Summary
Mikroplade baserede procedurer er beskrevet for det kolorimetriske eller fluorometriske analyse af ekstracellulært enzymaktivitet. Disse procedurer giver mulighed for hurtig analyse af en sådan aktivitet i stort antal miljøprøver inden for et overskueligt tidsrum.
Abstract
Meget af næringsstofomsætning og kulstof forarbejdning i naturlige miljøer det sker gennem aktiviteten af ekstracellulære enzymer frigivet af mikroorganismer. Således kan måling af aktiviteten af disse ekstracellulære enzymer giver indsigt i satserne for økosystemet niveau processer, såsom organisk stof nedbrydning eller kvælstof og fosfor mineralisering. Analyser af ekstracellulær enzymaktivitet i miljøprøver involverer typisk udsætte prøverne kunstige kolorimetriske eller fluorometriske substrater og sporing hastigheden af substrat hydrolyse. Her beskriver vi mikroplatte baserede metoder for disse procedurer, der tillader analyse af et stort antal prøver inden for en kort tidsramme. Prøverne får lov til at reagere med kunstige substrater i mikroplader med 96 brønde eller dyb brønd mikroplade blokke, og enzymaktiviteten efterfølgende bestemt ved absorption eller fluorescens af det resulterende slutprodukt anvendelse af en typisk mikroplade reader eller fluorometer. Sådanne high throughput procedurer ikke blot lette sammenligninger mellem rumligt forskellige steder eller økosystemer, men også i væsentlig grad reducere omkostningerne ved sådanne analyser ved at mindske de samlede reagens nødvendige per prøve mængder.
Introduction
Mikroorganismer, såsom bakterier og svampe finde næringsstoffer og kulstof fra komplekse organiske forbindelser gennem produktion af ekstracellulære enzymer. Disse enzymer typisk hydrolysere polymerer i mindre underenheder, der kan tages i cellen. Derfor, ved et økologisk niveau disse mikrobielle ekstracellulære enzymer er ansvarlig for meget af næringsstof mineralisering og nedbrydning af organisk materiale, der forekommer i naturlige miljøer. Enzymer, såsom cellobiohydrolase (CBH), og β-glucosidase er vigtige for cellulose nedbrydning og arbejde i fællesskab at katalysere hydrolyse af cellulose til glucose 1,2, der tilvejebringer en anvendelige carbonsubstrat til mikrobiel optagelse og assimilation. Enzymet fosfatase frigiver opløselige uorganiske fosfat grupper fra organofosfater, hovedsagelig mineraliserende fosfat og gøre den tilgængelig til brug for de fleste organismer 3. Andre enzymer, såsom N-acetylglucosaminidase (NAGase) er important i kitin nedbrydning og kan gøre både kulstof og kvælstof til rådighed for mikrobiel erhvervelse 4..
En af de nærmere vilkår for analysen af mikrobiel ekstracellulær enzymaktivitet i naturlige miljøer er brugen af kunstige p-nitrophenyl (p NP) forbundne substrater, en tilgang, der oprindeligt blev udviklet til at detektere jord fosfataseaktivitet 5.. Denne tilgang er baseret på påvisning af et farvet slutprodukt, p-nitrophenol, som frigives, når den kunstige substrat hydrolyseres af det relevante enzym. P-nitrophenol kan efterfølgende kvantificeres kolorimetrisk ved at måle dets absorbans på omkring 400-410 nm. Denne metode er siden blevet anvendt til påvisning af andre enzymer, såsom NAGase 6, og har været anvendt i forskellige undersøgelser ser på mikrobiel ekstracellulære enzymaktivitet i jord og sedimenter 7-9.
En alternativ fremgangsmåde, der var originally udviklet til at vurdere ekstracellulær glucosidaseaktivitet i vandmiljøer 10,11 gør brug af 4-methylumbelliferon (MUB) i tilknytning substrater. Slutproduktet frigivet (4-methylumbelliferon) er meget fluorescerende og kan påvises ved hjælp af et fluorometer med en excitation / emission indstillingen omkring 360/460 nm. En række MUB forbundne kunstige substrater er til rådighed, tillader fluorometrisk måling af aktiviteten af mindst lige så mange enzymer (fx β-glucosidase, cellobiohydrolase, Nagase, phosphatase), som kan analyseres ved hjælp af p NP-substrat kolorimetrisk procedure. Andre mikrobielle ekstracellulære enzymer, såsom protein-nedbrydende leucinaminopeptidase, kan analyseres fluorometrisk under anvendelse af 7-amino-4-methylcoumarin (COU) i tilknytning substrater. Både MUB-og DA-forbundne substrater er blevet anvendt til at bestemme enzymaktivitet i forskellige terrestriske og akvatiske prøver 12,13.
Mens tidligere undersøgelser har descrIbed fluorometriske eller kolorimetrisk mikroplade tilgange til at bestemme ekstracellulær enzymaktivitet 14, og der er behov for en klar præsentation af, hvordan til at gennemføre sådanne analyser. Her vi demonstrere procedurer for højt gennemløb mikroplade teknikker til analyse af ekstracellulære enzymaktivitet i jord og sedimenter ved hjælp af kolorimetrisk p NP-bundne substrater tilgang og i naturlige farvande ved hjælp af fluorescerende MUB-bundne substrater teknik. Vi fokuserer på måling af aktiviteterne i β-glucosidase, NAGase, og phosphatase som disse enzymer kan bindes til carbon, nitrogen og fosfor cykling, hhv. Imidlertid kan de her beskrevne procedurer kan anvendes til måling af andre ekstracellulære enzymer ved hjælp af forskellige kunstige substrater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Kolorimetrisk analyse af Extracellular enzymaktivitet i Jordbund og sediment
1.. Forberedelse af underlaget og Buffer Løsninger til Farvemåletekniske Analyser af enzymaktivitet
- Forbered 50 mM acetatpuffer (pH 5,0-5,5) ved at blande 50 ml 0,1 M eddikesyre (2,87 ml iseddike i 500 ml vand), 150 ml 0,1 M natriumacetat og 200 ml destilleret H2O PH justeres til 5,0-5,5 med 0,1 M eddikesyre, hvis nødvendigt.
- Der fremstilles en opløsning af 1 M natriumhydroxid (NaOH) i destilleret H2O
- Forbered p NP-linked substratopløsninger i 50 mM acetat buffer. For at analysere phosphatase forberede 5 mM p NP-phosphat i 50 mM acetatpuffer, at analysere β-glucosidase forberede 5 mM p NP-β-glucopyranosid; at analysere NAGase forberede 2 mM pNP-β-N-acetylglucosaminide. Forberede alle substrat løsninger i sterile 15 ml eller 50 ml centrifugerør. Løsninger kan opbevares ved 4 ° C i 2-3 uger.
2. Bestemmelse af en standard til at konvertere Absorbans til p NP Koncentration
- Forbered standardløsninger af p-nitrophenol i 50 mM acetat buffer. Koncentrationerne bør ligge ,025-1 mM.
- Overførsel tre replikater af 100 pi af hver koncentration til en klar 96-brønds mikrotiterplade. Tilsæt 10 gl 1 M NaOH, og 190 pi destilleret H2O til hver brønd.
- Optag absorbans ved 410 nm under anvendelse af en mikropladelæser.
- Multiplicer koncentrationer i standardkurven med 0,3 for at få pmol p NP pr 300 gl reaktion volumen. Tegn en kurve over absorbansen vs pmol p NP. Hældningen af kurven tjener som omregningsfaktoren (C), der vedrører absorbansmålinger pmol p NP i hvert enzym reaktion.
3. Gennemførelsen enzymassayet
- For jord, forberede en opslæmning af hver prøve, der skal analyseres i et sterilt 15 ml centrifugerør på en concentrtion på cirka 1 g / ml -1 anvendelse af 50 mM acetatpuffer. For sedimenter, tilføje nok acetat buffer til at gøre gyllen nemt pipettable. Den nøjagtige mængde gylle behov vil variere i forhold til antallet af enzymer analyseret, men det anbefales minimum 5 ml. Vortex hver gylle indtil alle klumper af jord eller sediment har spredt og bemærk det endelige volumen.
- Re-vortex hver opslæmning og straks pipetteres 150 ul i hver af seks brønde på en 96-brønds Deepwell blok (figur 1). Det er vigtigt at vortex grundigt og ofte for at holde jordpartikler i suspension. Efterlad mindst to brønde pr blok tomme til at tjene som substrat kontrol. Bemærk: klip enden af pipettespidser med en saks før afpipettering som jord slam tendens til at tilstoppe tips. Forbered en 96-brønds blok for hvert enzym, der skal analyseres.
- Hæld cirka 5 ml acetatbuffer i en pipette reservoir og en 8-kanals pipette til at tilføje 150 pi af buffer til last to brønde af hver prøve (disse vil være prøvepuffer kontroller), og de to substrat kontrolbrønde (figur 1)
- Hæld cirka 10 ml af den passende p NP-substratopløsning i en pipette reservoir og en 8-kanals pipette til at tilføje 150 pi substratopløsning til de første fire brønde af hver prøve, og de to substrat kontrolbrønde (figur 1). Bemærk tiden som reaktionen begynder, så snart tilsættes substratopløsningen.
- Pladerne inkuberes ved stuetemperatur (22 ° C) i 0,5-4 timer. Præcis inkubationstid vil variere afhængig af aktivitet i prøver, og enzymet, der skal analyseres. For de fleste jorde og sedimenter, fosfatase og β-glucosidase kræve inkubationstider på 0,5-1,5 timer, mens NAGase og andre enzymer kræver inkubationstider på> 2 timer.
- Mens assays inkubering forberede klart mikroplader med 96 brønde for at læse absorbansen. Forbered en mikroplade for hver Deepwell blok (dvs. for hver enzyme analyseret). Pipetter 10 pi 1 M NaOH, og 190 pi destilleret vand i hver brønd i mikropladen. Bemærk: NaOH forsinker den enzymatiske reaktion og hæver pH-værdien, som forbedrer farven af p NP frigivet under reaktionen.
- Efter inkubation centrifugeres 96 brønds blokke ved 2000-5000 x g i 5 min for at pelletere jordpartikler.
- Brug en multikanalpipette til at trække 100 pi fra hver brønd, være omhyggelig med at undgå pillen, og overføre den til den tilsvarende godt på forberedt klar mikroplade med 96 brønde.
- Tænd mikropladelæseren og nedsætte nødvendige software. Optag absorbans ved 410 nm. Hvis absorbansen af en bestemt og er over den lineære detektionsgrænse pladelæser fortyndes, godt med vand 1:1 og re-foranstaltning. Hvis absorbans er stadig for høj, skal analysen gentages med en kortere inkubationstid.
4.. Bestemmelse af tørvægt af prøver
- 1 ml af hver sampl e opslæmning i en i forvejen vejet aluminium pan.
- Tør i en 75 ° C tørreovn for 48 timer og vejes. Fratræk vægten af gryden fra denne værdi for at få den tørre masse af jord eller sediment i 1 ml af opslæmningen. Multipliceres med en faktor på 0,15 for at bestemme tørvægten af prøven i 150 pi tilsættes til hver brønd i enzymassayet.
5.. Beregning af enzymaktivitet pr tør masse af jord eller sediment
- Beregn den endelige absorbans af hver prøve ved at trække prøven kontrol absorbans fra prøven analysen absorbans. Hvis substrat kontroller har høj absorbans (groft> 0,060), derefter trække dem også.
- Beregn enzymaktivitet i pmol hr -1 g tørvægt -1 fra ligningen:
Enzymaktivitet = Endelig absorbans / (C x inkubationstid x prøve tørvægt)
Fluorescerende Analyse af Extracellular enzymaktivitet i naturlige vande
TLE "> 1. Fremstilling af substrat, Standard og Buffer løsninger til fluorometrisk Analyser af enzymaktivitet- Forbered 200 uM opløsninger af MUB forbundne substrater (fx 4-MUB-β-glucopyranosid, 4-MUB-phosphat, 4-MUB-N-acetyl-β-D-glucosaminid) ved at opløse passende substrat i sterilt (autoklaveret) destilleret H2O i sterile 15 ml eller 50 ml centrifugerør. Wrap rør i aluminiumfolie for at udelukke lys og opbevares i køleskabet før brug. Substrater bør være stabil i mindst 1 uge, hvis den opbevares på denne måde.
- Forbered en MUB standard ved at lave en stamopløsning på 100 pM 4-methylumbelliferon i sterilt destilleret H 2 O. Opbevares i køleskab i rav eller folie-indpakkede flaske. Umiddelbart før brug fortyndes 100 uM stamopløsning af 1/10 i sterilt H2O at gøre en brugsopløsning på 10 uM til enzymassays.
- Forbered en stamopløsning af 100 mM bicarbonatpuffer ved at opløse 8,4 g NaHCO <sub> 3 i 1 LH 2 O og autoklavering. Denne stamopløsning 1/20 Fortynd i sterilt H 2 O som nødvendige for at gøre en arbejdsgruppe opløsning af 5 mM for enzymassays.
2. Organisering af vandprøver på en 96-Well Black Mikroplade
- Arrangere en mikroplade hvert enzym efter den i figur 2 viste eksempel. Bemærk, at tillade tilstrækkelig replikation, standarder og kontroller kan denne procedure analysere aktiviteten af et enkelt enzym til op til ni vandprøver på en 96-brønds sort mikrotiterplade.
- Hæld cirka 5 ml af den første prøve i en pipette reservoir og bruge en 8-kanals pipette til pipette200 ul i alle brønde i kolonne 1 i mikroplade (r). Kassér brugte pipettespidser og gentag efter behov for hver vandprøve at fylde spalter 1-9.
3. Opsætning Sample, Standard, Quench, og substrat Controls
- Opsæt kontrol for at redegøre for prøver, standards, substrat og bratkøling på samme sort mikrotiterplade som prøver (figur 2).
- Sample kontrollerne indeholder prøve vand og bikarbonat buffer, og ikke anvendes i beregningerne aktivitet, men vil demonstrere læsning sammenhæng i hele løbet af forsøget. Dæmpningen kontroller består af prøve vand og en standard mængde af det fluorescerende mærke og anvendes til at måle diffraktion af fluorescens i prøven vand. Substrat og standard kontroller består af enten substrat-bundet eller standard fluorescerende tag, henholdsvis og bicarbonatbuffer.
- Hæld cirka 5 ml 5 mM bicarbonat buffer i en ren pipette reservoiret. Pipetter 50 pi buffer i mikropladebrønde 1 til 9 i Rækker D og E til at danne to replikere brønde af kontrol prøve pr prøve. Skift pipettespidser derefter overføre 200 pi bikarbonat buffer til hul 10 til 12 i række A og H.
- Reducer omgivende belysning ved at dæmpe eller slukke lights som fluorescerende standard er lysfølsomt.
- Hæld cirka 5 ml af 10 uM 4-methylumbelliferon i en ren pipette reservoiret. Pipette 50 ul i mikropladebrønde 1 til 12 i række H, og i brønde 1 til 9 i Rækker G og F for at danne tre gentagelser af quench kontroller pr prøve og overordnede standard kontrol. Enten placere mikropladen i mørke eller dække med en uigennemsigtig låg for at mindske lys nedbrydning af MUB.
- Tænd fluorometer og set-up enhver nødvendig software til at være klar til at læse, før du tilføjer underlaget. Bemærk: Nogle fluorometer løg kan kræve en opvarmningstid på 3 min eller mere.
- Hæld cirka 5 ml af den passende MUB-bundet substrat (f.eks 4-MUB-phosphat) i en ren pipette reservoiret. Anvend en 12-kanals pipette at pipettere 50 gl i mikropladebrønde 1 til 12 i række A og i brønde 1 til 9 i række B og C til dannelse af tredobbelte assays for hver prøve og tre substrat kontrol. Immediately videre til trin 4.1, optagelse fluorescens.
4.. Optagelse Fluorescens
- Læs indledende fluorescens umiddelbart efter substrat over mikropladen. Efter at have læst fluorescens, inkuberes mikropladen på RT (22 ° C) enten i mørke eller belagt med en uigennemsigtig låg for at mindske lys nedbrydning af MUB.
- Inkubationstiden for at måle den maksimale potentielle enzymaktivitet i en vandprøve, vil afhænge af enzymets koncentration i prøven. Da dette er ukendt inden analysen er afsluttet, vil mikropladen skal læses på flere tidstrin. Typisk aflæsning ved intervaller på 10-15 min i løbet af 1 time er acceptabelt for mange enzymer, selvom prøver med meget høj aktivitet for visse enzymer kan toppe før 10 min.
- Fortsæt læsning fluorescens i mikropladen på din udpegede intervaller i mindst 1 time. Sørg for at holde mikropladen dækkes eller i mørke mellem læsningsek.
5.. Beregning af enzymaktivitet pr vandvolumen
- For hver prøve på hvert tidsinterval beregne: betyde oprindelige stikprøve fluorescens (brønde D og E), den gennemsnitlige endelige prøve fluorescens (brønde AC), den gennemsnitlige standard fluorescens (brønde H10-11), og den gennemsnitlige slukke kontrol fluorescens (brønde FG).
- For hvert tidsinterval, beregne enzymaktivitet i nmol hr -1 ml -1 fra ligningen:
Enzymaktivitet = (betyde prøve fluorescens - betyde oprindelige stikprøve fluorescens) / ((gennemsnitlig standard fluorescens / 0,5 mol) x (gennemsnitlig dæmpning kontrol fluorescens / betyde standard fluorescens) x (0,2 ml) x (tid i hr))
- Undersøg aktivitet er beregnet for hver gang trin. Bestem endelig potentielle aktivitet fra det tidspunkt trin med den højeste aktivitet. Hvis aktivitetsværdier fortsætte med at stige, kan der kræves senere tidspunkter trin, hvis aktivitet værdier falder througHout løbet af kørslen, derefter køre igen med kortere trin. Afsluttende aktivitet er i nmol substrat forbrugt hr -1 ml -1 men kan skaleres op til at udtrykke som pmol hr -1 L -1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Jord og akvatiske sedimenter typisk have mærkbare niveauer af ekstracellulær enzym aktivitet som følge af vedhæftede mikrobielle samfund (biofilm) vokser på overfladen af partikler. Figur 3 viser, hvordan denne aktivitet skifter afhængigt af størrelsen af partikler opnået fra overfladesedimentet en tredje For strøm i det nordlige Mississippi, USA. En tidligere undersøgelse har vist, at de bakterielle samfund på partikler sediment fra denne strøm kan opdeles i tre forskellige grupper baseret på molekylær analyse af deres samfunds struktur: dem på 0,063 mm partikler, dem på 0,125, 0,25 og 0,5 mm partikler, og de på 1 mm partikler 15. Analyse af mønstre i ekstracellulær enzymaktivitet understøtter denne konklusion; med phosphatase (figur 3A) er ens på 0,125, 0,25, og 0,5 mm partikler, men meget højere på de dele, 1 og 0,063 mm, når der måles ved hjælp af p NP-bundet substrat teknik. Other enzymer såsom β-glucosidase (figur 3B), og NAGase (figur 3C) viser lignende toppe på de fineste partikler, men er ikke forhøjet på 1 mm partikler, der fremhæver, at forskellige enzymer kan vise forskellige miljømæssige distributioner, og disse kan være belyst ved hjælp af dette assay. De relativt lave fejlsøjler viser, at kolorimetriske assays enzymaktivitet på sedimenter er reproducerbare, og dermed gøres til genstand for statistisk analyse, når man sammenligner forskellige miljøprøver.
Naturlige vandområder tendens til at have lavere ekstracellulær enzymaktivitet pr ml end jord og sedimenter gøre per gram. Som sådan skal de analyseres fluorometrisk hjælp MUB forbundne substrater. Figur 4 viser, hvordan aktiviteten af enzymer phosphatase (figur 4A), β-glucosidase (figur 4B) og NAGase (figur 4C) varierer med dybden i en lavvandet sø i det nordlige Mississippi, USAA. sø (Boondoggle Lake) vides at være næringsfattig 16, som også er foreslået af den relativt høje aktivitet af phosphatase (figur 4A), et enzym, der producerer mikroorganismer for at opnå phosphat fra organiske forbindelser. For alle tre af de enzymer, analyserede prøver indsamlet på vandoverfladen (0 cm) og 50 cm dybde viste lignende aktivitet, mens aktiviteten blev forhøjet i prøven 100 cm. Denne prøve blev hovedsagelig taget fra vand-sediment interface, og tilstedeværelsen af sediment partikler i prøven sandsynligvis tegner sig for den højere aktivitet set i denne prøve, især for β-glucosidase og NAGase. Som med de p NP-substrater, de lave fejlsøjler viser, at selv med kun tre replikat aflæsninger, reproducerbarheden af fluorometriske assays under anvendelse af MUB substrater er høj.
Bemærk, at enheder til figur 4 er i nmol substrat forbruges mens de for figur 3er i pmol substrat forbrugt, selvom enhedsstørrelse er sammenlignelig (enten per ml eller pr g). Dette understreger, at jord og sedimenter tendens til at have meget højere ekstracellulær aktivitet end naturlige vandområder (aktiviteterne i enkelte specifikke enzym i figur 3 er cirka 10-100x højere end aktiviteterne i det tilsvarende enzym i figur 4). Den viser også øget følsomhed af MUB-linked substrat teknik, og nødvendigheden af at bruge denne teknik til at analysere ekstracellulær enzymaktivitet i vandprøver.
Figur 1. Foreslåede layoutet af 96-brønds dyb godt blokke til analysen af ekstracellulær enzymaktivitet i jord og sedimenter ved hjælp af kolorimetriske p NP-linked substrate teknik. Hver brønd bør modtage i alt 300 ul, der består af prøve gylle, substratopløsning eller acetat buffer afhængigt af, om det er en prøve køre, prøve kontrol, eller substrat kontrol.
Figur 2. Foreslåede layout af 96 brønde sort mikroplader til analysen af ekstracellulære enzymaktivitet i vandprøver ved hjælp af fluorometriske MUB-linked substrat teknik. Ni prøver kan arrangeres lodret på pladen (A) hver besætter otte brønde. Disse otte brønde anvendes til prøve kørsler, kontrol stikprøver, og slukke kontrol, mens de resterende brønde anvendes til substrat kontrol og MUB standarder (B).
Figur 3. Ekstracellulær enzymaktivitet på forskellige størrelser af overflade sediment partikler indsamlet fra en lille strøm i det nordlige Mississippi, USA. Hver fraktion partikelstørrelse blev analyseret for aktivitet phosphatase (A), β-glucosidase (B) og NAGase (C) efter p NP-substrat kolorimetrisk procedure. Aktivitet er rapporteret i pmol substrat forbruges hr -1 g tørvægt sediment -1 og er middelværdien (+ SE) af tredobbelte aflæsninger pr fraktion partikelstørrelse.
Figur 4.. Ekstracellulært enzymaktivitet i vand taget på tre forskelskellige dybder (0, 50, og 100 cm) fra en lavvandet sø i det nordlige Mississippi, blev USA. Vand analyseret for aktiviteten af phosphatase (A), β-glucosidase (B), og NAGase (C) efter MUB-substrat fluorometrisk procedure. Aktivitet er rapporteret i nmol substrat forbruges h -1 ml vand -1 og er middelværdien (+ SE) af tredobbelte aflæsninger pr prøve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bestemmelse af aktiviteten af en række mikrobielle ekstracellulære enzymer i jord og sedimenter kan give nyttig indsigt i satserne for næringsstof mineralisering og organisk stof behandling 17. Men jordbunden kan variere i deres fugtniveau, så det er vigtigt at standardisere aktivitet i jorden tørvægt. Dette kræver et ekstra tørring trin (typisk af to dage) end blot at måle enzymaktivitet. Således i modsætning til assays af enzymaktivitet i vandprøver, der giver nær øjeblikkelige resultater, pålidelige assays af enzymaktivitet i jord og sedimenter tage et par dage. For nogle jorde, kan det endda være mere hensigtsmæssigt at udtrykke aktivitet per gram organisk stof eller aske gratis tørvægt, kræver en ekstra foraskning trin (typisk 2 timer ved 500 ° C) over tørring procedure. Uanset hvad, den mest afgørende skridt i den kolorimetriske assay af jord eller sediment enzymaktivitet er tilbagetrækningen af supernatanten fra den dybe brønd blok fave centrifugering ved slutningen af inkubationsperioden. Da denne fremgangsmåde er baseret på måling af absorbans kan endda tilstedeværelsen af et par omstrejfende jordpartikler i den endelige mikroplade føre til falske resultater. Højere centrifugering hastigheder (> 5.000 xg), kan bidrage til at afbøde dette problem, men vores erfaring centrifuger, der accepterer mikroplader normalt har rotations grænser under denne tærskel, og blokkene selv kan ikke tåle meget højere hastigheder. Væsentlige, denne særlige pipettering trin kræver en kombination af pleje og hastighed til at bruge en multi-kanal pipette til hurtigt at overføre den nødvendige mængde af supernatanten fra den dybe brønd blok til mikropladen.
Assays ekstracellulære enzymaktivitet i vandprøver hverken har behov for en tørreperiode eller centrifugeringstrin sidstnævnte fordi både enzym-substrat-reaktion, og måling af fluorescensen af slutproduktet forekommer i den samme mikroplade. Som sådan disse enssays er typisk hurtigere og kan i første omgang synes nemmere at køre. Men de har deres egne begrænsninger i det, når det er muligt, bør MUB standard og MUB forbundne substrater ikke udsættes for lys. Det er vores erfaring, dæmpe lyset så meget et muligt under pipettering og inkubere mikroplader i mørke (eller belagt med en uigennemsigtig låget) er en nødvendighed. Fordi disse assays kræver også plader, der skal læses på forskellige tidspunkter, resulterer dette ofte i et behov for et meget hurtigt skift mellem pladerne, når analyse af flere enzymer på samme tid. For eksempel med henblik på at analysere ni vandprøver til aktiviteten af seks enzymer samtidigt (dvs. under anvendelse af seks forskellige mikroplader), bliver det nødvendigt at læse en plade for hver 2 minutter i 1 time for at sikre, at hver enkelt plade læses hver 10 -15 min (i dette tilfælde hver 12 min.) Skal der drages omsorg for at holde styr på den særlige plade bliver læst, samt at sikre, at der ikke blev spildt from pladen, som det er overført til og ud af mikroplade fluorometer. Når analyse af flere enzymer på en gang, er det også vigtigt at huske på den tid, det tager for mikropladelæseren til rent faktisk at læse pladen og at vakle læse intervaller i overensstemmelse hermed. En sidste bekymring med fluorescenstest af ekstracellulær enzymaktivitet i vandprøver er, når du arbejder med prøver, der er uklare. Vandprøver, der indeholder suspenderede partikler skal rystes før oprindeligt hælde ind i pipetten reservoir og blandes igen ved at trække og udskubning med pipette, inden den lastes på mikropladen. Stigningen i antallet af partikler i en prøve, typisk resulterer også i en større afkøling af det fluorescerende signal, og betydningen af quench kontrol for hver prøve kan ikke understreges nok.
Mens MUB-og P NP-forbundne substrater typisk vise lignende V max værdier for miljø-enzymer, K m-værdierkan variere, og enzymer, såsom β-glucosidaser og phosphataser kan have højere affinitet for MUB forbundne substrater end deres p NP-bundne analoger 14. Derfor er det sandsynligt, at være mere følsomme end dem der er knyttet til p NP, hvilket tyder på, at de ville være et bedre valg til at bruge, når måle enzymaktivitet i jord og sedimenter MUB forbundne substrater. Men det fluorogene slutprodukt, der er målt under MUB assays er underlagt potentiel quenching i nogle jordekstrakter, og fluorescens målinger kan være ustabil over tid 12. Jord og sedimenter også en tendens til at have højere ekstracellulær enzymaktivitet end naturlige vandområder, så den øgede følsomhed fluorometriske MUB forbundne assays kan tilbyde lidt fordel over de kolorimetriske p NP-metoder på grund af de potentielle problemer med quenching ved analysen bestemte jorder. Som en side bemærkning, de p NP-linked substrater og p NP standard selv er generelt mere affordaBle end deres MUB kolleger, en yderligere grund til deres brug, hvis budgetmæssige begrænsninger anvendes.
Måske er det vigtigste aspekt af at være i stand til at analysere mikrobiel ekstracellulær enzymaktivitet i akvatiske og terrestriske miljøer er, at mens disse teknikker måle mikrobielle fysiologiske processer, disse processer har en direkte indflydelse på økosystemet niveau transformationer af kulstof og næringsstoffer. Satser for nedbrydningen af organisk materiale har været direkte knyttet til aktiviteten af ekstracellulære cellulaser i sedimenter 18,19, således at hurtige målinger af enzymaktivitet potentielt lette afgørelsen af øjeblikkelige in situ nedbrydning satser i miljøprøver. Brug High throughput mikroplatte tilgange giver mulighed for samtidig måling af enzymaktivitet i større antal prøver end mere typiske enkelt rør tilgange, således at variationen i enzymaktivitet (og i forlængelse heraf i økosystemet niveau processer) i hhvonse faktorer såsom dybde 20 eller miljømæssige forstyrrelser 9,21 kan undersøges. Tilsvarende analyser af enzymer involveret i næringsstofomsætning, såsom fosfatase og NAGase kan give indsigt i næringssaltbegrænsning i bestemte miljøer, for eksempel, den relative betydning af organisk fosfor til organisk kvælstof under udvikling jord 8.
Fordi enzymaktiviteter er blevet målt i miljøprøver i over tredive år, er sammenligninger mellem studier ved hjælp af avancerede metaanalyser nu ved at blive muligt. Sådanne undersøgelser tyder på, at der på globalt plan, enzym-aktivitet, og derfor satser for nedbrydningen af organisk materiale og næringsstoffer mineralisering, er bundet til pH, substrat tilgængelighed og næringsstoffer støkiometri 17. Samtidig har anvendelsen af en mikrotiterplade-baseret protokol begyndt at tillade analyse af fine skælmønstre i enzymaktivitet med geostatistiske kortlægningsteknikker 22
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Midler til aspekter af dette arbejde blev leveret af forskellige kilder, herunder USA Department of Agriculture Specifik samarbejdsaftale 58-6408-1-595 og National Science Foundation (tildeling 1.049.911).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS AND MATERIALS | |||
| Glacial acetic acid | Various suppliers | ||
| Sodium acetate | Various suppliers | ||
| Sodium hydroxide | Various suppliers | ||
| p-Nitrophenol | Fisher | BP612-1 | Alternates available |
| p-Nitrophenyl (pNP)-phosphate | Sigma | N3234 | pNP-substrate |
| pNP-β-glucopyranoside | Sigma | N7006 | pNP-substrate |
| pNP-β-N-acetylglucosaminide | Sigma | N9376 | pNP-substrate |
| Clear 96-well microplates | Fisher | 12-563-301 | Alternates available |
| 96-well deep well blocks | Costar | 3958 | Alternates available |
| Aluminum weigh pans | Various suppliers | ||
| Sterile 15 ml centrifuge tubes | Various suppliers | ||
| Sterile 50 ml centrifuge tubes | Various suppliers | ||
| 4-Methylumbelliferone | Sigma | M1381 | |
| 4-Methylumbelliferyl (MUB)-phosphate | Sigma | M8883 | MUB-substrate |
| 4-MUB-glucopyranoside | Sigma | M3633 | MUB-substrate |
| 4-MUB-N-acetylglucosaminide | Sigma | M2133 | MUB-substrate |
| Sodium bicarbonate | Various suppliers | ||
| Black 96-well microplate | Costar | 3792 | |
| Pipette reservoir | Various suppliers | ||
| EQUIPMENT | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Centrifuge rotor | Eppendorf | A-4-81 | For microplates/deep-well blocks |
| Microplate reader | BioTek | Synergy HT | Alternates available |
| Microplate fluorometer | BioTek | FLx 800 | Alternates available |
| 8-channel pipettor | Various suppliers | ||
References
- Ljungdahl, L. G., Eriksson, K. -E. Ecology of microbial cellulose degradation. Advances in microbial ecology. 8, 237-299 (1985).
- Sinsabaugh, R. L., Antibus, R. K., Linkins, A. E., Mclaugherty, C. A., Rayburn, L., Repert, D., Weiland, T. Wood decomposition over a first-order watershed: mass loss as a function of lignocellulase activity. Soil biology and biochemistry. 24, 743-749 (1992).
- Dalal, R. C. Soil organic phosphorus. Advances in agronomy. 29, 83-113 (1977).
- Sinsabaugh, R. L., Moorhead, D. L. Resource allocation to extracellular enzyme production: a model for nitrogen and phosphorus control of litter decomposition. Soil biology and biochemistry. 26, 1305-1311 (1995).
- Tabatabai, M. A., Bremner, J. M. Use of p-nitrophenyl phosphate for assay of soil phosphatase activity. Soil biology and biochemistry. 1, 301-307 (1969).
- Parham, J. A., Deng, S. P. Detection, quantification and characterization of β-glucosaminidase activity in soil. Soil biology and biochemistry. 32, 1183-1190 (2000).
- Kuperman, R. G., Carreiro, M. M. Soil heavy metal concentrations, microbial biomass and enzyme activities in a contaminated grassland ecosystem. Soil biology and biochemistry. 29, 179-190 (1997).
- Olander, L. P., Vitousek, P. M. Regulation of soil phosphatase and chitinase activity by N and P availability. Biogeochemistry. 49, 175-190 (2000).
- Jackson, C. R., Vallaire, S. C. Effects of salinity and nutrient enrichment on microbial assemblages in Louisiana wetland sediments. Wetlands. 29, 277-287 (2009).
- Hoppe, H. -G. Significance of exoenzymatic activities in the ecology of brackish water: measurements by means of methylumbelliferyl-substrates. Marine ecology progress series. 11, 299-308 (1983).
- Somville, M. Measurement and study of substrate specificity of exoglucosidase activity in eutrophic water. Applied and environmental microbiology. 48, 1181-1185 (1984).
- Freeman, C., Liska, G., Ostle, N. J., Jones, S. E., Lock, M. A. The use of fluorogenic substrates for measuring enzyme activity in peatlands. Plant and soil. 175, 147-152 (1995).
- Sinsabaugh, R. L., Findlay, S., Franchini, P., Fischer, D. Enzymatic analysis of riverine bacterioplankton production. Limnology and oceanography. 42, 29-38 (1997).
- Marx, M. -C., Wood, M., Jarvis, S. C. A microplate fluorometric assay for the study of enzyme diversity in soils. Soil biology and biochemistry. 33, 1633-1640 (2001).
- Jackson, C. R., Weeks, A. Q. Influence of particle size on bacterial community structure in aquatic sediments as revealed by 16S rRNA gene sequence analysis. Applied and environmental microbiology. 74, 5237-5240 (2008).
- Canion, A. K., Ochs, C. The population dynamics of freshwater armored dinoflagellates in a small lake in Mississippi. Journal of freshwater ecology. 20, 617-626 (2005).
- Sinsabaugh, R. L., Lauber, C. L., et al. Stoichiometry of soil enzyme activity at global scale. Ecology letters. 11, 1252-1264 (2008).
- Jackson, C. R., Foreman, C. M., Sinsabaugh, R. L. Microbial enzyme activities as indicators of organic matter processing rates in a Lake Erie coastal wetland. Freshwater biology. 34, 329-342 (1995).
- Jackson, C. R., Vallaire, S. C. Microbial activity and decomposition of fine particulate organic matter in a Louisiana cypress swamp. Journal of the north american benthological society. 26, 743-753 (2007).
- Jackson, C. R., Liew, K. C., Yule, C. M. Structural and functional changes with depth in microbial communities in a tropical Malaysian peat swamp forest. Microbial ecology. 57, 402-412 (2009).
- Rietl, A. J., Jackson, C. R. Effects of the ecological restoration practices of prescribed burning and mechanical thinning on soil microbial enzyme activities and leaf litter decomposition. Soil biology and biochemistry. 50, 47-57 (2012).
- Smart, K. A., Jackson, C. R. Fine scale patterns in microbial extracellular enzyme activity during leaf litter decomposition in a stream and its floodplain. Microbial ecology. 58, 591-598 (2009).
