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Biology

मानव cardiomyocytes की पीढ़ी: फीडर से मुक्त मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल से एक भेदभाव प्रोटोकॉल

Published: June 28, 2013 doi: 10.3791/50429
Automatic Translation
1,2, 1, 1
1Humanitas Clinical and Research Center, Italy, 2Institute of Genetic and Biomedical Research (IRGB), National Research Council (CNR)

Summary

Pluripotent स्टेम सेल, भ्रूण या प्रेरित pluripotent स्टेम (आईपीएस) कोशिकाओं, या तो cardiomyocytes सहित मानव विभेदित कोशिकाओं का एक महत्वपूर्ण स्रोत का गठन. यहाँ, हम एक embryoid निकायों आधारित प्रोटोकॉल के माध्यम से कार्यात्मक मानव cardiomyocytes प्राप्त करने के लिए उन्हें इस्तेमाल करने के लिए कैसे दिखा, आईपीएस कोशिकाओं के हृदय की प्रेरण पर ध्यान दिया जाएगा.

Abstract

दिल विकास ड्राइविंग की घटनाओं की जांच के लिए और मानव में दौरे रोगों के लिए अग्रणी आणविक तंत्र का निर्धारण करने के लिए, यह कार्यात्मक मानव cardiomyocytes (सीएम) उत्पन्न करने के लिए सबसे पहले जरूरी है. दवाओं की खोज और विष विज्ञान के अध्ययन में इन कोशिकाओं का उपयोग भी मानव मूल की कोशिकाओं पर पूर्व चिकित्सकीय मान्य होने के लिए हृदय की बीमारियों के इलाज के लिए नई औषधीय अणुओं की अनुमति, अत्यधिक लाभकारी होगा. सीएम के संभावित स्रोतों की, प्रेरित pluripotent स्टेम (आईपीएस) कोशिकाओं वे आसानी से सुलभ मरीज ​​के ऊतकों से सीधे प्राप्त किया जा सकता है, के रूप में सबसे होनहार में से एक हैं और शरीर 1 की सभी प्रकार की कोशिकाओं को जन्म देने के लिए एक आंतरिक क्षमता के अधिकारी. कई तरीकों रासायनिक परिभाषित प्रोटोकॉल 2,3 के लिए शास्त्रीय embryoid निकायों से (ईबीएस) एकत्रीकरण दृष्टिकोण लेकर मुख्यमंत्रियों में आईपीएस कोशिकाओं फर्क के लिए प्रस्तावित किया गया है. इस अनुच्छेद में हम एक ईबीएस आधारित प्रोटोकॉल का प्रस्ताव और शो कैसे इस methoघ कुशलतापूर्वक फीडर से मुक्त आईपीएस कोशिकाओं से कार्यात्मक मुख्यमंत्री की तरह कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए नियोजित किया जा सकता है.

Introduction

ऐतिहासिक, मानव विकास और रोग ड्राइविंग आनुवंशिक और आणविक तंत्र की जांच आनुवंशिक रूप से संशोधित पशु मॉडल की पीढ़ी के आधार पर किया गया है. हालांकि, कई मानव phenotypes के सफलतापूर्वक जिसका मुख्य कारण दो प्रजातियों के बीच मौजूदा जैविक मतभेद के चूहों में दोहराया जा करने में विफल. दूसरी ओर, मानव ऊतकों के लिए उपयोग सीमित हो सकती है और अक्सर पर्याप्त सामग्री में गहराई से प्रायोगिक अध्ययन के लिए प्राप्त करने की अनुमति नहीं है. हृदय जीव विज्ञान के क्षेत्र में इन सीमाओं दोनों से ग्रस्त: मानव हृदय के शरीर क्रिया विज्ञान माउस के उस से काफी अलग है, और हृदय के ऊतकों की एक महत्वपूर्ण मात्रा केवल पोस्टमार्टम या हृदय शल्य चिकित्सा के दौरान पहुँचा जा सकता है. कार्यात्मक मानव मुख्यमंत्रियों के भेदभाव के लिए एक इष्टतम स्रोत ढूँढना इसलिए हृदय जीव विज्ञान में एक केंद्रीय विषय बन गया है, और बहुत प्रयास इस मुद्दे के समाधान के लिए किया गया है. विभिन्न कक्षों प्रकार मैं, प्रस्तावित किया गया हैncluding कंकाल myoblasts, स्थानीय हृदय की स्टेम कोशिकाओं, अस्थि मज्जा कोशिकाओं mononuclear, endothelial पूर्वज, और mesenchymal स्टेम सेल. हालांकि, डेटा 4 अनुरूप नहीं किया गया है कि इन कोशिकाओं का उपयोग कर प्राप्त की.

मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ईएससी) की व्युत्पत्ति पहले 5 और Yamanaka और थॉमसन 6,7 से प्रेरित pluripotent स्टेम (आईपीएस) कोशिकाओं का कर खोज बाद में समाधान प्रदान करने के लिए लग रहा था: इन कोशिकाओं को देने के लिए अनिश्चित काल के लिए विकसित करने की क्षमता और क्षमता है मुख्यमंत्रियों सहित तीन रोगाणु परतों के सभी सेल डेरिवेटिव, वृद्धि करने के लिए. आईपीएस कोशिकाओं के प्रयोग को आगे लाभ प्रदान करता है: ऑटोलॉगस वयस्क कोशिकाओं से व्युत्पन्न किया जा रहा है, वे प्राप्त कर रहे हैं जिसमें से व्यक्ति या रोगी के रूप में एक ही जीनोम ले. वे इसलिए मानव आनुवंशिक रोगों और विकास के तंत्र की जांच की सुविधा है कि इन विट्रो मॉडल में के विकास के लिए अनुमति देते हैं. इस विशेषता के आधार में, आईपीएस कोशिकाओं को भी कर सकते हैं ओप्रतिरक्षा अस्वीकृति और नैतिक मुद्दों 8 से संबंधित vercome समस्याओं. ESCs अभी भी स्टेम कोशिका जीव विज्ञान के क्षेत्र में सोने के मानक का प्रतिनिधित्व करते हैं, भले ही इन कारणों के लिए, शोधकर्ताओं ने दुनिया भर में अब आईपीएस सेल प्रौद्योगिकी की ओर अधिक बढ़ रहे हैं.

आईपीएस कोशिकाओं अब जन्मजात हृदय रोगों 9,10 सहित विभिन्न शर्तों, के लिए इन विट्रो में मानव रोग मॉडल करने के लिए नियोजित किया जा रहा है. हाल ही में, आईपीएस कोशिका रोग मॉडलिंग के आवेदन monogenic हृदय विकारों (यानी लंबी क्यूटी सिंड्रोम, catecholaminergic बहुरूपी ventricular tachycardia) और हृदय दोष के एक जटिल फेनोटाइप (यानी तेंदुए और टिमोथी सिंड्रोम, फैली हुई cardiomyopathy) का हिस्सा हैं जिसमें विकृतियों के लिए प्रदर्शन किया गया है. इन रिपोर्टों के मुख्यमंत्रियों में भेदभाव कर रहे हैं कि रोगी विशेष के आईपीएस कोशिकाओं vivo में रोग के रूप में समान प्ररूपी और कार्यात्मक विशेषताओं को प्रदर्शित की पुष्टि की.

हालांकि, वहाँहृदय वंश में आईपीएस कोशिकाओं उत्प्रेरण की प्रभावकारिता में सुधार करने के लिए अभी भी कई चुनौतियां हैं. कुल गठन के माध्यम से मानव ESCs से सीएम की स्वतःस्फूर्त पीढ़ी embryoid निकायों (ईबीएस) सफल 17 साबित किया है कहा जाता है. इस खोज के बाद से, कई अन्य तरीकों का प्रस्ताव किया गया है. कई समूहों बहुत भेदभाव प्रोटोकॉल की दक्षता में वृद्धि की है और (स्वांग देख, सी, एट अल., सभी मौजूदा तरीकों 3 की व्यापक समीक्षा के लिए वितरण रिसर्च (2012) रासायनिक परिभाषित और पशु उत्पाद से मुक्त संस्कृति अभिकर्मकों की ओर चले गए हैं ).

फिर भी, ईबी एकत्रीकरण पर आधारित शास्त्रीय पद्धति अभी भी सबसे अधिक कार्यात्मक अध्ययन प्रदर्शन और रोग तंत्र की जांच के लिए नियोजित प्रतिनिधित्व करता है. हमारे प्रस्तावित प्रोटोकॉल हृदय भेदभाव प्रक्रिया को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है जो सीरम और एस्कॉर्बिक एसिड, की उपस्थिति में ईबीएस में आईपीएस कोशिकाओं के एकत्रीकरण और संस्कृति पर और पुलिस के लिए आधारित हैsitively इन कोशिकाओं 18,19 की परिपक्वता को प्रभावित. इस लेख में हम विस्तार से इस पद्धति के माध्यम से जाना जाएगा और रोगी विशेष के आईपीएस व्युत्पन्न मुख्यमंत्रियों पैदा करने के लिए फीडर से मुक्त आईपीएस सेल लाइनों का उपयोग कैसे दिखाई देंगे.

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Protocol

1. मानव आईपीएस सेल लाइन्स के फीडर से मुक्त रखरखाव और Passaging

  1. Matrigel में लिपटे व्यंजन तैयार करते हैं. पिघलना एक एक घंटे के लिए बर्फ पर मानव ईएससी योग्य मैट्रिक्स की शीशी और 25 मिलीलीटर DMEM-F12 के माध्यम में यह पतला. बर्फ पर सब कुछ रखने और सभी प्लेटों और ट्यूबों पूर्व ठंडा कर रहे हैं सुनिश्चित करना है कि प्रत्येक 35 मिमी प्लेट (या अन्य बर्तन इस्तेमाल कर रहे हैं तो सतह क्षेत्र के प्रति बराबर मात्रा) को 1 मिलीलीटर जोड़ें. एल्यूमीनियम पन्नी के साथ प्लेट कवर.

नोट: Matrigel शेयर सांद्रता बैच के हिसाब से बदलती. कमजोर पड़ने निर्देश डाटा शीट पर संकेत कर रहे हैं.

  1. रात भर बर्फ पर प्लेटें रखें और अगले दिन बर्फ से हटा दें. प्लेट्स का उपयोग करने से पहले एक सप्ताह के लिए फ्रिज में रखा जा सकता है.
  2. MTESR1 पूरा मध्यम (या Nutristem माध्यम की एक शीशी पिघलना) और नीचे दी गई तालिका के अनुसार एच ईएसएम (मानव ईएससी मध्यम) तैयार करें.
    एच-ईएसएम अंतिम सान्द्र 500 मिलीलीटर के लिए
    नॉकआउट सीरम रिप्लेसमेंट (एस आर) 20% 100 मिलीलीटर
    GlutaMAX 100X 2 मिमी 5 मिलीलीटर
    सदस्य गैर आवश्यक अमीनो एसिड 0.1 मिमी 5 मिलीलीटर
    पेनिसिलीन स्ट्रेप्टोमाइसिन 100 यू / एमएल - 0.1 मिलीग्राम / मिलीलीटर 5 मिलीलीटर
    2-mercaptoethanol 0.1 मिमी 900 μl
    B27 अनुपूरक - Vitamina बिना 1% 10 मिलीलीटर
    एन 2 अनुपूरक 1% 5 मिलीलीटर
    नॉकआउट DMEM - 370 मिलीलीटर

    शेयर मध्यम से अधिक 2 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है. पूर्ण विकास मध्यम तैयार करने के लिए, बुनियादी FGF बस befor जोड़ा जाता है20 एनजी / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता में ई खिला.

नोट: माउस भ्रूणीय fibroblasts पर वातानुकूलित एच ईएसएम पूरी आईपीएस कोशिकाओं के बजाय mTESR1 या Nutristem का इस्तेमाल किया जा सकता है.

  1. Passaging से पहले 30 मिनट से 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में लेपित प्लेट रखें.
  2. कोशिकाओं वे संगम तक पहुँच नहीं है, भले ही लगभग हर 5 दिनों passaged किया जाना चाहिए. कालोनियों को छू नहीं किया जाना चाहिए.
  3. Dispase के 1 मिलीलीटर (1 मिलीग्राम / एमएल, पीबीएस में एक 10 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक से भंग) के साथ विकास के माध्यम से बदलें.
  4. खींचा कांच पाश्चर pipettes साथ क्षेत्रों फर्क निकालें. हटाया जाना चाहिए कि क्षेत्रों कालोनियों के बीच में गड्ढा की तरह या सिस्टिक संरचनाओं में शामिल हैं, और कोशिकाओं बन गए हैं, जहां किसी भी क्षेत्र कालोनियों से अलग और चपटा और बाहर की ओर पलायन करने लगते हैं.
  5. कॉलोनी सीमाओं उज्जवल हो जाते हैं और (आमतौर पर 5-7 मिनट के आसपास) से अलग करने के लिए शुरू जब तक एक संस्कृति हुड के नीचे 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. Discarघ dispase. 1 मिलीलीटर एच ईएसएम के साथ धोएं और त्यागें.
  6. 1 मिलीलीटर एच ईएसएम में, फसल कालोनियों के लिए एक सेल चोर (खुरचनी रंग की तरह) का उपयोग करें और एक 15 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब में इकट्ठा. 1 मिलीलीटर एच ईएसएम के साथ कुल्ला और ट्यूब को जोड़ने. 4 मिनट के लिए 1,000 आरसीएफ में स्पिन और सतह पर तैरनेवाला हटायें.
  7. 1 मिलीलीटर पूर्व गर्म मध्यम विकास (या तो mTESR1 या Nutristem) में resuspend गोली. बहुत ज्यादा clumps को तोड़ने से बचें - विंदुक ऊपर और नीचे कम 6 8x से. कितने कोशिकाओं को चढ़ाया जा सकता है और 1:05 पर 2 प्लेटों के लिए जैसे अनावश्यक कोशिकाओं (आमतौर पर 1:04 या 1:05 कमजोर पड़ने), दूर करना चाहिए निर्धारित 600 μl हटाने, तो 1.6 मिलीलीटर ताजा मध्यम जोड़ें.
  8. प्लेटों से Matrigel निकालें. प्लेस कोशिकाओं प्लेट पर समान रूप से वितरण, ड्रॉप द्वारा ड्रॉप. यह कोशिकाओं को केंद्र की ओर ले जाने के लिए कारण होगा, जरूरत से ज्यादा ट्यूब झटकों से बचें.
  9. प्लेटों के बीच 1 मिलीलीटर मध्यम और विभाजन के साथ ट्यूब धो लें. प्रत्येक थाली में अंतिम मात्रा 1.5 -2 मिलीग्राम होना चाहिए.
  10. Passaging के बाद दिन के लिए छोड़कर हर रोज मध्यम बदलें. हालांकि यह हैअधिक नहीं 2-3 दिनों pluripotency या भेदभाव की क्षमता को प्रभावित किए बिना पिछले पारित होने के बाद से पारित कर दिया है कि अगर मध्यम हर रोज बदलने के लिए आदर्श है, यह कभी कभी एक बार हर दो दिन के अंतराल पर बदला जा सकता है.
  11. सेल लाइन जमे हुए किया जाना चाहिए, एक 2 मिलीलीटर विंदुक और जगह 1 मिलीग्राम / cryovial का उपयोग कर 1-2 मिलीलीटर mFreSR ठंड माध्यम के बजाय फिर से निलंबित. -80 में एक cryobox में जगह शीशियों डिग्री सेल्सियस और 3-4 दिनों में तरल नाइट्रोजन को हस्तांतरण.

नोट: आईपीएस कोशिकाओं के मैनुअल सूक्षम stereomicroscope के तहत किया जाना चाहिए. वे एक गर्म सतह क्षेत्र पर रखा जाता है, जबकि एक stereomicroscope साथ एकीकृत इन विट्रो फर्टिलाइजेशन (आईवीएफ) कार्य केंद्र (जैसे KSystem से एक आईवीएफ कार्य केंद्र) बाँझ परिस्थितियों में कोशिकाओं में हेरफेर की अनुमति देता है. यह उपलब्ध नहीं है, तो एक stereomicroscope एक नियमित लामिना का प्रवाह हुड के नीचे ले जाया जा सकता है.

2. Embryoid निकायों एकत्रीकरण और कार्डिएक inductioपता

  1. नीचे दी गई तालिका के अनुसार ईबीएम-20 मध्यम तैयार.
    ईबीएम-20 अंतिम सान्द्र 500 मिलीलीटर के लिए
    भ्रूण गोजातीय सीरम (मूल दक्षिण अमेरिका) 20% 100 मिलीलीटर
    सदस्य गैर आवश्यक अमीनो एसिड 0.1 मिमी 5 मिलीलीटर
    पेनिसिलिन - स्ट्रेप्टोमाइसिन 100U/ml - 0.1 मिलीग्राम / मिलीलीटर 5 मिलीलीटर
    GlutaMAX 100X 0.1 मिमी 5 मिलीलीटर
    2-mercaptoethanol 50um 450 μl
    DMEM/F12 - 385 मिलीलीटर

    दक्षिण अमेरिका मूल के एफबीएस का इस्तेमाल भेदभाव दक्षता का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण है: सीरा के अन्य प्रकार के रोजगार को प्रभावित कर सकता हैभेदभाव प्रक्रिया. 50 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए पूरी ईबीएम-20, ऐड एस्कॉर्बिक एसिड (एए) तैयार करने के लिए. पूर्ण विकास के माध्यम से अधिक नहीं एक सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.
  2. हार्वेस्ट आईपीएस कालोनियों के रूप में (कदम 1.6-1.9) ऊपर वर्णित है.
  3. एक 2 मिलीलीटर विंदुक के साथ 1 मिलीलीटर ईबीएम -20 में धीरे Resuspend. बहुत ज्यादा clumps को तोड़ने से बचें - stereomicroscope के तहत कालोनियों के आकार की जाँच, से अधिक नहीं 2-3x से नीचे विंदुक ऊपर और. 1:1 अनुपात में अल्ट्रा कम लगाव प्लेटों पर प्लेट (एक 35 मिमी पकवान के लिए जैसे, 6 अच्छी तरह से थाली की अच्छी तरह से 1 का उपयोग करें). 1 मिलीलीटर ईबीएम-20 के साथ ट्यूब कुल्ला और थाली को जोड़ें.

नोट: कालोनियों के आकार दक्षता और हृदय की प्रेरण के समय को नियंत्रित करने, भेदभाव प्रक्रिया को प्रभावित करते हैं. एक ही ढंग से आकार ईबीएस के एकत्रीकरण भेदभाव के दौरान मनाया परिवर्तनशीलता को कम दिखाया गया है.

  1. 3 दिन, फिर से बचने के लिए एक माइक्रोस्कोप का उपयोग ईबीएम -20 एक बार बदलनाईबीएस के moval. थाली के किनारे के करीब पिपेट, और मध्यम हटाने रखें.
  2. दिन 7, स्विच ईबीएस में 0.1% जिलेटिन और पहले 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रखा के साथ लेपित प्लेटें. यदि आवश्यक हो, जिलेटिन एक सेल संस्कृति हुड के तहत हटा दिया और प्लेट छोड़ा जा सकता हे / एन 35 मिमी पकवान प्रति 35-40 ईबीएस जोड़ें.
  3. प्रति सप्ताह दो बार क्षेत्रों और परिवर्तन ईबीएम -20 पिटाई के लिए ईबीएस की जाँच करें. Stereomicroscope के तहत वे स्थानीयकरण की सुविधा के लिए, पिटाई क्षेत्रों पकवान कवर के शीर्ष पर स्थित हैं जहां बाहर निशान. करार क्षेत्रों में लगभग 10-20 दिनों के बाद दिखाई देनी चाहिए.
  4. सहज संकुचन के साथ क्षेत्रों में दिखाई देते हैं, (बजाय 2% FBS के साथ, ईबीएम-20 के रूप में तैयार) ईबीएम-2 के लिए मध्यम स्विच और उन के रूप में धारा 3 में नीचे वर्णित अलग. जब
  5. पिटाई और पिटाई क्षेत्रों आगे के प्रयोगों के लिए आवश्यक हैं जब तक प्रति सप्ताह दो बार मध्यम बदलने के लिए अन्य क्षेत्रों की जांच जारी है.

नोट: भेदभाव प्रक्रिया की क्षमता पर निर्भर हैकई कारकों, जिनमें से सबसे महत्वपूर्ण हृदय भेदभाव को प्रेरित किया जाता विशेष सेल लाइनों और सीरम के बैच के हैं. उच्चतम क्षमता प्राप्त करने के लिए, cardiomyogenic क्षमता और सीरम के विभिन्न बैचों के लिए परीक्षण सेल लाइनों.

3. क्षेत्रों अलगाव और संस्कृति बैरंग

  1. कोट 12 अच्छी तरह प्लेटें (4 सेमी 2 क्षेत्र) या 5 ग्राम / 2 सेमी फ़ाइब्रोनेक्टिन साथ ब्याज की प्लेटें, (12 अच्छी तरह प्लेटें में अच्छी तरह से प्रति 300 μl कुल) पूरी तरह से पूरी सतह को कवर करने के लिए पर्याप्त मात्रा बनाने के लिए पीबीएस में पतला. सेल कल्चर हुड में खुला रखें और सूखी अनुमति देते हैं. प्लेट्स 4 में लपेटा और संग्रहीत किया जा सकता डिग्री सीओ / एन
  2. जरूरत के रूप में एक ग्लास का उपयोग क्षेत्र पिटाई निकालें, पाश्चर पिपेट और छुरी खींच लिया. एक 1 मिलीलीटर विंदुक के साथ fibronectin लेपित प्लेटों पर स्थानांतरण.
  3. 1 मिलीलीटर ईबीएम-2 जोड़ें.
  4. कोशिकाओं को हटा दिया गया है, जहां क्षेत्रों से संकेत मिलता है और मध्यम बदलने की थाली से दूर क्रॉस. अन्य क्षेत्रों ख शुरू हो सकता है के रूप में प्लेट्स, 1 महीने के लिए रखा जा सकता हैबाद में खा रहा है.

नोट: छोटे पिटाई झुरमुटों की जरूरत है, तो यह छोटे टुकड़ों में टूट जाता है, जब तक stereomicroscope के तहत कई बार नीचे explanted क्षेत्र विंदुक ऊपर और. यह कुछ पिटाई कोशिकाओं (फिल्म 3 देखें) के समूहों में परिणाम होगा.

  1. विश्लेषण के लिए तैयार है जब तक सप्ताह में दो बार मध्यम बदलें.

नोट: इस प्रोटोकॉल से प्राप्त cardiomyocytes भ्रूण की तरह रूपात्मक और कार्यात्मक विशेषताओं के अधिकारी, एक वयस्क की तरह फेनोटाइप की ओर परिपक्वता आगे इन कोशिकाओं को अलग करने के लिए संस्कृति में समय को बढ़ाने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है.

4. एकल बैरंग सेल अलगाव और विश्लेषण

  1. कोट 2 चैम्बर स्लाइड्स (4 सेमी 2 क्षेत्र) या पूरी संस्कृति सतह को कवर करने के लिए पर्याप्त पीबीएस में पतला 5 ग्राम / 2 सेमी फ़ाइब्रोनेक्टिन साथ अन्य उपयुक्त समर्थन करता है. एक कांच का समर्थन किया जाता है, laminin और fibronectin साथ कोट (5 ग्राम / सेमी <> 2 प्रत्येक) समर्थन.
  2. धारा 3 से प्लेटों से एक पाश्चर पिपेट / स्केलपेल के साथ क्षेत्र की धड़कन निकालें.
  3. एक 1 मिलीलीटर पिपेट, ऊष्मायन के दौरान एक बार ट्यूब मिलाते 500 μl collagenase द्वितीय (मिलीग्राम और सीए के साथ पीबीएस में 480 यू / एमएल) और 37 पर सेते 15 मिनट डिग्री सेल्सियस, जिसमें एक 15 मिलीलीटर ट्यूब को हस्तांतरण कोशिकाओं का उपयोग करना.
  4. एक 200 μl विंदुक के साथ ऊपर और नीचे पिपेट. किसी भी झुरमुटों रहते हैं, ताजा collagenase द्वितीय करने के लिए स्थानांतरण और 4.3 चरण दोहराएँ.
  5. कोई बड़े clumps छोड़ दिया जाता है जब तक कदम 4.4 दोहराएँ.
  6. 3 मिलीग्राम ईबीएम -2 (कोई एए) के साथ collagenase निष्क्रिय. अन्य ट्यूबों तैयार हैं जब तक ट्यूब तो एक गर्म रैक में हुड के तहत छोड़ा जा सकता है. 4 मिनट के लिए 1,000 आरसीएफ में अपकेंद्रित्र.
  7. Resuspend गोली में 1 मिलीलीटर 0.25% 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर / trypsin EDTA (1X पीबीएस में 0.5% शेयर से पतला) और सेते हैं. एक ही प्रारंभिक नमूना से digestions के भागों का मिश्रण.
  8. 4 मिलीलीटर ईबीएम -2 (कोई एए) के साथ trypsin निष्क्रिय. अधिक टी कोई एक 2.5 मिलीलीटर सिरिंज पर एक 18G सुई के माध्यम से कोशिकाओं दर्राहान 7x. 4 मिनट के लिए 1,000 आरसीएफ में अपकेंद्रित्र.
  9. Resuspend सेल गोली प्रति अच्छी तरह से और प्लेट 1 मिलीलीटर ईबीएम-2 में. कोशिकाओं को 2-3 दिनों चढ़ाना के बाद कार्यात्मक और morphological विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Representative Results

हमारे अध्ययन में हम कई आईपीएस कोशिका लाइनों से सीएम उत्पन्न. इन लाइनों के शुरू में एक MEF फीडर परत पर उत्पन्न थे लेकिन तुरंत एक परिभाषित मध्यम (mTESR1 या Nutristem या तो) का उपयोग Matrigel पर रखा गया था. विभिन्न assays के रूपात्मक गुण, pluripotent कोशिकाओं के विशिष्ट मार्करों की अभिव्यक्ति (अक्तूबर 4, SSEA4 और TRA1-60) और उनके जीनोम स्थिरता (चित्रा 1) के रखरखाव को सत्यापित करने के लिए इस्तेमाल किया गया.

हृदय वंश में प्रेरण ईबीएस और सीरम और ए.ए. (आंकड़े 2A और 2 बी) की एक विशेष प्रकार की उपस्थिति में संस्कृति में आईपीएस कोशिकाओं के एकत्रीकरण से शुरू हो गया था. करार क्षेत्रों (चित्रा -2 और मूवी 1) का इस्तेमाल सेल लाइन पर निर्भर करता है, कुल का 20-35% का प्रतिनिधित्व किया. करार enzymatic पाचन (मूवी 2) द्वारा इन क्षेत्रों से अलग मुख्यमंत्रियों ठेठ cardiomyocyte संरचनात्मक प्रोटीन (कार्डियक ट्रोपोनिन, और alph व्यक्तएक;-sarcomeric एक्टिन,) α और β मायोसिन भारी चेन, अंतर जंक्शन प्रोटीन (connexin-43), और प्रमुख आयन चैनल (आंकड़े 2 डी 2 एफ). इन कोशिकाओं के electrophysiological विश्लेषण आलिंद नोडल,, और निलय प्रोफाइल (डेटा एट अल, एसजी, प्राथमिकताओं, दिखाया नहीं., जे क्लीन. निवेश करते हैं., प्रेस, 14,15,20 में) के साथ कोशिकाओं जिसमें एक विषम जनसंख्या का पता चला.

चित्रा 1
चित्रा 1. फीडर से मुक्त आईपीएस कोशिकाओं रखरखाव Matrigel पर उगाया आईपीएस कालोनियों चरण उज्ज्वल किनारों और प्रमुख nucleoli साथ, उनके मानव ईएससी की तरह आकारिकी बनाए रखने) pluripotency. एबी प्रभावित नहीं करता है. सीडी) सही ढंग से प्रतिलेखन कारक अक्तूबर 4 व्यक्त आईपीएस कोशिकाओं दिखा इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण (सी)और TRA1-60 सतह प्रतिजन (स्केल सलाखों: 50 माइक्रोन). (डी) (ई) Cytofluorimetric विश्लेषण ठेठ सतह pluripotency एंटीजन (SSEA -4 और TRA1-60) की अभिव्यक्ति की पुष्टि की. gating रणनीति बाएं बिखराव से दिखाया गया है. (एफ) Matrigel पर उगाया आईपीएस कोशिकाओं के प्रतिनिधि कुपोषण विश्लेषण. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2. कार्यात्मक आईपीएस व्युत्पन्न मुख्यमंत्रियों के भेदभाव. भेदभाव प्रोटोकॉल का ए) योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. संकुचन के एक क्षेत्र के बी) आईपीएस कोशिकाओं से एकत्रित embryoid निकायों. सी) प्रतिनिधित्व. डी) RT-पीसीआर शोSCN5A - सोडियम चैनल, वोल्टेज gated, टाइप वी, अल्फा सबयूनिट, KCNQ1 - पोटेशियम वोल्टेज कैल्शियम चैनल, वोल्टेज निर्भर, अल्फा 1 ए सबयूनिट - आईपीएस व्युत्पन्न पिटाई झुरमुटों (CACNA1A से कुछ हृदय विशेष आयन चैनलों की अभिव्यक्ति आईएनजी गेटेड चैनल, उपपरिवार तरह KQT, सदस्य 1) ​​और मायोसिन भारी श्रृंखला (MHC-एक और MHC-ख) के दोनों रूपों. भ्रूण की हृदय कोशिकाओं से सीडीएनए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था जबकि कोई अभिव्यक्ति, आईपीएस कोशिकाओं में detectable था. दिखा ही मुख्यमंत्रियों संरचनात्मक प्रोटीन α-sarcomeric एक्टिन, हृदय troponin मैं (TNNI), और हृदय विशेष जंक्शन connexin 43 (CNX-43) व्यक्त आईपीएस व्युत्पन्न. HGPRT गृह व्यवस्था जीन के रूप में इस्तेमाल किया गया था. एफई) immunofluorescence धुंधला स्केल सलाखों: 50 माइक्रोन. छवियाँ एक AxioVision जीस प्रतिदीप्ति उलटा माइक्रोस्कोप का उपयोग कर प्राप्त कर लिया और ImageJ के साथ विश्लेषण किया गया. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

<मजबूत> मूवी 1. आईपीएस कोशिकाओं से व्युत्पन्न क्षेत्र करार. फिल्म देखने के लिए यहां क्लिक करें.

मूवी 2. एक ठेका क्षेत्र के enzymatic पाचन से प्राप्त एकल करार आईपीएस व्युत्पन्न मुख्यमंत्रियों,. फिल्म देखने के लिए यहां क्लिक करें.

मूवी 3. आंशिक यांत्रिक विच्छेदन के द्वारा प्राप्त लघु करार क्लस्टर,. फिल्म देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

Pluripotent स्टेम सेल लाइनों के बीच कम क्षमता और उच्च परिवर्तनशीलता के साथ यद्यपि, मुख्यमंत्रियों में अनायास अंतर करने की क्षमता है. उपन्यास शामिल करने के तरीकों का विकास इसलिए प्रक्रिया की दक्षता में सुधार और अधिक परिभाषित प्रोटोकॉल की ओर बढ़ रहा है पर ध्यान केंद्रित किया है. हालांकि, इन नए भेदभाव विधियों का सबसे विस्तृत संस्कृति की स्थिति, समय और अभिकर्मकों की एकाग्रता के ठीक नियंत्रण, और महंगा साइटोकिन्स और वृद्धि कारकों के साथ उपचार की आवश्यकता होती है, काफी जटिल हैं. इसके अलावा, विभिन्न आईपीएस कोशिका लाइनों की अंतर्जात साइटोकाइन संकेत के स्तर में अंतर यह मुश्किल अक्सर प्रत्येक कोशिका लाइन के लिए उपयुक्त स्तर को समायोजित किया जाना चाहिए जो साइटोकाइन सांद्रता, मानकीकृत करने के लिए प्रस्तुत करना.

प्राप्त आईपीएस व्युत्पन्न मुख्यमंत्रियों की परिपक्वता भी रोग मॉडलिंग और दवाओं की खोज के लिए आवेदन पत्र आईपीएस कोशिकाओं के हृदय भेदभाव का प्रयास करते समय विचार करने के लिए एक महत्वपूर्ण पहलू का प्रतिनिधित्व करता है. differentiatमानव ESCs और आईपीएस कोशिकाओं के आयन आमतौर पर एक पूरी तरह से परिपक्व संरचना के बिना एक भ्रूण फेनोटाइप यानी साथ मुख्यमंत्रियों को जन्म देता है. Monolayer के तरीकों का इस्तेमाल किया जाता है जब यह विशेष रूप से सच है, और एक परिणाम के रूप में इन, पैदा amplifying, और विशिष्ट हृदय पूर्वज आबादी 2,3 अलग करने के लिए अधिक उपयुक्त हैं.

इस परिदृश्य में, अभी भी व्यापक रूप से रोग मॉडलिंग प्रयोजनों के लिए प्रयोग किया जाता है जो "शास्त्रीय" ईबीएस एकत्रीकरण विधि, बेहतर प्रयोगात्मक जरूरतों को फिट करने के लिए लगता है. इस पद्धति का सीधा आर्थिक, आसानी से साध्य, और सभी लाइनों के लिए उपयुक्त है. अतिरिक्त वृद्धि कारक या साइटोकिन्स, के लिए या अक्सर बहुत अच्छी तरह से आईपीएस कोशिकाओं द्वारा सहन नहीं कर रहे हैं, जो एकल कोशिका के पाचन के लिए कोई जरूरत नहीं है, यह भी, वे रॉक अवरोधकों 21 के साथ अतिरिक्त उपचार की आवश्यकता है. इसके अलावा, ईबीएस में एकत्रीकरण एक 3 आयामी वातावरण और पैरा प्रदान करने ईबीएस के साथ, एक pluripotent सेल के प्राकृतिक विकास की प्रक्रिया जैसा दिखता हैशारीरिक स्थिति के समान हैं कि crine संकेत. इसके अलावा, ए.ए. के अलावा आईपीएस कोशिकाओं के हृदय भेदभाव को बढ़ाने के लिए लगातार दिखाया गया है, और भी उनकी संरचनात्मक और कार्यात्मक परिपक्वता 18,19 सुधार करने के लिए. , सीरम का सबसे उपयुक्त बैच के चयन के साथ एक साथ, आईपीएस उनके हृदयजनित क्षमता के आधार पर सेल लाइनों का चयन आगे मुख्यमंत्री पीढ़ी की दक्षता में सुधार हो सकता है.

अंत में, यहाँ प्रस्तावित विधि भी माउस फीडर कोशिकाओं, माउस कोशिकाओं के साथ संदूषण की संभावना समाप्त और भी आगे passaging आईपीएस सेल और ईबीएस गठन के लिए तकनीकी प्रक्रियाओं को सरल जो जरूरत नहीं है का लाभ दिया है. इस विधि को कई लाभ प्रदान करता है और भविष्य के हृदय पुनर्योजी चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए रास्ता खोलने से पहले तकनीक पर एक महत्वपूर्ण सुधार का गठन किया.

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Disclosures

खुलासा करने के लिए कोई वित्तीय हितों.

Acknowledgments

बी एस मिलान Bicocca ग्रीष्मकालीन छात्र रिसर्च ट्रेनिंग प्रोग्राम के विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था, अनुसंधान स्वास्थ्य और इतालवी शिक्षा मंत्रालय, विश्वविद्यालय और जीसी के लिए अनुसंधान और Fondazione Humanitas का इतालवी मंत्रालय के धन से समर्थन किया गया था, हम गंभीर रूप से पढ़ने के लिए माइकल वी.जी. Latronico धन्यवाद पांडुलिपि.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Media and Reagents
Human ESC-qualified Matrix BD Biosciences 354277 Thaw the 5 ml bottle at 4 °C on ice O/N, aliquot in pre-chilled cryo-tubes on ice, according to the data sheet dilution instructions and store at -20 °C .
Fibronectin, from human plasma, 0.1% solution Sigma F0896-2MG Working concentration: 5 μg/cm2
Laminin Sigma L2020-1MG Working concentration: 5 μg/cm2
PBS (no Mg and Ca), 10X Lonza BE17-515F
PBS (with Mg and Ca), 10X Bio Sera XC-S2067/500
Dispase II, neutral protease, grade II Roche 4942078001 Stock: 10 mg/ml in DMEM-F12 at -20 °C, working solution: 1 mg/ml in PBS (no Mg/Ca)
Trypsin/EDTA, 0.5% Sigma T3924
Collagenase type 2 Worthington 4176 Dilute to 480 U/ml (e.g. 1.6 mg/ml) in PBS with Mg and Ca
DMEM-F12 Life Technologies 21331-020
Knockout DMEM Life Technologies 10829-018
Knockout Serum Replacement (KSR) Life Technologies 10828-028 Thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C
F–tal Bovine Serum (origin South America) Invitrogen 10270-106 Batches should be tested for their cardiogenic potential. Thaw at 4 °C, heat-inactivate at 56 °C for 30 min, aliquot and store at -20 °C
PenStrep, penicillin-Streptomycin, 100X Life Technologies 15140-122
GlutaMAX, 100X Life Technologies 35050-038
MEM NEAA, 100X Invitrogen 11140-135
N2 supplement, 100X Life Technologies 17502-048
B27 supplement, 50X Life Technologies 12587-010
2-mercapt–thanol Invitrogen 31350-010
Gelatin, from porcine skin Sigma G1890-100G Make stock at 1% in water, store at -20 °C. Dilute to 0.1% in PBS and keep at 4 °C
mTeSR1 Stem Cell Technologies 5850 Combine Supplement 5X with the basic medium, aliquot and store at -20 °C. Do not keep complete medium at 4 °C for more than 1 week
Nutristem hESC XF Stemgent from Biological Industries 05-100-1A Thaw at 4 °C O/N, aliquot and store at -20 °C until use. Aliquots may be kept at 4 °C for no more than a week.
mFreSR Stem Cell Technologies 5853
Ascorbic acid Sigma A4544-25G Prepare stocks at 10 mg/ml in water. Store aliquots at -20 °C in the dark. Add to EBM at the final concentration (500X)
Plasticware
35 mm culture dishes Becton Dickinson 353001
Cell scraper Corning Incorporated 3008
12-well plates Becton Dickinson 353043
Permanox 2-well chamber slides Thermo Fisher Scientific 177437
Glass 2-well chamber slides Thermo Fisher Scientific 177380
6-well plates, ultra-low-attachment surface Corning Incorporated 3471
18G needle Becton Dickinson 304622
Glass pasteur pipettes, 230 mm VWR International 612-1702
2.5 ml syringe Becton Dickinson 300188
Equipments
IVF Workstation KSystem, by Nikon
Nikon SMZ1500 Stereomicroscope Nikon

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References

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मानव cardiomyocytes की पीढ़ी: फीडर से मुक्त मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल से एक भेदभाव प्रोटोकॉल
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Di Pasquale, E., Song, B., Condorelli, G. Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (76), e50429, doi:10.3791/50429 (2013).

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