الخلايا الجذعية المحفزة، إما خلايا الجنينية الجذعية المحفزة أو المستحثة (آي بي إس)، تشكل مصدرا قيما للخلايا متمايزة الإنسان، بما في ذلك العضلية. هنا، سوف نركز على الاستقراء القلب من خلايا الجذع، والتي تبين كيفية استخدامها للحصول العضلية الإنسان وظيفية من خلال بروتوكول مضغي الشكل القائم على الجثث.
من أجل التحقيق في الأحداث التي وقعت القيادة القلب والتنمية لتحديد الآليات الجزيئية التي تؤدي إلى أمراض عضلة القلب في البشر، فمن الضروري أولا لتوليد العضلية الإنسان وظيفية (CMS). ومن شأن استخدام هذه الخلايا في اكتشاف المخدرات ودراسات علم السموم تكون أيضا مفيدة للغاية، مما يسمح للجزيئات الدوائية جديدة لعلاج اضطرابات القلب يمكن التحقق من صحة ما قبل سريريا على خلايا المنشأ البشرية. من المصادر المحتملة للCMS، الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها (آي بي إس) هي من بين الأكثر واعدة، لأنها يمكن أن تستمد مباشرة من الأنسجة للمريض في متناول الجميع وتكون لديها قدرة ذاتية تثير جميع أنواع الخلايا في الجسم 1. وقد اقترحت عدة طرق للتمييز بين خلايا الجذع في CMS، بدءا من الهيئات مضغي الشكل الكلاسيكي (EBS) نهج التجميع إلى بروتوكولات محددة الصفات كيميائيا 2،3. في هذه المقالة نقترح بروتوكول المستندة EBS، وتظهر كيف أن هذا methoويمكن استخدام D لتوليد بكفاءة وظيفية CM-مثل خلايا من خلايا الجذع خالية من وحدة التغذية.
تاريخيا، وقد استند التحقيق في الآليات الجينية والجزيئية القيادة التنمية البشرية ومرض على توليد النماذج الحيوانية المعدلة وراثيا. ومع ذلك، تفشل العديد من الظواهر البشرية لتكراره بنجاح في الفئران، وذلك أساسا بسبب الاختلافات البيولوجية القائمة بين هذين النوعين. من ناحية أخرى، والوصول إلى الأنسجة البشرية قد تكون محدودة وغالبا لا تسمح ما يكفي من المواد التي يمكن الحصول عليها لإجراء دراسات تجريبية متعمقة. مجال البيولوجيا القلب والأوعية الدموية يعاني من كل هذه القيود: علم وظائف الأعضاء من قلب الإنسان يختلف كثيرا عن أن من الفأرة، وكمية كبيرة من أنسجة القلب يمكن الوصول إليها إلا بعد الوفاة أو أثناء عملية جراحية في القلب. العثور على مصدر الأمثل للتمايز وظيفي الإنسان مضادة وبالتالي تصبح موضوعا مركزيا في علم الأحياء القلب والأوعية الدموية، وأحرز الكثير من الجهد لمعالجة هذه المسألة. وقد اقترحت أنواع الخلايا المختلفة، وأناالتسبب myoblasts الهيكل العظمي والخلايا الجذعية المحلية القلب، العظام والخلايا وحيدات النوى نخاع، أسلاف البطانية، والخلايا الجذعية الوسيطة. ومع ذلك، الحصول على بيانات باستخدام هذه الخلايا لم تكن متسقة 4.
اشتقاق الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (ESC) أولا (5) واكتشاف حجر الأساس لمشروع يسببها الجذعية (آي بي إس) الخلايا المحفزة بواسطة ياماناكا وطومسون 6،7 بدا في وقت لاحق لتقديم الحلول: هذه الخلايا لها القدرة على النمو إلى أجل غير مسمى والقدرة على إعطاء ترتفع إلى جميع مشتقات الخلية من الطبقات الجرثومية الثلاث، بما في ذلك اتفاقية الأنواع المهاجرة. استخدام خلايا الجذع يقدم المزيد من المزايا: مشتق من خلايا بالغة ذاتي، وأنها تحمل نفس الجينوم كما الفرد أو المريض من التي تشتق منها. وبالتالي يسمح بتطوير نماذج في المختبر أن تسهيل التحقيق في الأمراض وآليات التنمية الجينية البشرية. في فضيلة من هذه الخاصية، يمكن خلايا الجذع أيضا سمشاكل vercome المتعلقة الرفض المناعي والقضايا الأخلاقية 8. لهذه الأسباب، على الرغم من المجالس الاقتصادية والاجتماعية لا تزال تمثل المعيار الذهبي في مجال بيولوجيا الخلايا الجذعية، والباحثين في جميع أنحاء العالم تتجه الآن نحو مزيد من تكنولوجيا خلايا الجذع.
ويجري الآن توظيف خلايا الجذع لنموذج المرض البشري في المختبر لمختلف الظروف، بما في ذلك اضطرابات القلب والأوعية الدموية الخلقية 9،10. في الآونة الأخيرة، وقد تم تنفيذ تطبيق الجذع خلية النمذجة المرض لالأحادية الجين اضطرابات القلب (أي متلازمات QT طويلة، كاتيكولاميني متعددة الأشكال تسرع القلب البطيني) وأمراض في القلب العيوب التي هي جزء من النمط الظاهري المعقدة (مثل ليوبارد ومتلازمات تيموثي، تمدد عضلة القلب). وأكدت هذه التقارير أن الخلايا المحفزة المريض محددة أن يتم التمييز في مضادة عرض الخصائص المظهرية والوظيفية مشابهة لهذا المرض في الجسم الحي.
ومع ذلك، هناكلا تزال العديد من التحديات لتحسين فعالية تحريض خلايا الجذع في النسب القلب. جيل عفوية اتفاقية الأنواع المهاجرة من المجالس الاقتصادية والاجتماعية الإنسان عبر تشكيل التجميعية دعا الهيئات مضغي الشكل (EBS) أثبتت نجاح 17. منذ هذا الاكتشاف، تم اقتراح العديد من الطرق الأخرى. وقد عززت العديد من الجماعات كثيرا من كفاءة بروتوكول التمايز وانتقلوا نحو الكواشف ثقافة محددة كيميائيا وخالية من المنتجات الحيوانية (انظر التمثيل الصامت، C.، وآخرون، بحوث تداول (2012) لإجراء استعراض شامل لجميع الأساليب القائمة 3 ).
ومع ذلك، فإن الأسلوب الكلاسيكي على أساس تجميع EB لا يزال يمثل الأكثر استخداما لإجراء الدراسات الفنية والتحقيق في آليات المرض. ويستند لدينا البروتوكول المقترح على تجميع خلايا الجذع في EBS والثقافة في وجود حمض الاسكوربيك والمصل، وهو ما ثبت لتعزيز عملية تمايز القلب وصتؤثر sitively نضوج هذه الخلايا 18،19. في هذه المقالة سوف تذهب من خلال هذه المنهجية بالتفصيل وسوف تظهر كيفية استخدام خالية من تغذية خطوط الخلايا المحفزة لتوليد المريض محددة IPS-مشتقة اتفاقية الأنواع المهاجرة.
الخلايا الجذعية المحفزة لديها القدرة على التفريق بصورة عفوية إلى CMS، ولو مع انخفاض كفاءة والتباين الشديد بين السطور. ولذلك فقد ركزت تطوير طرق تحريض رواية على تحسين كفاءة العملية والتحرك نحو بروتوكولات أكثر تحديدا. ومع ذلك، فإن معظم هذه الأساليب التمايز جديدة معقدة ج…
The authors have nothing to disclose.
كان مدعوما من قبل جامعة BS من برنامج تدريب ميلان صيف بيكوكا بحوث الطلاب؛ وأيد البحوث من أموال الوزارة الإيطالية الصحة ووزارة التربية والتعليم الإيطالية، جامعة والبحوث وFONDAZIONE Humanitas إلى GC، ونحن بفضل مايكل VG لاترونيكو لقراءة نقدية لل مخطوطة.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Media and Reagents | |||
Human ESC-qualified Matrix | BD Biosciences | 354277 | Thaw the 5 ml bottle at 4 °C on ice O/N, aliquot in pre-chilled cryo-tubes on ice, according to the data sheet dilution instructions and store at -20 °C . |
Fibronectin, from human plasma, 0.1% solution | Sigma | F0896-2MG | Working concentration: 5 μg/cm2 |
Laminin | Sigma | L2020-1MG | Working concentration: 5 μg/cm2 |
PBS (no Mg and Ca), 10X | Lonza | BE17-515F | |
PBS (with Mg and Ca), 10X | Bio Sera | XC-S2067/500 | |
Dispase II, neutral protease, grade II | Roche | 4942078001 | Stock: 10 mg/ml in DMEM-F12 at -20 °C, working solution: 1 mg/ml in PBS (no Mg/Ca) |
Trypsin/EDTA, 0.5% | Sigma | T3924 | |
Collagenase type 2 | Worthington | 4176 | Dilute to 480 U/ml (e.g. 1.6 mg/ml) in PBS with Mg and Ca |
DMEM-F12 | Life Technologies | 21331-020 | |
Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | |
Knockout Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828-028 | Thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C |
Foetal Bovine Serum (origin South America) | Invitrogen | 10270-106 | Batches should be tested for their cardiogenic potential. Thaw at 4 °C, heat-inactivate at 56 °C for 30 min, aliquot and store at -20 °C |
PenStrep, penicillin-Streptomycin, 100X | Life Technologies | 15140-122 | |
GlutaMAX, 100X | Life Technologies | 35050-038 | |
MEM NEAA, 100X | Invitrogen | 11140-135 | |
N2 supplement, 100X | Life Technologies | 17502-048 | |
B27 supplement, 50X | Life Technologies | 12587-010 | |
2-mercaptoethanol | Invitrogen | 31350-010 | |
Gelatin, from porcine skin | Sigma | G1890-100G | Make stock at 1% in water, store at -20 °C. Dilute to 0.1% in PBS and keep at 4 °C |
mTeSR1 | Stem Cell Technologies | 5850 | Combine Supplement 5X with the basic medium, aliquot and store at -20 °C. Do not keep complete medium at 4 °C for more than 1 week |
Nutristem hESC XF | Stemgent from Biological Industries | 05-100-1A | Thaw at 4 °C O/N, aliquot and store at -20 °C until use. Aliquots may be kept at 4 °C for no more than a week. |
mFreSR | Stem Cell Technologies | 5853 | |
Ascorbic acid | Sigma | A4544-25G | Prepare stocks at 10 mg/ml in water. Store aliquots at -20 °C in the dark. Add to EBM at the final concentration (500X) |
Plasticware | |||
35 mm culture dishes | Becton Dickinson | 353001 | |
Cell scraper | Corning Incorporated | 3008 | |
12-well plates | Becton Dickinson | 353043 | |
Permanox 2-well chamber slides | Thermo Fisher Scientific | 177437 | |
Glass 2-well chamber slides | Thermo Fisher Scientific | 177380 | |
6-well plates, ultra-low-attachment surface | Corning Incorporated | 3471 | |
18G needle | Becton Dickinson | 304622 | |
Glass pasteur pipettes, 230 mm | VWR International | 612-1702 | |
2.5 ml syringe | Becton Dickinson | 300188 | |
Equipments | |||
IVF Workstation | KSystem, by Nikon | ||
Nikon SMZ1500 Stereomicroscope | Nikon |