Summary
תאי גזע pluripotent, או גזע pluripotent (שב"ס) תאים עובריים או מושרה, מהווים מקור חשוב של תאים מובחנים אדם, כוללים שריר לב. כאן, אנו נתמקד באינדוקצית לב של תאי iPS, מראים כיצד להשתמש בם כדי להשיג cardiomyocytes האנושי מתפקד באמצעות פרוטוקול המבוסס על גופי embryoid.
Abstract
על מנת לחקור את אירועי נהיגה לב ופיתוח כדי לקבוע את המנגנונים המולקולריים המובילים למחלות שריר הלב בבני אדם, זה חיוני ראשון ליצירת cardiomyocytes האנושי מתפקד (CMS). השימוש בתאים אלה בגילוי תרופות ומחקרי רעלים היינו גם להיות מועילים מאוד, המאפשרים מולקולות תרופתיות חדשות לטיפול בהפרעות בלב להיות מאומת טרום קליני בתאים ממקור אנושי. המקורות האפשריים של CMS, המושרה גזע pluripotent (שב"ס) תאים הם בין המבטיח ביותר, כפי שהם יכולים להיגזר מרקמת מטופל נגישה ובעלי יכולת פנימית כדי להצמיח את כל סוגי התאים בגוף 1. מספר שיטות הוצעו להפרדת תאי iPS למערכת ניהול תוכן, הנעות בין גופי embryoid הקלסיים (EBS) גישה לפרוטוקולי צבירת הגדרה כימית 2,3. במאמר זה אנו מציעים פרוטוקול מבוסס EBS ולהראות איך זה methoיכול להיות מועסק ד כדי לייצר ביעילות תאים דמויי CM פונקציונליים מתאי iPS מזין ללא.
Introduction
מבחינה היסטורית, החקירה של המנגנונים הגנטיים ומולקולריים הנהיגה פיתוח ומחלות של בני אדם הייתה מבוססת על הדור של מודלים של בעלי חיים מהונדסים גנטי. עם זאת, פנוטיפים אדם רבים אינם מצליח להיות משוכפלים בהצלחה בעכברים, בעיקר בגלל ההבדלים הביולוגיים הקיימים בין שני המינים. מצד השני, גישה לרקמות אדם עשוי להיות מוגבל, ולעתים קרובות אינו מאפשר מספיק חומר כדי להתקבל ללימודים ניסיוניים לעומק. תחום הביולוגיה לב וכלי דם סובל משתי המגבלות האלה: הפיסיולוגיה של הלב האנושי היא שונה באופן משמעותי מזה של העכבר, וכמות משמעותית של רקמת לב היא נגישה רק נתיחה שלאחר מוות או במהלך ניתוח לב. מציאת מקור אופטימלי לבידול של תפקודי האנושי CMS לכן הפכה נושא מרכזי בביולוגיה לב וכלי דם, והרבה מאמץ נעשה כדי לטפל בבעיה זו. סוגי תאים שונים הוצעו, אניncluding myoblasts שלד, תאים מקומיים לב גזע, תאי mononuclear מח עצם, תאי אב אנדותל, ותאי גזע mesenchymal. עם זאת, נתונים שהושגו באמצעות תאים אלה לא היו עקבי 4.
הגזירה של תאי גזע עובריים אנושיים (ESC) 5 והגילוי פורץ של (IPS) תאי גזע pluripotent מושרה על ידי יאמאנאקה ותומסון 6,7 נראו תחילה מאוחר יותר כדי לספק פתרונות: התאים הללו יש את היכולת לגדול ללא הגבלת זמן ואת הפוטנציאל לתת תעלה לכל נגזרי התא של שלוש השכבות הנבט, כולל מערכת ניהול התוכן. השימוש בתאי iPS מציע יתרונות נוספים: הנגזרים מתאי בוגרים אוטולוגי, הם נושאים את אותו הגנום כפרט או המטופל שממנו הם נובעים. לכן הם מאפשרים פיתוח של מודלים במבחנה המאפשרים החקירה של מחלות גנטיות באדם ובמנגנונים של התפתחות. בכוחו של מאפיין זה, תאי iPS יכולים גם oבעיות הקשורות לvercome דחייה חיסונית וסוגיות אתיות 8. מסיבות אלה, למרות שESCs עדיין מייצג את תקן הזהב בתחום הביולוגיה של תאי גזע, בכל העולם חוקרים כיום נעים יותר לכיוון טכנולוגיית תאי iPS.
תאי iPS כעת מועסקים למודל מחלה אנושית במבחנה לתנאים שונים, כולל הפרעות מולדות 9,10 לב וכלי דם. לאחרונה, יישום של מודלים מחלה תא iPS נעשה להפרעות בלב monogenic (תסמונות QT ארוכות, טכיקרדיה חדרית כלומר פולימורפית catecholaminergic) ומוזרויות שבו מומי לב הם חלק מהפנוטיפ מורכב (כלומר Leopard ותסמונות טימותי, קרדיומיופתיה מורחבת). דוחות אלה אישר כי תאי iPS מטופל ספציפי הנבדלים לCMS להציג מאפיינים פנוטיפי ופונקציונליים דומים כמו המחלה בגוף חי.
עם זאת, ישאתגרים עדיין רבים לשפר את היעילות של תאי iPS גרימת לשושלת לב. דור הספונטני של CMS מESCs אדם דרך היווצרות המצרפי נקרא גופי embryoid (EBS) הוכיחו 17 מוצלחים. מאז הגילוי הזה, שיטות רבות אחרות שהוצעו. קבוצות רבות הגבירו מאוד את היעילות של פרוטוקול הבידול ועברה לפעול בריאגנטים תרבות הגדרה כימית וללא בעלי החיים מוצר (ראה Mummery, ג, et al., מחקר מחזור (2012) לסקירה מקיפה של כל השיטות הקיימות 3 ).
עם זאת, השיטה הקלסית המבוססת על צבירת EB עדיין מייצגת מועסק הנפוצה ביותר לביצוע מחקרים תפקודיים וחוקר מנגנוני מחלה. הפרוטוקול המוצע שלנו מבוסס על הצבירה של תאי iPS לEBS והתרבות בנוכחות חומצה אסקורבית וסרום, אשר הוכח כדי לשפר את תהליך בידול הלב ולפוsitively להשפיע על ההבשלה של תאים אלה 18,19. במאמר זה אנו נעבור על מתודולוגיה זו בפירוט ונראים כיצד להשתמש בשורות תאי iPS מזין ללא ליצירת מטופל ספציפי CMS IPS-נגזר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תחזוקה ללא מזין וPassaging של שורות תאי iPS אדם
- הכן את מנות Matrigel מצופים. הפשירו בקבוקון אחד של מטריקס ESC-מוסמך האנושי על קרח למשך שעה אחת ולדלל אותו ב25 מדיום DMEM-F12 מ"ל. הוסף 1 מ"ל לכל צלחת 35 מ"מ (או כמויות מקבילות לשטח פנים אם נעשו שימוש במנות אחרות), שמירה על כל מה שעל קרח ולהבטיח כי כל הצלחות והצינורות הם מראש מקוררים. אטמים ברדיד אלומיניום.
הערה: ריכוזי מניות Matrigel משתנות בהתאם למנה. הוראות דילול מצוינות בגיליון נתונים.
- שמור על צלחות על קרח בלילה ולהסיר מקרח ביום שלמחרת. יכולות להישמר במקרר צלחות עד שבוע לפני השימוש.
- הכן בינוני המלא mTESR1 (או להפשיר בקבוקון של מדיום Nutristem) וH-ESM (בינונית ESC אנושי) בהתאם לטבלה שלהלן.
H-ESM קונצרט כלשהו סופי עבור 500 מ"ל החלפת סרום נוקאאוט (KSR) 20% 100 מ"ל Glutamax 100X 2 מ"מ 5 מ"ל חומצות אמינו לא חיוני ממ 0.1 מ"מ 5 מ"ל פניצילין, סטרפטומיצין 100 U / מ"ל - 0.1 מ"ג / מ"ל 5 מ"ל 2-mercaptoethanol 0.1 מ"מ 900 μl תוסף B27 - בלי Vitamina 1% 10 מ"ל מוסף N2 1% 5 מ"ל נוק DMEM - 370 מ"ל
ניתן לאחסן בינוני מניית ב 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ 2 שבועות. כדי להכין מדיום גידול מלא, FGF הבסיסי הוסיף רק beforהאכלת דואר בריכוז סופי של 20 ng / ml.
הערה: שלם H-ESM מותנה בfibroblasts העכבר העוברי יכול לשמש במקום mTESR1 או Nutristem לתאי iPS.
- הנח צלחות מצופים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לשעת 2 לפני passaging.
- תאים צריכים להיות passaged בערך כל 5 ימים, גם אם הם לא הגיעו לנקודת מפגש. מושבות לא צריכים להיות נוגעות ללב.
- החלפת מדיום גידול עם 1 מ"ל של dispase (1 מ"ג / מ"ל, לפזר ממניות מ"ג / מ"ל 10 PBS).
- הסר הבחנה אזורים עם pipettes משך פסטרו זכוכית. אזורים כי יש להסיר כוללים מבנים דמויי מכתש או פיברוזיס במרכז מושבות, וכל התחום שבו תאים הפכו הופרדו ממושבות ושטוחות ונראה שנודדים החוצה.
- לדגור על 37 מעלות צלזיוס מתחת למכסת מנוע התרבות עד גבולות מושבה הפכו בהירים יותר ולהתחיל לנתק (בדרך כלל סביב דקות 5-7). Discarד dispase. לשטוף עם 1 מיליליטר H-ESM וזורקים.
- ב1 מ"ל H-ESM, השתמש מרים תא (דמוי מרית מגרד) למושבות קציר ולאסוף בצינור 15 מיליליטר אפנדורף. לשטוף עם 1 מיליליטר H-ESM ולהוסיף לצינור. ספין ב 1000 RCF למשך 4 דקות ולהסיר את supernatant.
- Resuspend גלולה ב1 מדיום גידול מחומם מראש מ"ל (או mTESR1 או Nutristem). הימנע מפירוק גושים יותר מדי - פיפטה מעלה ומטה פחות מ 6-8x. לקבוע כמה תאים צריכים להיות מצופה ולהסיר תאים מיותרים (בדרך כלל 01:04 או 01:05 דילול), למשל עבור 2 צלחות ב1:5, להסיר 600 μl, ולאחר מכן להוסיף 1.6 מיליליטר מדיום טרי.
- הסר Matrigel מצלחות. תאי מקום טיפה אחרים טיפה, הפצה באופן שווה על הצלחת. הימנע מטלטול הצינור באופן מוגזם, כמו זה יגרום לתאים לעבור לכיוון המרכז.
- לשטוף עם צינור בינוני 1 מ"ל ופער בין צלחות. נפח סופי בכל צלחת צריך להיות 1.5 -2 מ"ל.
- שנה בינונית כל יום, פרט ליום שאחרי passaging. למרות זאת הואאידיאלי לשינוי היומיומי בינונית, זה עשוי להשתנות מדי פעם בתדירות של אחת לימים, אם לא יותר מ 2-3 ימים עברו מאז המעבר האחרון מבלי להשפיע על פוטנציאל pluripotency או בידול.
- אם יש להקפיא שורת התאים, מחדש להשעות במקום ב1-2 מדיום הקפאת mFreSR מ"ל באמצעות פיפטה 2 מ"ל ומקום 1 מ"ל / cryovial. בקבוקוני מקום בcryobox ב -80 מעלות צלזיוס והעברה לחנקן נוזלי בתוך 3-4 ימים.
הערה: microdissection הידני של תאי iPS חייב להתבצע תחת stereomicroscope. (IVF) תחנת עבודה בהפריה חוץ גופית (IVF מתחנת עבודת KSystem למשל) משולבת עם stereomicroscope מאפשרת מניפולציה של התאים בתנאים סטריליים בזמן שהם שמרו על שטח פנים מחוממים. אם זה לא זמין, ניתן להעביר stereomicroscope מתחת למכסת מנוע זרימה למינרית קבועה.
2. גופי Embryoid צבירה והלב Induction
- להכין מדיום EBM-20 על פי הטבלה שלהלן.
EBM-20 קונצרט כלשהו סופי עבור 500 מ"ל סרום שור העובר (מוצא דרום אמריקה) 20% 100 מ"ל חומצות אמינו לא חיוני ממ 0.1 מ"מ 5 מ"ל פניצילין - סטרפטומיצין 100U/ml - 0.1 מ"ג / מ"ל 5 מ"ל Glutamax 100X 0.1 מ"מ 5 מ"ל 2-mercaptoethanol 50uM 450 μl DMEM/F12 - 385 מ"ל
השימוש בFBS ממוצא דרום אמריקה הוא קריטית לקביעת יעילות הבידול: תעסוקה של סוגים אחרים של סרה עלולה להשפיעתהליך ההתמיינות. כדי להכין EBM-20, חומצה אסקורבית תוספת מלאה (AA) לריכוז סופי של 50 מיקרוגרם / מ"ל. ניתן לאחסן את מדיום גידול שלם על 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מפעם אחת בשבוע. - מושבות iPS קציר כפי שתוארו לעיל (שלבים 1.6-1.9).
- Resuspend עדינות ב1 מיליליטר EBM-20 עם טפטפת מיליליטר 2. הימנע מפירוק גושים יותר מדי - פיפטה מעלה ומטה לא יותר מ 2-3x, בודק את הגודל של המושבות תחת stereomicroscope. צלחת על צלחות התקשרות נמוכות במיוחד ביחס 1:1 (למשל לצלחת 35 מ"מ, השתמש 1 גם צלחת 6 היטב). יש לשטוף את הצינור עם 1 מיליליטר EBM-20 ולהוסיף לצלחת.
הערה: הגודל של המושבות להשפיע על תהליך ההתמיינות, שליטה יעילות ועיתוי של אינדוקציה לב. צבירה של EBS הומוגנית בגודל הוכח כדי להפחית את השונות שנצפו במהלך בידול.
- ביום 3, לשנות EBM-20 פעם אחת באמצעות מיקרוסקופ כדי למנוע מחדשmoval של EBS. שמור פיפטה הקרובה לקצה של צלחת, ולהסיר את המדיום.
- ב -7 ביום, מתג EBS לצלחות מצופות 0.1% ג'לטין והניח בעבר על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. במידת צורך, ניתן להסיר ג'לטין וצלחות יצאו מתחת למכסת מנוע תרבית תאי O / נ הוסף 35-40 EBS לכל צלחת 35 מ"מ.
- בדקו EBS על הכאה ושינוי אזורי EBM-20 פעמיים בשבוע. לסמן את האזורים שבו מכים נמצאים בחלק העליון של כיסוי המנה, כדי להקל עליהם לוקליזציה תחת stereomicroscope. אזורים המתקשרים אמורים להופיע לאחר כ 10-20 ימים.
- כאשר אזורים עם התכווצות ספונטנית מופיעים, לעבור למדיום EBM-2 (להכין כEBM-20, עם 2% FBS במקום) ולבודד אותם כמתואר להלן בסעיף 3.
- תמשיך לבדוק תחומים אחרים למכות ולשנות בינוני פעמיים בשבוע עד שאזורי מכים נדרשים לניסויים נוספים.
הערה: יעילות של תהליך הבידול תלויה מאוד במספר גורמים, קריטיים ביותר שלו הם הקווים הספציפיים הסלולריים ויצווה של סרום המשמשים כדי לגרום לבידול לב. כדי להשיג היעילות הגבוהה ביותר, שורות תאי בדיקה עבור פוטנציאל cardiomyogenic וקבוצות שונות של סרום.
3. מכות בידוד והתרבות תחומי
- צלחות מעיל 12 גם (4 ס"מ אזור 2) או את הצלחות של עניין עם פיברונקטין 5 מיקרוגרם / 2 ס"מ, בדילול מלא PBS לעשות מספיק נפח כדי לכסות את כל פני השטח לחלוטין (300 סך הכל μl לכל גם ב12 גם צלחות). שמור נחשף במכסת מנוע בתרבית תאים ולאפשר לו להתייבש. יכולות להיות עטופות צלחות ומאוחסנות על 4 מעלות CO / נ
- הסר להכות אזור באמצעות זכוכית משך פיפטה פסטר ואזמל, במידת צורך. מעבירים לצלחות פיברונקטין מצופים עם טפטפת 1 מ"ל.
- הוסף 1 מ"ל EBM-2.
- לחצות את הצלחת כדי לציין את האזורים שבם הוסרו תאים ולשנות את המדיום. יכולות להיות כל הזמן צלחות לתקופה של עד חודש 1, כפי שאזורים אחרים עשויים להתחיל באכילה בשלב מאוחר יותר.
הערה: אם גושי מכות קטנים יותר יש צורך, פיפטה אזור explanted מעלה ומטה מספר פעמים תחת stereomicroscope, עד שהוא נשבר לחתיכות קטנות יותר. זה יגרום אשכולות של כמה תאי מכות (ראה סרט 3).
- שנה בינונית פעמיים בשבוע עד מוכן לניתוחים.
הערה: cardiomyocytes מתקבל מפרוטוקול זה יש מאפיינים מורפולוגיים ופונקציונליים דמוי עוברי; התבגרות כלפי פנוטיפ כמו מבוגר ניתן לקבל על ידי הגדלת הזמן בתרבות להבדיל עוד יותר תאים אלה.
4. בידוד תאי מכות בודד וניתוח
- שקופיות של 2 ס"מ (הקאמריות מעיל אזור 4 2) או תומך מתאים אחרים עם פיברונקטין 2 מיקרוגרם / 5 ס"מ מדולל PBS מספיק כדי לכסות את פני השטח כולו התרבות. אם נעשה שימוש בתמיכת זכוכית, מעיל עם laminin ופיברונקטין (5 מיקרוגרם / ס"מ <sup> 2 כל אחד).
- הסר להכות אזור עם טפטפת / אזמל פסטר מהצלחות מהסעיף 3.
- באמצעות 1 מ"ל פיפטה, תאים מעבירים צינור 15 מ"ל המכיל 500 collagenase השני μl (480 U / מ"ל PBS עם Mg ו Ca) ודגירה 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, מנער את צינור פעם אחת במהלך הדגירה.
- פיפטה מעלה ומטה עם טפטפת μl 200. אם כל גושים יישארו, להעביר לטרי collagenase השני וחזור על שלב 4.3.
- חזור על שלב 4.4 עד אין גושים גדולים נשארים.
- להשבית collagenase עם 3 מ"ל EBM-2 (לא AA). לאחר מכן ניתן להשאיר את הצינור מתחת למכסת המנוע במעמד מחומם עד צינורות אחרים מוכנים. צנטריפוגה ב RCF 1000 במשך 4 דקות.
- Resuspend גלולה ב 1 מ"ל 0.25% טריפסין / EDTA (בדילול ממנייה 0.5% ב1X PBS) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. שלב את השברים של digestions מאותה הדגימה ראשונית.
- להשבית טריפסין עם 4 מ"ל EBM-2 (לא AA). תאים עוברים דרך מחט 18G במזרק 2.5 מ"ל אין לא יותרהאן 7x. צנטריפוגה ב RCF 1000 במשך 4 דקות.
- Resuspend תא גלולה ב 1 מ"ל EBM-2 לכל טוב וצלחת. תאים יכולים לשמש לניתוח פונקציונלי ומורפולוגי 2-3 ימים לאחר ציפוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
במחקרים שלנו אנחנו נוצרו CMS מכמה שורות תאי iPS. קווים אלו נוצרו בתחילה על שכבת מזין MEF אבל הונחו מייד על Matrigel באמצעות מדיום מוגדר (או mTESR1 או Nutristem). מבחני שונים שמשמשים לאימות תחזוקה של נכסים מורפולוגיים, הביטוי של סמנים אופייניים לתאי pluripotent (OCT-4, וSSEA4 TRA1-60) ויציבות הגנום שלהם (איור 1).
גיוס לשושלת הלב היה מופעל על ידי צבירה של תאי iPS לEBS והתרבות בנוכחותו של סוג מסוים של סרום וAA (איורים 2 א ו -2). אזורים המתקשרים מיוצגים 20-35% מכלל תושבי עיר, בהתאם לקו הסלולרי משמש (איור 2 ג ו1 סרט). מתקשר CMS מבודד מאזורים אלה על ידי עיכול אנזימטי (סרט 2) הביע חלבונים מבניים cardiomyocyte טיפוסיים (טרופונין לב, ואילו אלף, אקטין sarcomeric, שרשרות שרירן כבדות וα β), חלבונים (צומת פער connexin-43), ואת תעלות היונים העיקריות (איורים 2D-2F). ניתוח אלקטרו של תאים אלה גילו אוכלוסייה הטרוגנית הכוללת תאים עם בליטה, פרוזדורים, ופרופילי חדרית (מידע לא מוצג, Priori, SG, et al., J. Clin. להשקיע., בעיתונות, 14,15,20).
איור 1. מזין ללא תחזוקת תאי iPS אינו משפיעה pluripotency. א.ב.) מושבות iPS שגודלו על Matrigel לשמור המורפולוגיה כמו ESC האנושית שלהם, עם קצות שלב בהירים וnucleoli הבולט. תקליטור) ניתוחי immunofluorescence מראים תאי iPS כראוי להביע גורם שעתוק אוקטובר -4 (C)ואנטיגן TRA1-60 פני השטח (סולם ברים: 50 מיקרומטר). (ד) (ה) ניתוח Cytofluorimetric אישר את הביטוי של אנטיגנים pluripotency פני שטח טיפוסיים (SSEA-4 וTRA1-60). אסטרטגית gating מוצגת על ידי פיזור השמאל. (F) ניתוח קריוטיפ נציג של תאי iPS שגודלו על Matrigel. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 2. בידול של תפקודי CMS IPS-נגזר. ייצוג סכמטי) של פרוטוקול הבידול. ב ') גופי embryoid הסתכמו מתאי iPS. C) ייצוג על שטח של התכווצות. ד') RT-PCR תכניתing הביטוי של כמה תעלות יונים לב ספציפיות על ידי שב"ס הנגזרות מכים גושים (CACNA1A - תעלות סידן,, מקטע 1A מתח תלוי אלפא; SCN5A - ערוץ נתרן, מתח מגודרת V, מקטע אלפא סוג,; KCNQ1 - מתח אשלגן ערוץ מגודר, KQT כמו תת משפחה, חבר 1) ושתי הצורות של שרשרת כבדה שרירן (MHC-MHC ו- B). אין ביטוי היה להבחין בתאי iPS, ואילו cDNA מתאי לב עובריים שימש כביקורת חיובית. מכתים immunofluorescence HGPRT שימש כגן משק. EF) מראה אחת IPS-CMS נגזר להביע אקטין מבני חלבון α-sarcomeric, לב טרופונין I (TNNI), וצומת לב connexin הספציפית 43 (CNX-43). סולם ברים: 50 מיקרומטר. תמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי AxioVision Zeiss הפוך וניתח עם ImageJ. לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה.
<חזק> סרט 1. מתקשר אזור שמקורם בתאים iPS. לחץ כאן לצפייה בסרט.
סרט 2. אחד מתקשר CMS IPS-נגזר, המתקבל מעיכול אנזימטי של אזור קבלנות. לחץ כאן לצפייה בסרט.
סרט 3. אשכול קבלנות קטן, שהתקבל על ידי נתיחה מכאנית חלקית. לחץ כאן לצפייה בסרט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
יש תאי גזע pluripotent פוטנציאל להבחין באופן ספונטני לCMS, אם כי ביעילות נמוכה ושונות גבוהה בין שורות. פיתוח שיטות אינדוקציה רומן ולכן התמקד בשיפור היעילות של התהליך ונע לעבר פרוטוקולים יותר מוגדרים. עם זאת, רוב שיטות הבידול החדשות אלה הם מורכבים למדי, הדורשים תנאים מורכבים תרבות, בקרת קנס של עיתוי וריכוז של חומרים כימיים, וטיפול עם ציטוקינים יקרים וגורמי גדילה. כמו כן, הבדלים ברמות האיתות ציטוקינים אנדוגניים של שורות תאי iPS השונות להבהיר את זה קשה לתקנן ריכוזים ציטוקינים, אשר לעתים קרובות חייב להיות מותאם לרמות מתאימות עבור כל שורת תאים.
הבשלה של CMS IPS-נגזר מתקבל גם מייצגת היבט קריטי לקחת בחשבון כאשר מנסים בידול לב של תאי iPS לדוגמנות מחלה ויישומי גילוי תרופות. Differentiatיון של ESCs אדם ותאי iPS בדרך כלל מוליד CMS עם כלומר הפנוטיפ עוברי ללא מבנה בוגר לחלוטין. זה נכון במיוחד כאשר משמשים monolayer גישות, וכתוצאה מכך אלה הם מתאימים יותר להפקת, הגברה, ובידוד אוכלוסיות אב לב ספציפית 2,3.
בתרחיש זה, נראית בשיטת "הקלסית" EBS הצבירה, אשר עדיין נמצא בשימוש נרחב למטרות דוגמנות מחלה, טובים יותר שתתאים לצרכי הניסוי. שיטה זו היא פשוטה, חסכונית, בקלות מבחינה מעשית, ומתאימה לכל הקווים. אין צורך בגורמי גדילה נוסף או ציטוקינים, או לעיכול מתא בודד, אשר לעתים קרובות אינם נסבלים היטב על ידי תאי iPS, כמו כן, הם דורשים טיפולים נוספים עם רוק מעכבים 21. יתר על כן, לצבירת EBS דומה לתהליך ההתפתחות הטבעי של תא pluripotent, עם EBS מתן סביבת 3 ממדים ופסקאותות crine כי הם יותר דומים לתנאים פיסיולוגיים. יתר על כן, התוספת של AA הוכח באופן עקבי על מנת לשפר את ההתמיינות של תאי iPS לב, וגם כדי לשפר את ההבשלה המבנית ותפקודית שלהם 18,19. בחירת שורות תאי iPS המבוססות על פוטנציאל קרדיוגני שלהם, יחד עם הבחירה של המנה המתאימה ביותר של סרום, עשויה לשפר עוד יותר את היעילות של דור סי.
לבסוף, השיטה המוצעת כאן יש גם את היתרון של לא דורש תאים מזינים עכבר, אשר מבטלת את האפשרות של זיהום עם תאי עכבר וגם מפשט עוד יותר את הנהלים הטכניים לiPS תא passaging והיווצרות EBS. שיטה זו מקנה יתרונות רבים ומהווה שיפור משמעותי לעומת טכניקות קודמות, פתח את הדרך ליישומי רפואת רגנרטיבית לב וכלי דם בעתיד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין אינטרסים כספיים לחשוף.
Acknowledgments
BS נתמכה על ידי אוניברסיטה של תכנית מחקר לסטודנט קיץ מילאנו-Bicocca הדרכה; מחקר נתמך מכספים של משרד בריאות האיטלקי ומשרד איטלקי לחינוך, אוניברסיטה ומחקר וFondazione Humanitas לGC, אנחנו מודה למיכאל VG Latronico לקריאה ביקורתית כתב יד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and Reagents | |||
| Human ESC-qualified Matrix | BD Biosciences | 354277 | Thaw the 5 ml bottle at 4 °C on ice O/N, aliquot in pre-chilled cryo-tubes on ice, according to the data sheet dilution instructions and store at -20 °C . |
| Fibronectin, from human plasma, 0.1% solution | Sigma | F0896-2MG | Working concentration: 5 μg/cm2 |
| Laminin | Sigma | L2020-1MG | Working concentration: 5 μg/cm2 |
| PBS (no Mg and Ca), 10X | Lonza | BE17-515F | |
| PBS (with Mg and Ca), 10X | Bio Sera | XC-S2067/500 | |
| Dispase II, neutral protease, grade II | Roche | 4942078001 | Stock: 10 mg/ml in DMEM-F12 at -20 °C, working solution: 1 mg/ml in PBS (no Mg/Ca) |
| Trypsin/EDTA, 0.5% | Sigma | T3924 | |
| Collagenase type 2 | Worthington | 4176 | Dilute to 480 U/ml (e.g. 1.6 mg/ml) in PBS with Mg and Ca |
| DMEM-F12 | Life Technologies | 21331-020 | |
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828-028 | Thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C |
| F–tal Bovine Serum (origin South America) | Invitrogen | 10270-106 | Batches should be tested for their cardiogenic potential. Thaw at 4 °C, heat-inactivate at 56 °C for 30 min, aliquot and store at -20 °C |
| PenStrep, penicillin-Streptomycin, 100X | Life Technologies | 15140-122 | |
| GlutaMAX, 100X | Life Technologies | 35050-038 | |
| MEM NEAA, 100X | Invitrogen | 11140-135 | |
| N2 supplement, 100X | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 supplement, 50X | Life Technologies | 12587-010 | |
| 2-mercapt–thanol | Invitrogen | 31350-010 | |
| Gelatin, from porcine skin | Sigma | G1890-100G | Make stock at 1% in water, store at -20 °C. Dilute to 0.1% in PBS and keep at 4 °C |
| mTeSR1 | Stem Cell Technologies | 5850 | Combine Supplement 5X with the basic medium, aliquot and store at -20 °C. Do not keep complete medium at 4 °C for more than 1 week |
| Nutristem hESC XF | Stemgent from Biological Industries | 05-100-1A | Thaw at 4 °C O/N, aliquot and store at -20 °C until use. Aliquots may be kept at 4 °C for no more than a week. |
| mFreSR | Stem Cell Technologies | 5853 | |
| Ascorbic acid | Sigma | A4544-25G | Prepare stocks at 10 mg/ml in water. Store aliquots at -20 °C in the dark. Add to EBM at the final concentration (500X) |
| Plasticware | |||
| 35 mm culture dishes | Becton Dickinson | 353001 | |
| Cell scraper | Corning Incorporated | 3008 | |
| 12-well plates | Becton Dickinson | 353043 | |
| Permanox 2-well chamber slides | Thermo Fisher Scientific | 177437 | |
| Glass 2-well chamber slides | Thermo Fisher Scientific | 177380 | |
| 6-well plates, ultra-low-attachment surface | Corning Incorporated | 3471 | |
| 18G needle | Becton Dickinson | 304622 | |
| Glass pasteur pipettes, 230 mm | VWR International | 612-1702 | |
| 2.5 ml syringe | Becton Dickinson | 300188 | |
| Equipments | |||
| IVF Workstation | KSystem, by Nikon | ||
| Nikon SMZ1500 Stereomicroscope | Nikon | ||
References
- Di Pasquale, E., Latronico, M. V., Jotti, G. S., Condorelli, G. Lentiviral vectors and cardiovascular diseases: a genetic tool for manipulating cardiomyocyte differentiation and function. Gene Therapy. 19, 642-648 (2012).
- Laflamme, M. A., Murry, C. E.
- Mummery, C. L., et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circulation Research. 111, 344-358 (2012).
- Wu, S. M., Chien, K. R., Mummery, C. Origins and fates of cardiovascular progenitor cells. Cell. 132, 537-543 (2008).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Yamanaka, S. A fresh look at iPS cells. Cell. 137, 13-17 (2009).
- Josowitz, R., Carvajal-Vergara, X., Lemischka, I. R., Gelb, B. D. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as models for genetic cardiovascular disorders. Curr. Opin. Cardiol. 26, 223-229 (2011).
- Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134, 877-886 (2008).
- Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465, 808-812 (2012).
- Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N. Engl. J. Med. 363, 1397-1409 (2010).
- Yazawa, M., et al. Using induced pluripotent stem cells to investigate cardiac phenotypes in Timothy syndrome. Nature. 471, 230-234 (2011).
- Itzhaki, I., et al. Modeling of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia with patient-specific human-induced pluripotent stem cells. Journal of the American College of Cardiology. 60, 990-1000 (2012).
- Jung, C. B., et al. Dantrolene rescues arrhythmogenic RYR2 defect in a patient-specific stem cell model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. EMBO Molecular Medicine. 4, 180-191 (2012).
- Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4, 130ra147 (2012).
- Kehat, I., et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. The Journal of Clinical Investigation. 108, 407-414 (2001).
- Cao, N., et al. Ascorbic acid enhances the cardiac differentiation of induced pluripotent stem cells through promoting the proliferation of cardiac progenitor cells. Cell Research. 22, 219-236 (2012).
- Takahashi, T., et al. Ascorbic acid enhances differentiation of embryonic stem cells into cardiac myocytes. Circulation. 107, 1912-1916 (2003).
- Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N. Engl. J. Med. 363, 1397-1409 (2011).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25, 681-686 (2007).
