मानव cardiomyocytes की पीढ़ी: फीडर से मुक्त मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल से एक भेदभाव प्रोटोकॉल
Summary
Pluripotent स्टेम सेल, भ्रूण या प्रेरित pluripotent स्टेम (आईपीएस) कोशिकाओं, या तो cardiomyocytes सहित मानव विभेदित कोशिकाओं का एक महत्वपूर्ण स्रोत का गठन. यहाँ, हम एक embryoid निकायों आधारित प्रोटोकॉल के माध्यम से कार्यात्मक मानव cardiomyocytes प्राप्त करने के लिए उन्हें इस्तेमाल करने के लिए कैसे दिखा, आईपीएस कोशिकाओं के हृदय की प्रेरण पर ध्यान दिया जाएगा.
Abstract
दिल विकास ड्राइविंग की घटनाओं की जांच के लिए और मानव में दौरे रोगों के लिए अग्रणी आणविक तंत्र का निर्धारण करने के लिए, यह कार्यात्मक मानव cardiomyocytes (सीएम) उत्पन्न करने के लिए सबसे पहले जरूरी है. दवाओं की खोज और विष विज्ञान के अध्ययन में इन कोशिकाओं का उपयोग भी मानव मूल की कोशिकाओं पर पूर्व चिकित्सकीय मान्य होने के लिए हृदय की बीमारियों के इलाज के लिए नई औषधीय अणुओं की अनुमति, अत्यधिक लाभकारी होगा. सीएम के संभावित स्रोतों की, प्रेरित pluripotent स्टेम (आईपीएस) कोशिकाओं वे आसानी से सुलभ मरीज के ऊतकों से सीधे प्राप्त किया जा सकता है, के रूप में सबसे होनहार में से एक हैं और शरीर 1 की सभी प्रकार की कोशिकाओं को जन्म देने के लिए एक आंतरिक क्षमता के अधिकारी. कई तरीकों रासायनिक परिभाषित प्रोटोकॉल 2,3 के लिए शास्त्रीय embryoid निकायों से (ईबीएस) एकत्रीकरण दृष्टिकोण लेकर मुख्यमंत्रियों में आईपीएस कोशिकाओं फर्क के लिए प्रस्तावित किया गया है. इस अनुच्छेद में हम एक ईबीएस आधारित प्रोटोकॉल का प्रस्ताव और शो कैसे इस methoघ कुशलतापूर्वक फीडर से मुक्त आईपीएस कोशिकाओं से कार्यात्मक मुख्यमंत्री की तरह कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए नियोजित किया जा सकता है.
Introduction
ऐतिहासिक, मानव विकास और रोग ड्राइविंग आनुवंशिक और आणविक तंत्र की जांच आनुवंशिक रूप से संशोधित पशु मॉडल की पीढ़ी के आधार पर किया गया है. हालांकि, कई मानव phenotypes के सफलतापूर्वक जिसका मुख्य कारण दो प्रजातियों के बीच मौजूदा जैविक मतभेद के चूहों में दोहराया जा करने में विफल. दूसरी ओर, मानव ऊतकों के लिए उपयोग सीमित हो सकती है और अक्सर पर्याप्त सामग्री में गहराई से प्रायोगिक अध्ययन के लिए प्राप्त करने की अनुमति नहीं है. हृदय जीव विज्ञान के क्षेत्र में इन सीमाओं दोनों से ग्रस्त: मानव हृदय के शरीर क्रिया विज्ञान माउस के उस से काफी अलग है, और हृदय के ऊतकों की एक महत्वपूर्ण मात्रा केवल पोस्टमार्टम या हृदय शल्य चिकित्सा के दौरान पहुँचा जा सकता है. कार्यात्मक मानव मुख्यमंत्रियों के भेदभाव के लिए एक इष्टतम स्रोत ढूँढना इसलिए हृदय जीव विज्ञान में एक केंद्रीय विषय बन गया है, और बहुत प्रयास इस मुद्दे के समाधान के लिए किया गया है. विभिन्न कक्षों प्रकार मैं, प्रस्तावित किया गया हैncluding कंकाल myoblasts, स्थानीय हृदय की स्टेम कोशिकाओं, अस्थि मज्जा कोशिकाओं mononuclear, endothelial पूर्वज, और mesenchymal स्टेम सेल. हालांकि, डेटा 4 अनुरूप नहीं किया गया है कि इन कोशिकाओं का उपयोग कर प्राप्त की.
मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ईएससी) की व्युत्पत्ति पहले 5 और Yamanaka और थॉमसन 6,7 से प्रेरित pluripotent स्टेम (आईपीएस) कोशिकाओं का कर खोज बाद में समाधान प्रदान करने के लिए लग रहा था: इन कोशिकाओं को देने के लिए अनिश्चित काल के लिए विकसित करने की क्षमता और क्षमता है मुख्यमंत्रियों सहित तीन रोगाणु परतों के सभी सेल डेरिवेटिव, वृद्धि करने के लिए. आईपीएस कोशिकाओं के प्रयोग को आगे लाभ प्रदान करता है: ऑटोलॉगस वयस्क कोशिकाओं से व्युत्पन्न किया जा रहा है, वे प्राप्त कर रहे हैं जिसमें से व्यक्ति या रोगी के रूप में एक ही जीनोम ले. वे इसलिए मानव आनुवंशिक रोगों और विकास के तंत्र की जांच की सुविधा है कि इन विट्रो मॉडल में के विकास के लिए अनुमति देते हैं. इस विशेषता के आधार में, आईपीएस कोशिकाओं को भी कर सकते हैं ओप्रतिरक्षा अस्वीकृति और नैतिक मुद्दों 8 से संबंधित vercome समस्याओं. ESCs अभी भी स्टेम कोशिका जीव विज्ञान के क्षेत्र में सोने के मानक का प्रतिनिधित्व करते हैं, भले ही इन कारणों के लिए, शोधकर्ताओं ने दुनिया भर में अब आईपीएस सेल प्रौद्योगिकी की ओर अधिक बढ़ रहे हैं.
आईपीएस कोशिकाओं अब जन्मजात हृदय रोगों 9,10 सहित विभिन्न शर्तों, के लिए इन विट्रो में मानव रोग मॉडल करने के लिए नियोजित किया जा रहा है. हाल ही में, आईपीएस कोशिका रोग मॉडलिंग के आवेदन monogenic हृदय विकारों (यानी लंबी क्यूटी सिंड्रोम, catecholaminergic बहुरूपी ventricular tachycardia) और हृदय दोष के एक जटिल फेनोटाइप (यानी तेंदुए और टिमोथी सिंड्रोम, फैली हुई cardiomyopathy) का हिस्सा हैं जिसमें विकृतियों के लिए प्रदर्शन किया गया है. इन रिपोर्टों के मुख्यमंत्रियों में भेदभाव कर रहे हैं कि रोगी विशेष के आईपीएस कोशिकाओं vivo में रोग के रूप में समान प्ररूपी और कार्यात्मक विशेषताओं को प्रदर्शित की पुष्टि की.
हालांकि, वहाँहृदय वंश में आईपीएस कोशिकाओं उत्प्रेरण की प्रभावकारिता में सुधार करने के लिए अभी भी कई चुनौतियां हैं. कुल गठन के माध्यम से मानव ESCs से सीएम की स्वतःस्फूर्त पीढ़ी embryoid निकायों (ईबीएस) सफल 17 साबित किया है कहा जाता है. इस खोज के बाद से, कई अन्य तरीकों का प्रस्ताव किया गया है. कई समूहों बहुत भेदभाव प्रोटोकॉल की दक्षता में वृद्धि की है और (स्वांग देख, सी, एट अल., सभी मौजूदा तरीकों 3 की व्यापक समीक्षा के लिए वितरण रिसर्च (2012) रासायनिक परिभाषित और पशु उत्पाद से मुक्त संस्कृति अभिकर्मकों की ओर चले गए हैं ).
फिर भी, ईबी एकत्रीकरण पर आधारित शास्त्रीय पद्धति अभी भी सबसे अधिक कार्यात्मक अध्ययन प्रदर्शन और रोग तंत्र की जांच के लिए नियोजित प्रतिनिधित्व करता है. हमारे प्रस्तावित प्रोटोकॉल हृदय भेदभाव प्रक्रिया को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है जो सीरम और एस्कॉर्बिक एसिड, की उपस्थिति में ईबीएस में आईपीएस कोशिकाओं के एकत्रीकरण और संस्कृति पर और पुलिस के लिए आधारित हैsitively इन कोशिकाओं 18,19 की परिपक्वता को प्रभावित. इस लेख में हम विस्तार से इस पद्धति के माध्यम से जाना जाएगा और रोगी विशेष के आईपीएस व्युत्पन्न मुख्यमंत्रियों पैदा करने के लिए फीडर से मुक्त आईपीएस सेल लाइनों का उपयोग कैसे दिखाई देंगे.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pluripotent स्टेम सेल लाइनों के बीच कम क्षमता और उच्च परिवर्तनशीलता के साथ यद्यपि, मुख्यमंत्रियों में अनायास अंतर करने की क्षमता है. उपन्यास शामिल करने के तरीकों का विकास इसलिए प्रक्रिया की दक्षता में सुधार …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
बी एस मिलान Bicocca ग्रीष्मकालीन छात्र रिसर्च ट्रेनिंग प्रोग्राम के विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था, अनुसंधान स्वास्थ्य और इतालवी शिक्षा मंत्रालय, विश्वविद्यालय और जीसी के लिए अनुसंधान और Fondazione Humanitas का इतालवी मंत्रालय के धन से समर्थन किया गया था, हम गंभीर रूप से पढ़ने के लिए माइकल वी.जी. Latronico धन्यवाद पांडुलिपि.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Media and Reagents | |||
| Human ESC-qualified Matrix | BD Biosciences | 354277 | Thaw the 5 ml bottle at 4 °C on ice O/N, aliquot in pre-chilled cryo-tubes on ice, according to the data sheet dilution instructions and store at -20 °C . |
| Fibronectin, from human plasma, 0.1% solution | Sigma | F0896-2MG | Working concentration: 5 μg/cm2 |
| Laminin | Sigma | L2020-1MG | Working concentration: 5 μg/cm2 |
| PBS (no Mg and Ca), 10X | Lonza | BE17-515F | |
| PBS (with Mg and Ca), 10X | Bio Sera | XC-S2067/500 | |
| Dispase II, neutral protease, grade II | Roche | 4942078001 | Stock: 10 mg/ml in DMEM-F12 at -20 °C, working solution: 1 mg/ml in PBS (no Mg/Ca) |
| Trypsin/EDTA, 0.5% | Sigma | T3924 | |
| Collagenase type 2 | Worthington | 4176 | Dilute to 480 U/ml (e.g. 1.6 mg/ml) in PBS with Mg and Ca |
| DMEM-F12 | Life Technologies | 21331-020 | |
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828-028 | Thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C |
| Foetal Bovine Serum (origin South America) | Invitrogen | 10270-106 | Batches should be tested for their cardiogenic potential. Thaw at 4 °C, heat-inactivate at 56 °C for 30 min, aliquot and store at -20 °C |
| PenStrep, penicillin-Streptomycin, 100X | Life Technologies | 15140-122 | |
| GlutaMAX, 100X | Life Technologies | 35050-038 | |
| MEM NEAA, 100X | Invitrogen | 11140-135 | |
| N2 supplement, 100X | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 supplement, 50X | Life Technologies | 12587-010 | |
| 2-mercaptoethanol | Invitrogen | 31350-010 | |
| Gelatin, from porcine skin | Sigma | G1890-100G | Make stock at 1% in water, store at -20 °C. Dilute to 0.1% in PBS and keep at 4 °C |
| mTeSR1 | Stem Cell Technologies | 5850 | Combine Supplement 5X with the basic medium, aliquot and store at -20 °C. Do not keep complete medium at 4 °C for more than 1 week |
| Nutristem hESC XF | Stemgent from Biological Industries | 05-100-1A | Thaw at 4 °C O/N, aliquot and store at -20 °C until use. Aliquots may be kept at 4 °C for no more than a week. |
| mFreSR | Stem Cell Technologies | 5853 | |
| Ascorbic acid | Sigma | A4544-25G | Prepare stocks at 10 mg/ml in water. Store aliquots at -20 °C in the dark. Add to EBM at the final concentration (500X) |
| Plasticware | |||
| 35 mm culture dishes | Becton Dickinson | 353001 | |
| Cell scraper | Corning Incorporated | 3008 | |
| 12-well plates | Becton Dickinson | 353043 | |
| Permanox 2-well chamber slides | Thermo Fisher Scientific | 177437 | |
| Glass 2-well chamber slides | Thermo Fisher Scientific | 177380 | |
| 6-well plates, ultra-low-attachment surface | Corning Incorporated | 3471 | |
| 18G needle | Becton Dickinson | 304622 | |
| Glass pasteur pipettes, 230 mm | VWR International | 612-1702 | |
| 2.5 ml syringe | Becton Dickinson | 300188 | |
| Equipments | |||
| IVF Workstation | KSystem, by Nikon | ||
| Nikon SMZ1500 Stereomicroscope | Nikon |
References
- Di Pasquale, E., Latronico, M. V., Jotti, G. S., Condorelli, G. Lentiviral vectors and cardiovascular diseases: a genetic tool for manipulating cardiomyocyte differentiation and function. Gene Therapy. 19, 642-648 (2012).
- Laflamme, M. A., Murry, C. E. Heart regeneration. Nature. 473, 326-335 (2011).
- Mummery, C. L., et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circulation Research. 111, 344-358 (2012).
- Wu, S. M., Chien, K. R., Mummery, C. Origins and fates of cardiovascular progenitor cells. Cell. 132, 537-543 (2008).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Yamanaka, S. A fresh look at iPS cells. Cell. 137, 13-17 (2009).
- Josowitz, R., Carvajal-Vergara, X., Lemischka, I. R., Gelb, B. D. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as models for genetic cardiovascular disorders. Curr. Opin. Cardiol. 26, 223-229 (2011).
- Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134, 877-886 (2008).
- Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465, 808-812 (2012).
- Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N. Engl. J. Med. 363, 1397-1409 (2010).
- Yazawa, M., et al. Using induced pluripotent stem cells to investigate cardiac phenotypes in Timothy syndrome. Nature. 471, 230-234 (2011).
- Itzhaki, I., et al. Modeling of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia with patient-specific human-induced pluripotent stem cells. Journal of the American College of Cardiology. 60, 990-1000 (2012).
- Jung, C. B., et al. Dantrolene rescues arrhythmogenic RYR2 defect in a patient-specific stem cell model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. EMBO Molecular Medicine. 4, 180-191 (2012).
- Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4, 130ra147 (2012).
- Kehat, I., et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. The Journal of Clinical Investigation. 108, 407-414 (2001).
- Cao, N., et al. Ascorbic acid enhances the cardiac differentiation of induced pluripotent stem cells through promoting the proliferation of cardiac progenitor cells. Cell Research. 22, 219-236 (2012).
- Takahashi, T., et al. Ascorbic acid enhances differentiation of embryonic stem cells into cardiac myocytes. Circulation. 107, 1912-1916 (2003).
- Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N. Engl. J. Med. 363, 1397-1409 (2011).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25, 681-686 (2007).
