Summary
多能干细胞，胚胎或诱导多能干细胞（iPS），构成人类分化的细胞，包括心肌细胞的重要来源。在这里，我们将专注于心脏iPS细胞的诱导，展示如何使用它们来获得功能的人类心肌细胞通过胚状体为基础的协议。
Abstract
为了研究心脏发育的事件驱动和确定导致心肌人类疾病的分子机制，它是必不可少的，以产生人心肌功能的CM。使用这些细胞在药物发现和毒理学研究也将是非常有益的，允许人类来源的细胞要验证的预临床上用于治疗心脏疾病的新的药物分子。的CM的可能来源，诱导多能干细胞（iPS细胞）是最有前途的，因为它们可以容易获得的患者组织直接来源于具备的特性的主体1的所有类型的细胞产生的能力。已经提出了几种方法进入CMS分化的iPS细胞，包括从古典的胚状体（EBS）聚合方法已有化学定义的协议2,3。在这篇文章中，我们提出了一种基于EBS-协议，并展示如何METHOd可以高效地生成功能CM从馈线的iPS细胞样细胞。
Introduction
从历史上看，推动人类发展和疾病的遗传和分子机制的调查已基于上一代转基因动物模型。然而，众多的人类表型未能成功复制老鼠，主要是因为现有两个物种之间的生物差异。另一方面，获得人体组织可能会受到限制的，通常不允许足够的材料来获得深入的实验研究。心血管生物学领域遭受来自这两个限制：人体心脏的生理是显着的不同，鼠标和心脏组织是一个重大的数量只有验尸报告或在心脏手术期间访问。因此，找到一个最佳来源的分化功能的人类CMS成为心血管生物学中的中心话题，多已作出努力，来解决这个问题。已经提出了各种细胞类型，我ncluding骨骼肌成肌细胞，本地心脏干细胞，骨髓单核细胞，血管内皮前体细胞，间充质干细胞。然而，获得的数据，使用这些细胞并不一致4。
人类胚胎干细胞（ESC）的推导第5和Yamanaka和汤姆森6,7诱导多能干细胞（iPS）的开创性发现后似乎提供解决方案：这些细胞具有无限增长的能力和潜力给予上升到所有三个胚层的细胞衍生工具，包括CMS。 iPS细胞的使用提供了进一步的优点：来自自体成体细胞，它们携带的个人或患者衍生它们的相同的基因组。因此，他们允许在体外人类遗传性疾病的调查和机制的发展模式，推动发展的。凭借这一特性，iPS细胞也可以Øvercome问题相关的免疫排斥和伦理问题8。出于这些原因，尽管胚胎干细胞仍然是干细胞生物学领域的黄金标准，世界各地的研究人员现在正在向iPS细胞技术。
iPS细胞在体外人类疾病模型的各种条件，包括先天性心血管疾病9,10。近日，应用iPS细胞疾病模型已进行单基因心脏疾病（ 如长QT综合征，儿茶酚胺敏感性多形性室性心动过速）和病理学心脏缺陷是一个复杂的表型（ 即 Leopard和蒂莫西·综合征，扩张型心肌病）的一部分。这些报告证实， 在体内的疾病患者特异性的iPS细胞分化成CMS显示类似的表型和功能特性。
然而，有仍有许多挑战，提高疗效诱导的iPS细胞转化为心脏谱系。通过聚集形成从人类胚胎干细胞自发产生的CMS称为胚状体（EB）已被证明成功的17。由于这一发现，许多其他的方法已经被提出。许多研究小组已经大大提高了工作效率的分化协议，并已走向化学定义和动物产品的培养试剂（见马默里，C. 等，流通研究 （2012年）进行全面检讨现有的所有方法3 ）。
然而，传统的方法基于EB聚集的仍然是最常用的执行功能研究和调查疾病机制。我们建议的协议是基于iPS细胞的聚集成胚体培养在血清和抗坏血酸的存在下，这已被证明，以提高心脏的分化过程，与positively影响这些细胞的成熟18,19。在这篇文章中，我们将通过这种方法，在细节和将展示如何使用无饲养层的iPS细胞系产生特定病人的iPS衍生CMS。
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Protocol
1。馈线维护人类iPS细胞系和传
- 准备基质胶涂层的菜肴。解冻一小时人类ESC合格的冰矩阵的一小瓶，在25毫升的DMEM-F12培养基中稀释。加入1 ml各35毫米的钢板（或等值金额，每面面积，如果使用其他的菜肴），冰和藏在心里，确保所有的板材及管材预冷。铝箔盖板。
注：的基底膜股票浓度不同的批次。稀释指令在数据表上显示。
- 保持板置于冰上过夜，第二天从冰中删除。板可存放在冰箱里长达一个星期后方可使用。
- 准备mTESR1完全培养基（或解冻一小瓶的Nutristem培养基），和H-ESM（人ESC培养基）根据下表。
ħESM 终浓度 FOR 500毫升 淘汰赛血清替代（KSR） 20％的 百毫升 100X的GlutaMAX 2毫米 5毫升 MEM非必需氨基酸 0.1毫米 5毫升 青霉素，链霉素 100 U / ml的 - 0.1毫克/毫升 5毫升 2 - 巯基乙醇 0.1毫米 900微升 B27补充剂 - 没有维他命A 1％ 10毫升 N2补充 1％ 5毫升 淘汰赛的DMEM - 370毫升
免介质可以被存储在4℃下不超过2周。要准备完全培养基，加入碱性FGF只是江前终浓度为20 ng / ml的ë键馈送。
注意：空调，小鼠胚胎成纤维细胞的完整的H-ESM可以用来代替的mTESR1或Nutristem的iPS细胞。
- 将涂层板的培养箱中在37℃下为30分钟至2小时，传代前。
- 传代细胞大约每5天，即使他们还没有达到汇合。殖民地不应接触。
- 更换生长培养基中，用1毫升分散酶（1毫克/毫升，溶解10毫克/毫升在PBS中的库存）。
- 拆下区分拉玻璃巴斯德移液器领域。应被删除的区域包括火山口状或囊状结构的菌落的中心，从菌落中分离的细胞已成为任何地方和扁平似乎已被向外迁移。
- 在37°C下孵育文化罩，直到殖民地的边界变得更亮，并开始分离（通常5-7分钟左右）。抛弃它ð中性蛋白酶。用1毫升H-ESM清洗并丢弃。
- 在1毫升H-ESM，使用单元格升降器（刮刀刮刀）到收获的殖民地，并收集在15毫升的Eppendorf管中。用1毫升H-ESM冲洗，并加至管。转速为1,000 RCF 4分钟，去除上清。
- 悬浮颗粒在1毫升预热的生长培养基（无论是mTESR1或Nutristem）。避免分手团块太多 - 吸管向上和向下小于6-8X。确定镀细胞应该是多少，并删除不必要的细胞（通常为1:4或1:5的比例进行稀释，1:5）， 例如 ，2板，取出600微升，然后加入1.6毫升新鲜培养基。
- 板删除基底膜。广场细胞一滴一滴，盘子上均匀分布。避免过度摇晃管，因为这会导致细胞走向中心。
- 清洗管1毫升培养基和板之间的鸿沟。最终在每个盘量应该是1.5-2毫升。
- 传代后的一天，除了每天更换介质。虽然这是理想介质日常生活，这可能会偶尔每两天一次的频率改变最后一段已经过去了，如果不超过2-3天，不影响多能性和分化潜能。
- 如果单元格行必须冻结，再暂停，而不是在1-2毫升mFreSR的冷冻介质使用2毫升吸管1毫升/离心管。将小瓶在cryobox中在-80°C和转移到液氮3-4天。
注：必须进行手动显微切割iPS细胞在体视显微镜下。 体外受精 （IVF）工作站（ 如试管婴儿工作站的来自KSystem），用立体显微镜集成，让细胞在无菌条件下操作，同时它们保持在加热表面积。如果不能做到这一点，可以移动在立体显微镜下定期层流罩。
2。胚体聚合和心脏电磁炉Ñ
- 根据下表，准备EBM-20培养基。
EBM-20 终浓度 FOR 500毫升 胎牛血清（产地南美） 20％的 百毫升 MEM非必需氨基酸 0.1毫米 5毫升 青霉素 - 链霉素 100U/ml - 0.1毫克/毫升 5毫升 100X的GlutaMAX 0.1毫米 5毫升 2 - 巯基乙醇 50UM 450微升 DMEM/F12 - 385毫升
FBS原产南美洲的使用确定的分化效率是至关重要的，其他类型的血清可能影响就业的分化过程。为了制备完整的EBM-20，添加抗坏血酸（AA）至终浓度为50微克/毫升。完全生长培养基可以存储在4℃下不超过一个星期。 - 收获的iPS菌落如上述（步骤1.6到1.9）。
- 轻轻重悬在1毫升EBM-20与2毫升吸管。避免分手团块太多 - 吸管向上，上下不超过2〜3倍，体视显微镜下检查大小的菌落。超低附件板在1:1的比例（ 例如 35毫米的菜盘上，使用1 6孔板）。冲洗管，并添加1毫升EBM-20板。
注：菌落的大小影响的分化过程，控制心脏感应的效率和时序。聚合胚大小均匀已经被证明可以减少分化过程中观察到的变异。
- 第3天，EBM-20一次改变，以避免重新使用显微镜胚MOVAL。保持吸液管靠近板边，并移除介质。
- 在第7天，开关胚体板涂有0.1％明胶和以前在37℃下放置30分钟。如有必要，明胶可以取出细胞培养罩下板离开O / N。添加35-40 EBS每35毫米的菜。
- 检查EBS每周两次击败区和变化EBM-20的。马克跳动区上的菜盖的顶部位于在体视显微镜下，以促进它们的本地化。各地区应出现后约10-20天。
- 当出现自发性收缩的区域，切换到中EBM-2（准备，用含2％FBS的EBM-20代替）和隔离，如下文所述在第3条。
- 继续检查其他地区殴打和改变介质的每周两次，直到跳动的领域都需要进一步的实验。
注：效率的分化过程是高度依赖于若干因素，其中最严重的是特定的细胞系，并用于诱导心脏分化血清批次。为了获得最高的效率，测试细胞株血清心肌潜力和各批次。
3。打浆区的分离和培养
- 外套12孔板（4 cm 2的区域），或用5微克/ cm 2的纤连蛋白的板，在PBS中稀释，以足够的音量完全覆盖整个表面（在12孔板中，每孔加入300μl总）。保持在细胞培养罩发现并晾干。板可以包装和储存在4°CO / N。
- 删除跳动的区域用玻璃拉巴斯德移液管和手术刀。 1毫升吸管转移到纤维连接蛋白涂层钢板。
- 加入1 ml EBM-2。
- 十字板指示的地方除去细胞，并改变它的介质。板可保持长达1个月，其他地区可能开始玩b吃了以后。
注 ：如果需要更小的跳动团块，吸液管植面积和体视显微镜下数次，直到它打破成小块。这将导致在几个跳动细胞（电影3）集群。
- 每周两次，直到更改介质准备分析。
注意：从这个协议中获得的心肌细胞具有胎儿状的形态和功能特征，对一个成年人的样表型的成熟培养时间增加，进一步区分这些细胞可以通过以下方式获得。
4。单跳动细胞分离与分析
- 外套2玻片（4 cm 2的区域）或其他适当的支持，用5微克/厘米2纤连蛋白在足够的PBS稀释，以覆盖整个培养表面。如果使用玻璃支持，大衣与层粘连蛋白和纤维连接蛋白（5微克/平方厘米<SUP>各2个）。
- 删除板从第3跳动的区域用巴斯德吸管/手术刀。
- 使用1毫升吸管，传递细胞含有500微升Ⅱ型胶原酶（480 U / ml的PBS与镁和钙）和孵化15分钟，在37℃，一次在孵化过程中晃动管15毫升管。
- 移液器向上和向下与200μl的吸管。如果任何团块，转移到新鲜Ⅱ型胶原酶，并重复步骤4.3。
- 重复步骤4.4直到没有留下大的团块。
- 灭活胶原酶用3毫升EBM-2（AA）。管，然后可以留引擎盖下在加热机架，直到其他管准备。离心机在1000 RCF 4分钟。
- 重悬浮颗粒在1毫升0.25％胰蛋白酶/ EDTA（从0.5％的股票在1X PBS稀释），在37°C孵育5分钟。合并馏分从相同的初始样品的消化。
- 胰蛋白酶失活与4毫升EBM-2（AA）。通过在2.5毫升注射器没有更多的T细胞通过18G的针头汉7X。离心机在1000 RCF 4分钟。
- 重悬细胞沉淀在1毫升EBM-2每口井和板。细胞可用于电镀后2-3天的功能和形态分析。
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Representative Results
在我们的研究中，我们从几个iPS细胞系产生的CMS。这些线MEF饲养层上，但最初生成，立即放在基底膜使用定义的介质（要么mTESR1或Nutristem）。各种实验，用于验证的形态特征，典型的多能干细胞的标记物表达（OCT-4，SSEA4 TRA1-60），其基因组中稳定（ 图1）的维护。
感应到心脏谱系成胚体和在一个特定类型的血清和AA（ 图2A和2B）的存在下培养的由iPS细胞聚集触发。一方区域占总量的20-35％，根据使用（ 图2C和电影1）的细胞系。缔约CMS来自这些地区的分离酶消化（ 电影2）表示典型的心肌细胞结构蛋白（肌钙蛋白，ALPH;肌节肌动蛋白，肌球蛋白重链α和β），间隙连接蛋白（间隙连接蛋白-43），和主要的离子通道（ 图2D-2F）。这些细胞的电生理分析显示一个节点，心房和心室公司（未示出的数据的先验，SG， 等人，“临床研究，在回 ，14,15,20）的细胞组成的异质群体。
图1。馈线iPS细胞的维护不会影响多能性。AB）的iPS基底膜上生长的菌落留住人类的ESC般的形态，相明亮的边缘和核仁明显。CD）iPS细胞免疫荧光分析显示正确表达的转录因子OCT-4 （C）TRA1-60表面抗原（比例尺：50微米）（D）。（E）Cytofluorimetric的分析证实了多能性的典型的表面抗原（SSEA-4和TRA1-60）的表达。门控策略所表现出的左侧分散（F）代表染色体核型分析iPS细胞基底膜上生长。 点击此处查看大图 。
图2。分化功能的iPS衍生CMS）示意图分化协议B）汇总从iPS细胞的胚体C）表示面积收缩D）RT-PCR检测显示ING表达一些特定心脏离子通道的iPS衍生跳动的团块（CACNA1A - 钾，钙离子通道，电压依赖性，α-1A亚基SCN5A - 钠离子通道，电压门控性，V型，α亚基; KCNQ1 - 电压门控通道，亚家族KQT像，成员1）和肌球蛋白重链（MHC-a和MHC-B）两种形式。没有检测到表达，而iPS细胞从胎儿心脏细胞的cDNA作为阳性对照。作为管家基因HGPRT EF）免疫荧光染色，显示单一的iPS衍生的CM表达结构蛋白肌节α-肌动蛋白，肌钙蛋白I（TNNI），和心脏特定的结点连接蛋白43（CNX-43）的。标尺：50微米。使用的Axiovision蔡司荧光倒置显微镜图像被收购ImageJ的分析。 点击这里查看大图 。
<>电影1。承包面积来自iPS细胞。 点击这里观看电影。
电影2。单承包IPS衍生CMS，从一个承包区的酶消化获得。 点击这里观看电影。
电影3。小承包集群，获得了部分机械清扫。 点击这里观看电影。
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Discussion
多能干细胞有潜力分化成CMS自发，虽然与线之间的低效率和高变异。因此，发展新型感应方法集中在提高效率的过程和走向更明确的协议。然而，大多数这些新的分化方法是相当复杂的，需要精心设计的培养条件下，定时的精细控制，试剂浓度，与昂贵的细胞因子和生长因子的治疗。此外，各种iPS细胞株中的内源性的细胞因子信号电平的差异使其难以标准化，这往往必须调整到适当的水平，每种细胞系的细胞因子浓度。
所获得的iPS衍生CMS的成熟也代表尝试心脏疾病建模和药物发现应用iPS细胞的分化时要考虑的一个重要方面。分异通常产生的人类胚胎干细胞和iPS细胞的离子CMS与胎儿的表型， 即没有一个完全成熟的结构。时，这是特别真实的单分子层的方法被使用，并且作为结果，这些更适合于产生，放大，并隔离特定的心脏祖人口2,3。
在这种情况下，“经典”EBS聚合方法，仍然被广泛用于疾病模型的目的，似乎以更好地满足实验需求。这种方法简单，经济，易于切实可行，适合所有线路。其他生长因子或细胞因子，或单细胞消化，这往往是不能很好地由iPS细胞的耐受性也没有必要，它们还需要额外的处理，与ROCK抑制剂21。此外，EBS聚集成类似天然的多能干细胞发育过程，与胚体提供一个3维环境和对内分泌更相似的生理条件下的信号。而且，加入的AA已显示了一贯提高iPS细胞的心肌分化，并且，以改善它们的结构和功能的成熟18,19。选择的iPS细胞株的基础上他们的心原性潜力，选择最适当的血清批次，可能进一步提高CM生成的效率。
最后，这里所提出的方法具有的优点是不需要的小鼠饲养层细胞，从而消除了与小鼠细胞的污染的可能性，并进一步简化了iPS细胞传代和胚体形成的技术程序。此法赋予的诸多优势，并构成了显着的改进超过了先前的技术，开辟了道路，未来的心血管再生医学应用。
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Disclosures
没有财务权益披露。
Acknowledgments
BS支持大学，米兰比可卡暑期学生科研训练计划，研究卫生意大利外交部和意大利教育部，大学及研究基金会马尼塔斯的GC资金支持，我们感谢迈克尔的VG拉特罗尼科为批判地阅读手稿。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and Reagents | |||
| Human ESC-qualified Matrix | BD Biosciences | 354277 | Thaw the 5 ml bottle at 4 °C on ice O/N, aliquot in pre-chilled cryo-tubes on ice, according to the data sheet dilution instructions and store at -20 °C . |
| Fibronectin, from human plasma, 0.1% solution | Sigma | F0896-2MG | Working concentration: 5 μg/cm2 |
| Laminin | Sigma | L2020-1MG | Working concentration: 5 μg/cm2 |
| PBS (no Mg and Ca), 10X | Lonza | BE17-515F | |
| PBS (with Mg and Ca), 10X | Bio Sera | XC-S2067/500 | |
| Dispase II, neutral protease, grade II | Roche | 4942078001 | Stock: 10 mg/ml in DMEM-F12 at -20 °C, working solution: 1 mg/ml in PBS (no Mg/Ca) |
| Trypsin/EDTA, 0.5% | Sigma | T3924 | |
| Collagenase type 2 | Worthington | 4176 | Dilute to 480 U/ml (e.g. 1.6 mg/ml) in PBS with Mg and Ca |
| DMEM-F12 | Life Technologies | 21331-020 | |
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828-028 | Thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C |
| F–tal Bovine Serum (origin South America) | Invitrogen | 10270-106 | Batches should be tested for their cardiogenic potential. Thaw at 4 °C, heat-inactivate at 56 °C for 30 min, aliquot and store at -20 °C |
| PenStrep, penicillin-Streptomycin, 100X | Life Technologies | 15140-122 | |
| GlutaMAX, 100X | Life Technologies | 35050-038 | |
| MEM NEAA, 100X | Invitrogen | 11140-135 | |
| N2 supplement, 100X | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 supplement, 50X | Life Technologies | 12587-010 | |
| 2-mercapt–thanol | Invitrogen | 31350-010 | |
| Gelatin, from porcine skin | Sigma | G1890-100G | Make stock at 1% in water, store at -20 °C. Dilute to 0.1% in PBS and keep at 4 °C |
| mTeSR1 | Stem Cell Technologies | 5850 | Combine Supplement 5X with the basic medium, aliquot and store at -20 °C. Do not keep complete medium at 4 °C for more than 1 week |
| Nutristem hESC XF | Stemgent from Biological Industries | 05-100-1A | Thaw at 4 °C O/N, aliquot and store at -20 °C until use. Aliquots may be kept at 4 °C for no more than a week. |
| mFreSR | Stem Cell Technologies | 5853 | |
| Ascorbic acid | Sigma | A4544-25G | Prepare stocks at 10 mg/ml in water. Store aliquots at -20 °C in the dark. Add to EBM at the final concentration (500X) |
| Plasticware | |||
| 35 mm culture dishes | Becton Dickinson | 353001 | |
| Cell scraper | Corning Incorporated | 3008 | |
| 12-well plates | Becton Dickinson | 353043 | |
| Permanox 2-well chamber slides | Thermo Fisher Scientific | 177437 | |
| Glass 2-well chamber slides | Thermo Fisher Scientific | 177380 | |
| 6-well plates, ultra-low-attachment surface | Corning Incorporated | 3471 | |
| 18G needle | Becton Dickinson | 304622 | |
| Glass pasteur pipettes, 230 mm | VWR International | 612-1702 | |
| 2.5 ml syringe | Becton Dickinson | 300188 | |
| Equipments | |||
| IVF Workstation | KSystem, by Nikon | ||
| Nikon SMZ1500 Stereomicroscope | Nikon | ||
References
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