الذي يبدأ رد الفعل في أقرب وقت يتم إضافة حل الركيزة.
- احتضان لوحات في RT (22 درجة مئوية) ل0،5-4 ساعة. بالضبط فترة حضانة سوف تختلف تبعا لمستوى النشاط في عينات وانزيم أن يعاير. لمعظم أنواع التربة والرواسب، والفوسفاتيز β جلوكوزيد تتطلب مرات حضانة 0.5-1.5 ساعة، في حين ناغاسي والإنزيمات الأخرى تتطلب مرات حضانة> 2 ساعة.
- بينما تحتضن إعداد المقايسات واضح 96 جيدا microplates لقراءة الامتصاصية. إعداد صفيحة ميكروسكوبية واحد لكل كتلة deepwell (أي لكل الإلكترونيةnzyme يعاير). ماصة 10 ميكرولتر 1 M هيدروكسيد الصوديوم و190 ميكرولتر من الماء المقطر في كل بئر من صفيحة ميكروسكوبية. ملاحظة: هيدروكسيد الصوديوم يؤدي إلى إبطاء رد الفعل الأنزيمية ويرفع درجة الحموضة التي تعزز من لون NP ص صدر خلال رد الفعل.
- بعد الحضانة، وأجهزة الطرد المركزي لبنات 96 جيدا في 2،000-5،000 x ج لمدة 5 دقائق لتكوير جزيئات التربة.
- استخدام ماصة الأقنية لسحب 100 ميكرولتر من كل بئر، والحرص على تجنب بيليه، وتحويلها إلى المقابلة بشكل جيد على إعداد اضحة صفيحة ميكروسكوبية 96 جيدا.
- بدوره على قارئ صفيحة ميكروسكوبية وإنشاء أي برامج ضرورية. الامتصاصية سجل في 410 نانومتر. إذا الامتصاصية من بئر خاص هو أعلى من الحد الكشف خطية من قارئ لوحة، وتمييع ذلك جيدا بالماء و01:01 إعادة قياس. إذا الامتصاصية لا تزال مرتفعة للغاية، وينبغي تكرار الفحص مع فترة حضانة أقصر.
4. تحديد كتلة الجاف العينات
- ماصة 1 مل من كل sampl ه الطين في وعاء الألومنيوم preweighed.
- الجافة في فرن التجفيف 75 درجة مئوية لمدة 48 ساعة وتزن. طرح وزن عموم من هذه القيمة للحصول على كتلة جافة من التربة أو الرواسب في 1 مل من الطين. تتكاثر بعامل 0.15 لتحديد كتلة جافة من العينة في 150 ميكرولتر تضاف إلى كل بئر في فحص انزيم.
5. حساب نشاط انزيم في قداس الجاف للتربة أو الرواسب
- حساب الامتصاصية النهائي من كل عينة عن طريق طرح الامتصاصية السيطرة عينة من الامتصاصية عينة الفحص. إذا الضوابط الركيزة يكون الامتصاصية العالية (حوالي> 0.060) ثم طرح تلك أيضا.
- حساب نشاط انزيم في μmoles ساعة -1 غرام وزن جاف -1 من المعادلة:
نشاط انزيم = الامتصاصية النهائي / (C س س فترة حضانة العينة الجافة الشامل)
تحليل الفلورسنت من خارج الخلية نشاط انزيم في المياه الطبيعية
حلول TLE "> 1. إعداد الركيزة، قياسي، وعازلة للتحليلات فلوروميتريك من نشاط انزيم- إعداد 200 ميكرومتر الحلول من ركائز MUB مرتبطة (على سبيل المثال 4-MUB-β-glucopyranoside، 4-MUB فوسفات، 4-MUB-N-أسيتيل β-D-glucosaminide) عن طريق إذابة الركيزة المناسبة في العقيمة (تعقيمها) المقطر H 2 O في العقيمة 15 مل أو 50 مل أنابيب الطرد المركزي. التفاف الأنابيب في رقائق الألومنيوم لاستبعاد الضوء وتخزينها في الثلاجة قبل الاستخدام. وينبغي أن تكون ركائز مستقرة لا يقل عن 1 أسبوع إذا المخزنة في هذا الطريق.
- إعداد معيار MUB بجعل حل الأسهم من 100 ميكرومتر 4 methylumbelliferone في العقيمة H 2 O. المقطر مخزن تبريد في العنبر أو زجاجة ملفوفة احباط. مباشرة قبل الاستخدام، تمييع الحل 100 ميكرومتر الأسهم قبل 10/1 إلى العقيمة H 2 O لجعل حل العاملة من 10 ميكرومتر لفحوصات الانزيم.
- إعداد محلول المخزون من 100 ملي العازلة بيكربونات عن طريق إذابة 8.4 غرام من NaHCO <الفرعية> 3 في 1 LH 2 O والتعقيم. تمييع هذا الحل الأسهم 1/20 إلى H 2 O معقمة حسب الحاجة لجعل الحل يعمل من 5 ملم لفحوصات الانزيم.
2. تنظيم عينات المياه على 96 صفيحة ميكروسكوبية حسنا الأسود
- تنظيم صفيحة ميكروسكوبية لكل انزيم اقتداء هو مبين في الشكل 2. لاحظ أن السماح للنسخ المتماثل كافية، والمعايير، والضوابط، وهذا الإجراء يمكن مقايسة نشاط إنزيم واحد لمدة تصل إلى تسعة عينات من المياه على واحد أسود 96 صفيحة ميكروسكوبية جيدا.
- صب حوالي 5 مل من العينة الأولى إلى خزان ماصة واستخدام pipettor 8 قنوات لpipette200 ميكرولتر في جميع الآبار في العمود 1 من صفيحة ميكروسكوبية (ق). تجاهل نصائح ماصة المستعملة وكرر حسب الحاجة لكل عينة المياه لملء الأعمدة 1-9.
3. إنشاء نموذج، قياسي، إرو، وعناصر التحكم الركيزة
- إعداد الضوابط لحساب العينات، ومعيارق، الركيزة والتبريد في نفس صفيحة ميكروسكوبية الأسود كما العينات (الشكل 2).
- عينة الضوابط تحتوي على الماء وعينة العازلة بيكربونات، والتي لا تستخدم في العمليات الحسابية النشاط ولكن سوف تثبت قراءة الاتساق طوال فترة التجربة. تتكون الضوابط إخماد عينة من الماء وكمية قياسية من العلامة الفلورسنت وتستخدم لقياس حيود مضان في الماء العينة. مصنوعة الركيزة والضوابط القياسية حتى من العازلة إما مرتبطة الركيزة أو علامة الفلورسنت القياسية، على التوالي، وبيكربونات.
- صب حوالي 5 مل من 5 ملي العازلة بيكربونات في خزان ماصة نظيفة. ماصة 50 ميكرولتر من العازلة في آبار صفيحة ميكروسكوبية من 1 إلى 9 في صفوف D و E لتشكيل اثنين من تكرار الآبار الضوابط عينة كل عينة. نصائح تغير ماصة ثم نقل 200 ميكرولتر من العازلة بيكربونات إلى الآبار من 10 إلى 12 في الصفوف ألف وحاء
- خفض الإضاءة المحيطة عن طريق يعتم أو إيقاف لىghts كمعيار الفلورسنت خفيفة حساسة.
- صب حوالي 5 مل من 10 ميكرومتر 4 methylumbelliferone في خزان ماصة نظيفة. ماصة 50 ميكرولتر في آبار صفيحة ميكروسكوبية من 1 إلى 12 في صف H، وإلى الآبار من 1 إلى 9 في صفوف G و F لتشكيل ثلاثة مكررات الضوابط إخماد لكل عينة والتحكم القياسية الشاملة. إما وضع صفيحة ميكروسكوبية في الظلام أو تغطية مع غطاء غير شفاف للحد من تدهور ضوء MUB.
- بدوره على التألق وانشاء أي برنامج من الضروري أن تكون على استعداد لقراءة قبل إضافة الركيزة. ملاحظة: قد تتطلب بعض المصابيح التألق وقت الاحماء لمدة 3 دقائق أو أكثر.
- صب حوالي 5 مل من الركيزة MUB المرتبطة المناسبة (على سبيل المثال 4-MUB فوسفات) إلى الخزان ماصة نظيفة. استخدام pipettor 12 قناة لماصة 50 ميكرولتر في آبار صفيحة ميكروسكوبية من 1 إلى 12 في صف A، وإلى الآبار من 1 إلى 9 في الصفوف B و C لتشكيل ثلاثة فحوصات تكرار لكل عينة وثلاثة عناصر تحكم الركيزة. فوراذ انتقل إلى الخطوة 4.1، وتسجيل مضان.
4. تسجيل الإسفار
- قراءة مضان الأولي مباشرة بعد الركيزة بالإضافة إلى صفيحة ميكروسكوبية. بعد قراءة مضان، احتضان صفيحة ميكروسكوبية RT (22 ° C) إما في الظلام أو مغطاة بغطاء غير شفاف للحد من تدهور ضوء MUB.
- وفترة حضانة اللازمة لقياس الحد الأقصى للنشاط انزيم المحتملة في عينة المياه تعتمد على تركيز الانزيم داخل العينة. لأن هذا غير معروف قبل أن يتم الانتهاء من الفحص، فإن صفيحة ميكروسكوبية يجب أن تقرأ في خطوات زمنية متعددة. عادة، والقراءة على فترات من 10-15 دقيقة على مدار الساعة 1 هو مقبول بالنسبة للعديد من الإنزيمات، وعلى الرغم من أن العينات مع النشاط عالية جدا لبعض الأنزيمات قد يصل إلى ذروته قبل 10 دقيقة.
- مواصلة القراءة مضان في صفيحة ميكروسكوبية على فترات الخاص المعين لمدة 1 ساعة على الأقل. تأكد للحفاظ على صفيحة ميكروسكوبية مغطاة أو في الظلام بين القراءةق.
5. حساب نشاط انزيم في حجم المياه
- لكل عينة في كل فترة زمنية حساب: يعني الأولية عينة مضان (الآبار D و E)، ومتوسط العينة النهائية مضان (الآبار AC)، ومضان يعني القياسية (الآبار H10-11)، ويعني إخماد السيطرة مضان (الآبار FG).
- لكل فترة زمنية، وحساب نشاط انزيم في nmoles ساعة -1 مل -1 من المعادلة:
نشاط انزيم = (يعني العينة مضان - يعني الأولية عينة مضان) / ((يعني معيار مضان / 0.5 مول) × (يعني إرواء السيطرة مضان / يعني مضان القياسية) × (0.2 مل) × (الوقت في ساعة))
- دراسة القيم النشاط يحسب لكل خطوة الوقت. تحديد النشاط المحتملة النهائي من الخطوة الوقت وفقا لأعلى نشاط. إذا استمرت قيم النشاط لزيادة ثم قد يكون مطلوبا الخطوات وقت لاحق، وإذا القيم النشاط يسقط ماراالحوت مسار المدى، ثم تشغيل مرة أخرى مع خطوات زمنية أقصر. النشاط الأخير هو في nmoles من الركيزة المستهلكة ساعة -1 مل -1 ولكن يمكن زيادتها للتعبير عن مثل μmoles ساعة -1 L -1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
التربة والرواسب المائية وعادة ما يكون مستويات ملحوظة من نشاط انزيم خارج الخلية نتيجة للمجتمعات الميكروبية المرفقة (الأغشية الحيوية) تنمو على سطح الجسيمات. الشكل 3 يبين كيف يغير هذا النشاط اعتمادا على حجم الجسيمات التي تم الحصول عليها من الرواسب السطحية من ثلث تيار النظام في شمال ولاية ميسيسيبي، الولايات المتحدة الأمريكية. وقد أظهرت دراسة سابقة أن المجتمعات البكتيرية على جزيئات الرسوبيات من هذا التيار يمكن فصلها إلى ثلاث مجموعات متميزة على أساس تحليل الجزيئي للبنية مجتمعهم: 0.063 مم على تلك الجسيمات، تلك على 0.125، 0.25، 0.5 ملم والجزيئات، وتلك في 1 ملم الجسيمات 15. تحليل أنماط في نشاط انزيم خارج الخلية يدعم هذا الاستنتاج، مع الفوسفاتيز (الشكل 3A) كونها مماثلة على 0.125، 0.25، 0.5 ملم وجسيمات ولكن أعلى من ذلك بكثير على 0.063 مم 1 وكسور عندما تقاس باستخدام ع المرتبطة NP تقنية الركيزة. Oالانزيمات ذر مثل β جلوكوزيد (الشكل 3B)، وناغاسي (الشكل 3C) تظهر قمم مماثلة على أرقى الجسيمات، ولكن لم يتم مرتفعة في 1 ملم الجسيمات، وتسليط الضوء على حقيقة أن إنزيمات مختلفة قد تظهر توزيعات بيئية مختلفة ويمكن أن تكون هذه توضيح استخدام هذا الاختبار. تظهر أشرطة الخطأ منخفضة نسبيا أن المقايسات اللونية من نشاط انزيم على الرواسب هي استنساخه، وبالتالي قابلة للتحليل الإحصائي عند مقارنة عينات بيئية مختلفة.
المياه الطبيعية تميل إلى أن تكون أقل نشاط انزيم خارج الخلية لكل مل من التربة أو الرواسب القيام غ لكل. على هذا النحو، فإنها يجب أن يعاير fluorometrically باستخدام ركائز MUB مرتبطة الشكل 4 يوضح كيفية نشاط الفوسفاتيز الانزيمات (الشكل 4A)، β جلوكوزيد (الشكل 4B)، وناغاسي (الشكل 4C) يختلف مع عمق في بحيرة ضحلة في شمال ولاية ميسيسيبي، الولايات المتحدةA. البحيرة (بحيرة Boondoggle) أنه من المعروف أن المواد الغذائية الفقيرة 16، والذي اقترح أيضا النشاط عالية نسبيا من الفوسفاتيز (الشكل 4A)، وهو الانزيم الذي ينتج الكائنات الدقيقة من أجل الحصول على الفوسفات من المركبات العضوية. لكل ثلاثة من الانزيمات يعاير، أظهرت العينات التي تم جمعها على سطح الماء (0 سم) وعمق 50 سم نشاط مماثل، في حين تم رفع النشاط في العينة 100 سم. وقد اتخذ هذا النموذج أساسا من واجهة المياه الرواسب، ووجود جزيئات الرسوبيات في العينة المرجح تمثل النشاط العالي ينظر في هذه العينة، وخاصة بالنسبة للβ جلوكوزيد وناغاسي. كما هو الحال مع ركائز ص NP، تظهر أشرطة الخطأ منخفضة أنه حتى مع ثلاثة فقط قراءات تكرار واستنساخ للفحوصات فلوروميتريك باستخدام ركائز MUB عالية.
لاحظ أن وحدة الشكل 4 لفي nmoles من الركيزة المستهلكة في حين أن الشكل 3 لفي μmoles من الركيزة المستهلكة، على الرغم من أن حجم وحدة لكل مشابه (إما في مل أو غ لكل). هذا يسلط الضوء على حقيقة أن التربة والرواسب تميل إلى أن تكون خارج الخلية النشاط أعلى بكثير من المياه الطبيعية (أنشطة كل انزيم معين في الشكل 3 ما يقرب من 10-100X أعلى من أنشطة انزيم ما يعادلها في الشكل 4). فإنه يدل أيضا على زيادة حساسية هذه التقنية الركيزة MUB مرتبطة، وضرورة استخدام هذه التقنية لمعايرة نشاط انزيم خارج الخلية في عينات المياه.
الشكل 1. التخطيط المقترح للكتل 96 بئر عميقة جيدا للمقايسة من نشاط انزيم خارج الخلية في التربة أو الرواسب باستخدام ف ق مرتبطة NP اللونيةتقنية ubstrate. كل جيدا ينبغي أن تتلقى ما مجموعه 300 ميكرولتر، تتكون من الطين عينة، حل الركيزة، أو العازلة خلات تبعا ما إذا كان هو تشغيل العينة، ومراقبة العينة، أو السيطرة الركيزة.
الشكل 2. تخطيط اقترح من 96 microplates جيدا السوداء للمقايسة من نشاط انزيم خارج الخلية في عينات المياه باستخدام تقنية الركيزة فلوروميتريك MUB المرتبطة. يمكن ترتيب تسعة عينات عموديا على لوحة (A) كل ثمانية آبار الاحتلال. وتستخدم هذه الآبار ثمانية أشواط لعينة، وضوابط العينة، وإرواء الضوابط في حين تستخدم الآبار المتبقية للضوابط والمعايير الركيزة MUB (B).
الرقم 3. كان يعاير نشاط انزيم خارج الخلية على أحجام مختلفة من جسيمات الرواسب السطحية التي تم جمعها من تيار صغير في شمال ولاية ميسيسيبي، الولايات المتحدة الأمريكية. كل حجم الجسيمات جزء لنشاط الفوسفاتيز (A)، β جلوكوزيد (B)، وناغاسي (C) بعد ع NP-الركيزة الإجراء اللونية. وذكر النشاط في μmoles الركيزة المستهلكة ساعة -1 غرام وزن جاف من الرواسب و-1 هو يعني (+ SE) من ثلاث قراءات تكرار في حجم الجسيمات الكسر.
الشكل 4. نشاط انزيم خارج الخلية في المياه التي اتخذت في ثلاثة المتنوعةخمتلفة أعماق (0، 50، و 100 سم) من بحيرة ضحلة في شمال ولاية ميسيسيبي، وكان يعاير الولايات المتحدة الأمريكية. المياه لنشاط الفوسفاتيز (A)، β جلوكوزيد (B)، وناغاسي (C) بعد MUB الركيزة الإجراء فلوروميتريك. وذكر النشاط في nmoles الركيزة تستهلك ح -1 مل من الماء -1 و هو يعني (+ SE) من ثلاث قراءات تكرار لكل عينة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يمكن تحديد النشاط من مجموعة متنوعة من الانزيمات خارج الخلية الجرثومية في التربة والرواسب توفير معلومات مفيدة في معدلات تمعدن المواد الغذائية ومعالجة المواد العضوية 17. ومع ذلك، يمكن التربة تختلف في مستويات الرطوبة، لذلك فمن المهم لتوحيد النشاط على التربة الوزن الجاف. هذا يتطلب خطوة إضافية التجفيف (عادة من يومين) أبعد من مجرد قياس نشاط الإنزيم. وبالتالي، على النقيض من المقايسات من نشاط انزيم في عينات المياه التي توفر قرب نتائج لحظية، فحوصات موثوقة من نشاط انزيم في التربة والرواسب يستغرق بضعة أيام. بالنسبة لبعض أنواع التربة، قد تكون أكثر ملائمة للتعبير عن النشاط في كل غرام من المواد العضوية أو الرماد حرة كتلة جافة، الأمر الذي يتطلب خطوة إضافية ashing (عادة 2 ساعة في 500 درجة مئوية) إلى ما بعد إجراء التجفيف. بغض النظر، فإن الخطوة الأكثر أهمية في مقايسة اللونية من التربة أو الرواسب نشاط انزيم هو الانسحاب من طاف من آبار عميقة كتلة وollowing الطرد المركزي في نهاية فترة الحضانة. لأن هذا الإجراء يعتمد على قياس الامتصاصية، وحتى وجود عدد قليل من جزيئات التربة طائشة في صفيحة ميكروسكوبية النهائي يمكن أن يؤدي إلى نتائج زائفة. الطرد المركزي بسرعة أعلى (> 5،000 x ج) قد يساعد على تخفيف هذه المشكلة، ولكن في تجربتنا مراوح الطرد المركزي التي تقبل microplates وعادة ما يكون حدود التناوب دون هذه العتبة، والكتل أنفسهم قد لا تحمل سرعات أعلى من ذلك بكثير. أساسا، هذه الخطوة pipetting لمعين يتطلب مزيجا من الرعاية وسرعة لاستخدام pipettor متعدد القنوات لنقل بسرعة المبلغ المطلوب من طاف من كتلة العميقة جيدا للصفيحة ميكروسكوبية.
المقايسات من نشاط انزيم خارج الخلية في عينات المياه لا تملك الحاجة لفترة التجفيف ولا خطوة الطرد المركزي، وهذا الأخير لأن كلا من رد فعل انزيم الركيزة وقياس مضان من المنتج النهائي تحدث في نفس صفيحة ميكروسكوبية. على هذا النحو، وهذه لssays وعادة ما تكون أسرع وأسهل قد تظهر في البداية لتشغيل. ومع ذلك، لديهم قيود خاصة بهم في ذلك، كلما كان ذلك ممكنا، لا ينبغي أن يتعرض معيار MUB وركائز MUB المرتبطة للضوء. في تجربتنا، ويعتم الاضواء بقدر ما هو ممكن خلال pipetting لواحتضان microplates في الظلام (أو مغطاة بغطاء غير شفاف) هو ضرورة. لأن تتطلب هذه المقايسات أيضا لوحات يمكن ان تقرأ في نقاط زمنية متعددة، وهذا غالبا ما يؤدي إلى الحاجة إلى التحول السريع جدا بين لوحات عندما يعاير الانزيمات متعددة في نفس الوقت. على سبيل المثال، من أجل مقايسة تسعة عينات من المياه لنشاط الانزيمات ستة في وقت واحد (أي باستخدام ستة مختلفة microplates)، يصبح من الضروري لقراءة لوحة كل 2 دقيقة لمدة 1 ساعة لضمان أن كل لوحة على حدة قراءة كل 10 -15 دقيقة (في هذه الحالة، كل 12 دقيقة). يجب توخي الحذر للحفاظ على المسار من لوحة خاصة يتم قراءتها، وكذلك لضمان عدم تسرب السائل جيئة وذهابام لوحة كما يتم نقله إلى والخروج من التألق صفيحة ميكروسكوبية. عندما يعاير أنزيمات متعددة في آن واحد، فإنه من المهم أيضا أن نأخذ في الاعتبار الوقت الذي يستغرقه للقارئ صفيحة ميكروسكوبية لقراءة الواقع لوحة وقراءة لارباك فترات وفقا لذلك. وهناك قلق النهائي مع مقايسة الفلورسنت من نشاط انزيم خارج الخلية في عينات المياه عند العمل مع العينات التي هي عكر. وينبغي أن تهز عينات المياه التي تحتوي على الجسيمات العالقة قبل صب في البداية في خزان ماصة ويخلط مرة أخرى عن طريق سحب وإخراج مع pipettor قبل أن يتم تحميلها على صفيحة ميكروسكوبية. أرقام أعلى من الجزيئات في عينة أيضا النتائج عادة في تبريد أكبر للإشارة الفلورسنت، والتي لا يمكن شدد على أهمية الضوابط إخماد لكل عينة كافية.
في حين تظهر ركائز MUB وص NP-V مرتبطة عادة مماثلة القيم القصوى للأنزيمات البيئية، والقيم K ميمكن أن تختلف، والإنزيمات مثل β-glucosidases وphosphatases قد يكون أعلى النسب للركائز MUB المرتبطة بهم من ع المرتبطة NP النظير 14. لذلك، من المرجح أن تكون أكثر حساسية من تلك المرتبطة ص NP، مما يوحي بأنهم سيكونون خيارا أفضل لاستخدامها عند قياس نشاط انزيم في التربة والرواسب ركائز MUB المرتبطة. ولكن المنتج النهائي الفلورة أن يقاس خلال فحوصات MUB يخضع لتبريد المحتملة في بعض مقتطفات التربة، ويمكن أن تكون غير مستقرة قراءات مضان بمرور الوقت 12. التربة والرواسب تميل إلى أن يكون أعلى نشاط انزيم خارج الخلية من المياه الطبيعية، وبالتالي فإن حساسية المتزايدة للفحوصات فلوروميتريك MUB مرتبطة قد تقدم ميزة ما يزيد قليلا على الطرق ص NP اللونية بالنظر إلى المشاكل المحتملة مع التبريد عند تحليل بعض أنواع التربة. كملاحظة جانبية، ع ركائز مرتبطة NP ومعيار ص NP نفسها عادة ما تكون أكثر affordaبلي من نظرائهم MUB؛ سببا إضافيا لاستخدامها إذا تطبيق قيود الميزانية.
ربما كان الجانب الأكثر أهمية من أن تكون قادرة على مقايسة نشاط انزيم الميكروبية خارج الخلية في البيئات المائية والأرضية هو أنه في حين أن قياس هذه التقنيات العمليات الفسيولوجية الجرثومية، وهذه العمليات لها تأثير مباشر على التحولات مستوى النظام الإيكولوجي من الكربون والمواد المغذية. تم معدلات التحلل المادة العضوية مرتبطة مباشرة إلى نشاط السليلوزات خارج الخلية في الرواسب 18،19، بحيث قياسات السريع للنشاط انزيم يحتمل تسهيل تحديد أسعار لحظية تحلل الوضع الطبيعي في العينات البيئية في. باستخدام أساليب عالية الإنتاجية صفيحة ميكروسكوبية يسمح لقياس وقت واحد من نشاط انزيم في أعداد أكبر من عينات من النهج أنبوب واحد أكثر نموذجية، بحيث التباين في نشاط انزيم (واستطرادا في عمليات مستوى الأنظمة الإيكولوجية) في التركيبيمكن فحص onse إلى عوامل مثل عمق 20 أو الاضطرابات البيئية 9،21. وبالمثل، فحوصات الإنزيمات المشاركة في تدوير المغذيات، مثل الفوسفاتيز وناغاسي، يمكن أن توفر نظرة ثاقبة الحد المغذيات في بيئات محددة، على سبيل المثال، فإن الأهمية النسبية لالفوسفور العضوية والنيتروجين العضوي خلال تطوير التربة 8.
لأنه قد تم قياس الأنشطة الإنزيمية في العينات البيئية لأكثر من ثلاثين عاما، والمقارنات بين الدراسات المتقدمة باستخدام الفوقية تحليلات أصبحت الآن ممكنة. وتشير هذه الدراسات أنه، على الصعيد العالمي، نشاط انزيم، وبالتالي معدلات التحلل المادة العضوية وتمعدن المواد الغذائية، وترتبط درجة الحموضة، وتوافر الركيزة، والمغذيات العناصر المتفاعلة 17. في نفس الوقت، واستخدام بروتوكول القائم على صفيحة ميكروسكوبية وقد بدأ السماح للتحليل أنماط مقياس جيد في نشاط انزيم باستخدام تقنيات رسم الخرائط الجيوإحصائية 22
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
وقدمت التمويل لجوانب هذا العمل من مختلف المصادر بما في ذلك الولايات المتحدة وزارة الزراعة الاتفاق التعاوني النوعي 58-6408-1-595 والمؤسسة الوطنية للعلوم (الجائزة 1049911).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS AND MATERIALS | |||
| Glacial acetic acid | Various suppliers | ||
| Sodium acetate | Various suppliers | ||
| Sodium hydroxide | Various suppliers | ||
| p-Nitrophenol | Fisher | BP612-1 | Alternates available |
| p-Nitrophenyl (pNP)-phosphate | Sigma | N3234 | pNP-substrate |
| pNP-β-glucopyranoside | Sigma | N7006 | pNP-substrate |
| pNP-β-N-acetylglucosaminide | Sigma | N9376 | pNP-substrate |
| Clear 96-well microplates | Fisher | 12-563-301 | Alternates available |
| 96-well deep well blocks | Costar | 3958 | Alternates available |
| Aluminum weigh pans | Various suppliers | ||
| Sterile 15 ml centrifuge tubes | Various suppliers | ||
| Sterile 50 ml centrifuge tubes | Various suppliers | ||
| 4-Methylumbelliferone | Sigma | M1381 | |
| 4-Methylumbelliferyl (MUB)-phosphate | Sigma | M8883 | MUB-substrate |
| 4-MUB-glucopyranoside | Sigma | M3633 | MUB-substrate |
| 4-MUB-N-acetylglucosaminide | Sigma | M2133 | MUB-substrate |
| Sodium bicarbonate | Various suppliers | ||
| Black 96-well microplate | Costar | 3792 | |
| Pipette reservoir | Various suppliers | ||
| EQUIPMENT | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Centrifuge rotor | Eppendorf | A-4-81 | For microplates/deep-well blocks |
| Microplate reader | BioTek | Synergy HT | Alternates available |
| Microplate fluorometer | BioTek | FLx 800 | Alternates available |
| 8-channel pipettor | Various suppliers | ||
References
- Ljungdahl, L. G., Eriksson, K. -E. Ecology of microbial cellulose degradation. Advances in microbial ecology. 8, 237-299 (1985).
- Sinsabaugh, R. L., Antibus, R. K., Linkins, A. E., Mclaugherty, C. A., Rayburn, L., Repert, D., Weiland, T. Wood decomposition over a first-order watershed: mass loss as a function of lignocellulase activity. Soil biology and biochemistry. 24, 743-749 (1992).
- Dalal, R. C. Soil organic phosphorus. Advances in agronomy. 29, 83-113 (1977).
- Sinsabaugh, R. L., Moorhead, D. L. Resource allocation to extracellular enzyme production: a model for nitrogen and phosphorus control of litter decomposition. Soil biology and biochemistry. 26, 1305-1311 (1995).
- Tabatabai, M. A., Bremner, J. M. Use of p-nitrophenyl phosphate for assay of soil phosphatase activity. Soil biology and biochemistry. 1, 301-307 (1969).
- Parham, J. A., Deng, S. P. Detection, quantification and characterization of β-glucosaminidase activity in soil. Soil biology and biochemistry. 32, 1183-1190 (2000).
- Kuperman, R. G., Carreiro, M. M. Soil heavy metal concentrations, microbial biomass and enzyme activities in a contaminated grassland ecosystem. Soil biology and biochemistry. 29, 179-190 (1997).
- Olander, L. P., Vitousek, P. M. Regulation of soil phosphatase and chitinase activity by N and P availability. Biogeochemistry. 49, 175-190 (2000).
- Jackson, C. R., Vallaire, S. C. Effects of salinity and nutrient enrichment on microbial assemblages in Louisiana wetland sediments. Wetlands. 29, 277-287 (2009).
- Hoppe, H. -G. Significance of exoenzymatic activities in the ecology of brackish water: measurements by means of methylumbelliferyl-substrates. Marine ecology progress series. 11, 299-308 (1983).
- Somville, M. Measurement and study of substrate specificity of exoglucosidase activity in eutrophic water. Applied and environmental microbiology. 48, 1181-1185 (1984).
- Freeman, C., Liska, G., Ostle, N. J., Jones, S. E., Lock, M. A. The use of fluorogenic substrates for measuring enzyme activity in peatlands. Plant and soil. 175, 147-152 (1995).
- Sinsabaugh, R. L., Findlay, S., Franchini, P., Fischer, D. Enzymatic analysis of riverine bacterioplankton production. Limnology and oceanography. 42, 29-38 (1997).
- Marx, M. -C., Wood, M., Jarvis, S. C. A microplate fluorometric assay for the study of enzyme diversity in soils. Soil biology and biochemistry. 33, 1633-1640 (2001).
- Jackson, C. R., Weeks, A. Q. Influence of particle size on bacterial community structure in aquatic sediments as revealed by 16S rRNA gene sequence analysis. Applied and environmental microbiology. 74, 5237-5240 (2008).
- Canion, A. K., Ochs, C. The population dynamics of freshwater armored dinoflagellates in a small lake in Mississippi. Journal of freshwater ecology. 20, 617-626 (2005).
- Sinsabaugh, R. L., Lauber, C. L., et al. Stoichiometry of soil enzyme activity at global scale. Ecology letters. 11, 1252-1264 (2008).
- Jackson, C. R., Foreman, C. M., Sinsabaugh, R. L. Microbial enzyme activities as indicators of organic matter processing rates in a Lake Erie coastal wetland. Freshwater biology. 34, 329-342 (1995).
- Jackson, C. R., Vallaire, S. C. Microbial activity and decomposition of fine particulate organic matter in a Louisiana cypress swamp. Journal of the north american benthological society. 26, 743-753 (2007).
- Jackson, C. R., Liew, K. C., Yule, C. M. Structural and functional changes with depth in microbial communities in a tropical Malaysian peat swamp forest. Microbial ecology. 57, 402-412 (2009).
- Rietl, A. J., Jackson, C. R. Effects of the ecological restoration practices of prescribed burning and mechanical thinning on soil microbial enzyme activities and leaf litter decomposition. Soil biology and biochemistry. 50, 47-57 (2012).
- Smart, K. A., Jackson, C. R. Fine scale patterns in microbial extracellular enzyme activity during leaf litter decomposition in a stream and its floodplain. Microbial ecology. 58, 591-598 (2009).
