Mikro baserade förfaranden beskrivs för kolorimetrisk eller fluorometrisk analys av extracellulär enzymaktivitet. Dessa förfaranden möjliggör en snabb analys av sådan verksamhet i ett stort antal miljöprover inom en hanterbar tidsram.
En stor del av näringsomsättning och kol bearbetning i naturliga miljöer sker genom verksamheten vid extracellulära enzymer som frigörs av mikroorganismer. Således kan mäta aktiviteten av dessa extracellulära enzymer ge insikter i andelen ekosystem nivå processer, exempelvis nedbrytningen av organiskt material eller kväve-och fosformineralisering. Analyser av extracellulär enzymaktivitet i miljöprover vanligtvis att utsätta proverna till artificiella kolorimetriska eller fluorometriska substrat och spåra takten substrathydrolys. Här beskriver vi mikrobaserade metoder för dessa förfaranden som tillåter analys av ett stort antal prover inom en kort tidsram. Prover tilläts reagera med artificiella substrat inom 96-brunnars mikroplattor eller djup brunn mikro block, och enzymaktiviteten bestäms därefter genom absorption eller fluorescens av den resulterande slutprodukten med användning av en typisk mikrotiterplatta Reader eller fluorometer. Sådana hög genomströmning förfaranden inte bara underlätta jämförelser mellan rumsligt skilda platser eller ekosystem, men också avsevärt minska kostnaderna för sådana analyser genom att minska de totala reagensvolymer som behövs per prov.
Mikroorganismer, såsom bakterier och svampar erhålla näringsämnen och kol från komplexa organiska föreningar genom produktionen av extracellulära enzymer. Dessa enzymer hydrolyserar vanligen polymerer i mindre subenheter som kan tas in i cellen. Därför, på en ekologisk nivå, dessa mikrobiella extracellulära enzymer är ansvariga för mycket av närings mineralisering och nedbrytningen av organiskt material som förekommer i naturliga miljöer. Enzymer såsom cellobiohydrolas (CBH) och β-glukosidas är viktiga för cellulosanedbrytning och arbetar unisont för att katalysera hydrolysen av cellulosa till glukos 1,2, vilket ger ett användbart kolsubstrat för mikrobiell upptag och assimilering. Enzymet fosfatas släpper lösliga oorganiska fosfatgrupper från organiska fosforföreningar, huvudsakligen mineraliserings fosfat och göra den tillgänglig för användning av de flesta organismer 3. Andra enzymer, såsom N-acetylglukosaminidas (NAGas), är important i kitin nedbrytning och kan göra både kol och kväve för mikrobiell förvärv 4.
En av metoderna för analys av mikrobiell extracellulär enzymaktivitet i naturliga miljöer är att använda konstgjorda p-nitrofenyl (p NP) länkade substrat, en metod som ursprungligen utvecklades för att upptäcka jord fosfatasaktivitet 5. Detta tillvägagångssätt förlitar sig på detektion av en färgad slutprodukt, p-nitrofenol, som frigörs när det artificiella substratet hydrolyseras av ett lämpligt enzym. Den p-nitrofenol kan därefter kvantifieras kolorimetriskt genom att mäta dess absorbans vid ca 400-410 nm. Metoden har sedan använts för att upptäcka andra enzymer såsom NAGas 6, och har använts i olika studier att titta på mikrobiell cellulära enzymaktivitet i mark och sediment 7-9.
Ett alternativt tillvägagångssätt som var originally utvecklats för att bedöma cellulära glukosidasaktivitet i vattenmiljöer 10,11 använder sig av 4-metylumbelliferon (MUB) länkade substrat. Slutprodukten släpps (4-metylumbelliferon) är mycket fluorescerande och kan detekteras med användning av en fluorometer med excitering / emission inställning runt 360/460 nm. En mångfald MUB-länkade artificiella substrat finns tillgängliga, vilket medger den fluorometriska mätningen av aktiviteten av åtminstone så många enzymer (t.ex. β-glukosidas, cellobiohydrolas, Nagase, fosfatas) som kan analyseras med användning av p NP-substrat kolorimetrisk procedur. Andra mikrobiella extracellulära enzymer, såsom proteinnedbrytande leucinaminopeptidas, kan analyseras fluorometriskt med användning av 7-amino-4-metylkumarin (COU) kopplade substrat. Både MUB-och COU-länkade substrat har använts för att bestämma enzymaktivitet i olika land-och vattenmiljöer prover 12,13.
Även tidigare studier har described fluorometriska eller kolorimetrisk mikro metoder för att bestämma cellulära enzymaktivitet 14, det finns ett behov av en tydlig redovisning av hur man genomför sådana analyser. Här visar vi rutiner för hög genomströmning mikrotekniker för analys av extracellulär enzymaktivitet i mark och sediment med hjälp av kolorimetriska p NP bundna substrat strategi och i naturliga vatten med hjälp av fluorescerande MUB bundna substrat teknik. Vi fokuserar på mätning av verksamheten i β-glukosidas, NAGas, och fosfatas eftersom dessa enzymer kan knytas till kol, kväve och fosfor cykling, respektive. Emellertid kan de förfaranden som beskrivs här tillämpas på mätning av andra extracellulära enzymer med användning av olika artificiella substrat.
Fastställande av aktiviteten av en mängd olika mikrobiella cellulära enzymer i mark och sediment kan ge värdefulla insikter om andelen näringsämnen mineralisering och organiskt material bearbetning 17. Emellertid kan jordar varierar i sina fuktnivåer, så det är viktigt att standardisera aktivitet till jord torrvikt. Detta kräver ett ytterligare torkningssteg (typiskt av två dagar) utöver att bara mätning av enzymaktivitet. Således, i motsats till analyser av enzymaktivitet i vattenprover som ger…
The authors have nothing to disclose.
Finansieringen för delar av detta arbete kom från olika källor inklusive Förenta staternas Department of Agriculture Specifik kooperativa avtal 58-6408-1-595 och National Science Foundation (utmärkelse 1.049.911).
REAGENTS AND MATERIALS | |||
Glacial acetic acid | Various suppliers | ||
Sodium acetate | Various suppliers | ||
Sodium hydroxide | Various suppliers | ||
p-Nitrophenol | Fisher | BP612-1 | Alternates available |
p-Nitrophenyl (pNP)-phosphate | Sigma | N3234 | pNP-substrate |
pNP-β-glucopyranoside | Sigma | N7006 | pNP-substrate |
pNP-β-N-acetylglucosaminide | Sigma | N9376 | pNP-substrate |
Clear 96-well microplates | Fisher | 12-563-301 | Alternates available |
96-well deep well blocks | Costar | 3958 | Alternates available |
Aluminum weigh pans | Various suppliers | ||
Sterile 15 ml centrifuge tubes | Various suppliers | ||
Sterile 50 ml centrifuge tubes | Various suppliers | ||
4-Methylumbelliferone | Sigma | M1381 | |
4-Methylumbelliferyl (MUB)-phosphate | Sigma | M8883 | MUB-substrate |
4-MUB-glucopyranoside | Sigma | M3633 | MUB-substrate |
4-MUB-N-acetylglucosaminide | Sigma | M2133 | MUB-substrate |
Sodium bicarbonate | Various suppliers | ||
Black 96-well microplate | Costar | 3792 | |
Pipette reservoir | Various suppliers | ||
EQUIPMENT | |||
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Centrifuge rotor | Eppendorf | A-4-81 | For microplates/deep-well blocks |
Microplate reader | BioTek | Synergy HT | Alternates available |
Microplate fluorometer | BioTek | FLx 800 | Alternates available |
8-channel pipettor | Various suppliers |