Summary
Células-tronco pluripotentes, tanto as células-tronco embrionárias ou pluripotentes induzidas (iPS), constituem uma valiosa fonte de células diferenciadas humanos, incluindo os cardiomiócitos. Aqui, vamos nos concentrar na indução cardíaco de células iPS, mostrando como usá-los para obter os cardiomiócitos humanos funcionais através de um protocolo de corpos baseada embryoid.
Abstract
A fim de investigar os eventos de promoção do desenvolvimento do coração e para determinar os mecanismos moleculares que conduzem a doenças do miocárdio em seres humanos, é necessário, antes de gerar cardiomiócitos humanos funcionais (CMS). A utilização destas células na descoberta de medicamentos e estudos de toxicologia é também altamente benéfico, permitindo novas moléculas farmacológicas para o tratamento de desordens cardíacas a ser pré-clinicamente validado em células de origem humana. Dos possíveis fontes de CMS, células estaminais pluripotentes induzidas (iPS) estão entre os mais promissores, como elas podem ser derivadas directamente a partir de tecido do paciente facilmente acessíveis e possuir uma capacidade intrínseca para dar origem a todos os tipos de células do corpo 1. Foram propostos vários métodos para diferenciar as células iPS em CMs, desde os corpos embrióides clássicos (EBS) abordagem de agregação de protocolos de constituição química definida 2,3. Neste artigo, propomos um protocolo baseado em EBs e mostrar como este metodod podem ser empregues para gerar eficientemente células CM-funcionais, como a partir de células iPS alimentador livres.
Introduction
Historicamente, a investigação dos mecanismos genéticos e moleculares de promoção do desenvolvimento humano e da doença tem sido baseados na geração de modelos animais geneticamente modificados. No entanto, vários fenótipos humanos não ser replicado com sucesso em ratos, principalmente por causa das diferenças biológicas existentes entre as duas espécies. Por outro lado, o acesso aos tecidos humanos podem ser limitados e muitas vezes não o suficiente para permitir que o material seja obtido em estudos experimentais em profundidade. O campo da biologia cardiovascular sofre de ambas as seguintes limitações: a fisiologia do coração humano é significativamente diferente da do rato, e uma quantidade significativa de tecido do coração é acessível apenas post-mortem ou durante a cirurgia cardíaca. Encontrar uma fonte ideal para a diferenciação funcional CMs humana tornou-se assim um tópico central na biologia cardiovascular, e tem sido feito muito esforço para resolver este problema. Têm sido propostos vários tipos de células, imioblastos esqueléticos ncluding, células cardíacas locais estaminais, células mononucleares de medula óssea, células progenitoras endoteliais, e de células estaminais mesenquimais. No entanto, os dados obtidos usando estas células não foram consistentes 4.
A derivação de células estaminais embrionárias humanas (ESC) 5 primeiros ea descoberta inovadora de células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) por Yamanaka e Thomson 6,7 tarde parecia fornecer soluções: estas células têm a capacidade de crescer indefinidamente e o potencial para dar subir a todos os derivados de células de as três camadas germinais, incluindo o MC. A utilização de células iPS oferece ainda outras vantagens: sendo derivadas de células adultas autólogas, que carregam o mesmo genoma que o indivíduo ou paciente a partir do qual eles são derivados. Por conseguinte, permitem o desenvolvimento de modelos in vitro que facilitam a investigação de doenças e dos mecanismos de desenvolvimento genéticas humanas. Em virtude dessa característica, as células iPS também pode overcome problemas relacionados à rejeição imunológica e questões éticas 8. Por estas razões, embora CES ainda representam o padrão ouro no campo da biologia de células-tronco, pesquisadores do mundo inteiro estão agora movendo-se mais para a tecnologia de células iPS.
iPS estão agora a ser utilizados para modelar doenças humanas in vitro para várias condições, incluindo desordens cardiovasculares congénitos 9,10. Recentemente, a aplicação da modelagem de doença das células iPS foi realizado para doenças cardíacas monogênicas (ou seja, longos síndromes do QT, taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgico) e patologias em que os defeitos cardíacos fazem parte de um fenótipo complexo (ie Leopard e síndromes Timóteo, cardiomiopatia dilatada). Estes relatórios confirmaram que as células iPS específicas do paciente, que são diferenciadas em CMs apresentam características fenotípicas e funcionais semelhantes como a doença in vivo.
No entanto, existemainda muitos desafios para melhorar a eficácia de induzir as células iPS na linhagem cardíaca. Geração espontânea de CMs do CES humanos através de formação de agregados chamados corpos embrióides (EBS) provaram 17 bem-sucedida. Desde esta descoberta, têm sido propostos muitos outros métodos. Muitos grupos têm melhorado muito a eficiência do protocolo de diferenciação e deslocaram-se para os reagentes cultura quimicamente definidos e produtos de origem animal-free (veja Mummery, C., et al., Circulation Research (2012) para uma revisão completa de todos os métodos existentes 3 ).
No entanto, o método clássico baseado na EB agregação ainda representa o mais comumente empregado para a realização de estudos funcionais e investigar os mecanismos da doença. Nosso protocolo proposto é baseado na agregação de células iPS em EB e da cultura, na presença de soro e de ácido ascórbico, a qual foi mostrada para aumentar o processo de diferenciação cardíaca e positively impactar a maturação destas células 18,19. Neste artigo, vamos passar por essa metodologia em detalhe e vai mostrar como usar linhas de células iPS alimentador livres para gerar paciente específico CMs iPS derivadas.
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Protocol
1. Manutenção Feeder livre e Passaging de linhagens de células iPS humanas
- Preparar os pratos Matrigel revestidos. Descongelar um frasco de Matriz CES qualificado humano em gelo durante uma hora e dilua em 25 ml de meio DMEM-F12. Adicionar 1 ml de cada uma das placas 35 mm (ou quantidades equivalentes por unidade de área de superfície, se são utilizados outros pratos), mantendo-se tudo em gelo e assegurando que todas as placas e tubos são pré-arrefecida. Cubra as placas com papel alumínio.
Nota: As concentrações variam de acordo com imagens de Matrigel do lote. Instruções de diluição são indicados na folha de dados.
- Manter as placas em gelo durante a noite e remover o gelo no dia seguinte. As placas podem ser mantidas no frigorífico até uma semana antes da utilização.
- Preparar o meio completo mTESR1 (ou descongelar um frasco de meio de Nutristem) e o H-ESM (médio CES humana), de acordo com a tabela abaixo.
H-ESM CONC FINAL Por 500 ml Knockout Serum Replacement (KSR) 20% 100 ml GlutaMAX 100X 2mM 5 ml Não essenciais MEM aminoácidos 0,1 mM 5 ml Penicilina-estreptomicina 100 U / mL - 0,1 mg / mL 5 ml 2-mercaptoetanol 0,1 mM 900 mL B27 Suplemento - sem Vitamina 1% 10 ml N2 Supplement 1% 5 ml Knockout DMEM - 370 ml
Banco de meio pode ser armazenado a 4 ° C durante não mais de 2 semanas. Para preparar o meio de crescimento completo, o FGF básico é adicionado imediatamente antes da suaalimentação e numa concentração final de 20 ng / ml.
Nota: Complete H-ESM condicionado em fibroblastos de rato embrionárias podem ser usados em vez de mTESR1 ou Nutristem para as células iPS.
- Colocar as placas revestidas em uma incubadora a 37 ° C durante 30 minutos a 2 horas antes da passaging.
- As células devem ser passadas aproximadamente a cada 5 dias, ainda que não tenham atingido a confluência. Colônias não devem tocar.
- Substituir o meio de crescimento com 1 ml de dispase (1 mg / ml, dissolver de um mg / ml de stock 10 em PBS).
- Remover diferenciar áreas com puxados pipetas Pasteur de vidro. As áreas que devem ser removidos incluem estruturas em cratera cística ou no centro de colónias, e quaisquer áreas onde as células foram separadas a partir de colónias e achatada e parecem estar a migrar para fora.
- Incubar a 37 ° C, sob uma capa de cultura até as fronteiras de colónias tornam-se mais brilhante e começar a separar (normalmente cerca de 5-7 minutos). Discard dispase. Lavar com 1 ml H-ESM e descartar.
- Em 1 ml H-ESM, use um levantador de celular (espátula como raspador) para colônias de colheita e recolher em um tubo Eppendorf de 15 ml. Lavar com 1 ml de H-AGE e adicionar ao tubo. Girar a 1,000 rcf durante 4 min e remover o sobrenadante.
- Ressuspender o sedimento em 1 ml de meio de crescimento pré-aquecido (ou mTESR1 ou Nutristem). Evite quebrar pedaços muito - pipeta cima e para baixo, com menos de 6-8x. Determine quantas células deve ser banhado e remover as células desnecessárias (geralmente 1:04 ou 1:05 diluição), por exemplo, para duas placas de 1:5, remover 600 mL, em seguida, adicionar 1,6 ml de meio fresco.
- Remover Matrigel a partir de placas. Células lugar gota a gota, distribuindo uniformemente sobre a placa. Evite apertar o tubo em excesso, pois isso fará com que as células a se mover em direção ao centro.
- Lave tubo com 1 ml de meio e dividir entre as placas. O volume final em cada uma das placas deve ser de 1,5 -2 mL.
- Alterar meio todos os dias, exceto no dia seguinte passaging. Embora sejaideal para mudar o meio de todos os dias, isso pode ser mudado ocasionalmente com uma freqüência de uma vez a cada dois dias, se não mais de 2-3 dias se passaram desde a última passagem sem afetar o potencial de pluripotência e diferenciação.
- Se a linha de célula deve ser congelado, voltar a suspender em vez em 1-2 ml de meio de congelação mFreSR usando uma pipeta de 2 ml e colocar 1 ml / cryovial. Colocar os frascos num cryobox a -80 ° C e a transferência de azoto líquido em 3-4 dias.
Nota: microdissecção manual de células iPS deve ser realizada sob um microscópio estereoscópico. A fertilização in vitro (FIV) da estação de trabalho (por exemplo uma estação de trabalho de FIV KSystem) integrado com um estereomicroscópio permite a manipulação das células em condições estéreis, enquanto que eles são mantidos em uma área de superfície aquecida. Se este não está disponível, um estereomicroscópio pode ser transportada sob uma capa habitual de fluxo laminar.
2. Embryoid Corpos Agregação e Cardiac Induction
- Prepara EBM-20 meio de acordo com a tabela abaixo.
EBM-20 CONC FINAL Por 500 ml Soro fetal bovino (origem América do Sul) 20% 100 ml Aminoácidos não essenciais MEM 0,1 mM 5 ml Penicilina - estreptomicina 100U/ml - 0,1 mg / mL 5 ml GlutaMAX 100X 0,1 mM 5 ml 2-mercaptoetanol 50um 450 mL DMEM/F12 - 385 ml
Utilização de FBS da América do Sul origem é crítico para a determinação da eficiência de diferenciação: o emprego de outros tipos de soros podem afectaro processo de diferenciação. Para preparar EBM-20, ácido ascórbico complemento completo (AA), a uma concentração final de 50 ug / ml. Meio de crescimento completo pode ser armazenado a 4 ° C durante não mais do que uma semana. - Colheita iPS colónias tal como descrito acima (etapas 1,6-1,9).
- Ressuspender suavemente em 1 ml de EBM-20 com uma pipeta de 2 ml. Evite quebrar pedaços muito - pipeta cima e para baixo, não mais do que 2 a 3 vezes, verificar o tamanho das colônias sob o microscópio estereoscópico. Placa em placas ultra-baixas de fixação na proporção de 1:1 (por exemplo, por um prato de 35 mm, utilizar um poço de uma placa de 6 poços). Enxaguar tubo com 1 mL de EBM-20 e adicionar ao prato.
Nota: O tamanho das colónias de afectar o processo de diferenciação, controlar a eficiência e tempo de indução cardíaca. Agregação de homogeneamente médias EB foram mostrados para reduzir a variabilidade observada durante a diferenciação.
- No dia 3, alterar EBM-20 uma vez usando um microscópio para evitar removal da EBS. Mantenha pipeta junto da borda do prato e retire médio.
- Nos dias 7, interruptor EBS para placas revestidas com gelatina a 0,1% e previamente colocada a 37 ° C durante 30 min. Se necessário, a gelatina pode ser removido e as placas deixada sob um capuz de cultura de células S / N. Adicionar 35-40 EBs por 35 milímetros prato.
- Verifique EBs para bater áreas e mudança EBM-20 duas vezes por semana. Marque áreas onde batendo estão localizados na parte superior da tampa do prato, para facilitar a localização em que o microscópio estereoscópico. Áreas contratantes deve aparecer após cerca de 10-20 dias.
- Quando as áreas com contração espontânea aparecer, mude de médio a EBM-2 (como preparar EBM-20, com 2% de FBS vez) e isolá-los, conforme descrito abaixo na seção 3.
- Continue a verificar outras áreas para bater e mudar média duas vezes por semana até áreas batendo são necessários para novas experiências.
Nota: A eficiência do processo de diferenciação é altamente dependentevários factores, o mais importante dos quais são as linhas de células específicas e o lote de soro usado para induzir a diferenciação cardíaca. Para se obter a máxima eficiência, as linhas celulares de teste para potencial cardiomiogênica e vários lotes de soro.
3. Batendo áreas de isolamento e Cultura
- Casaco placas de 12 poços (4 cm 2 de área) ou as placas de interesse com 5 ug / cm 2, fibronectina diluída em PBS para perfazer o volume suficiente para cobrir toda a superfície completamente (total de 300 ul por poço em placas de 12 poços). Mantenha descoberto na capa de cultura de células e deixe secar. As placas podem ser embalados e armazenados a 4 ° CO / N.
- Remover área utilizando um copo de bater puxado pipeta Pasteur e bisturi, conforme necessário. Transfira para placas revestidas com fibronectina com um pipeta de 1 ml.
- Adicionar 1 mL de EBM-2.
- Atravessar fora da placa para indicar as áreas onde as células foram removidas e mudar o meio. As placas podem ser mantidos por até 1 mês, como outras áreas podem começar bcomer mais tarde.
Nota: Se forem necessários pedaços menores batendo, pipetar a área explantada cima e para baixo várias vezes sob a lupa, até que quebre em pedaços menores. Isto irá resultar em aglomerados de algumas células batimento (ver o filme 3).
- Mudar meio duas vezes por semana até que esteja pronto para as análises.
Nota: Os cardiomiócitos obtidos com este protocolo, possuem características morfológicas e funcionais semelhantes fetal; maturação para um adulto fenótipo semelhante pode ser obtido através do aumento do tempo em cultura para diferenciar ainda mais essas células.
4. Único batendo celas de isolamento e Análise
- Casaco lâminas 2-câmara (4 cm 2 de área) ou outros suportes apropriados, com 5 ug / cm 2 fibronectina diluído em PBS suficiente para cobrir toda a superfície de cultura. Se for usado um suporte de vidro, revestimento com laminina e fibronectina (5 ug / cm <sup> 2 cada).
- Remover área batendo com uma pipeta de Pasteur / bisturi a partir das placas da secção 3.
- Utilizando uma pipeta de 1 ml, transferir as células para um tubo de 15 ml contendo 500 ul de colagenase II (480 U / ml em PBS com Ca e Mg) e incubar 15 min a 37 ° C, agitando o tubo, uma vez durante a incubação.
- Pipeta cima e para baixo com uma pipeta de 200 mL. Se qualquer aglomerados permanecer, a transferência para novo colagenase II e repita o passo 4.3.
- Repita o passo 4.4 até que não haja grandes aglomerações são deixados.
- Inativar colagenase com 3 ml de EBM-2 (sem AA). O tubo pode ser deixado sob o capô em um rack aquecida até outros tubos estão prontos. Centrifugar a 1000 rcf durante 4 min.
- Ressuspender o sedimento em 1 ml de 0,25% de tripsina / EDTA (diluído a partir de um estoque a 0,5% em PBS 1X) e incubar a 37 ° C durante 5 min. Combinar as fracções a partir de digestões com a mesma amostra inicial.
- Inativar tripsina com 4 ml de EBM-2 (sem AA). Passe as células através de uma agulha de 18G em uma seringa de 2,5 ml não mais than 7x. Centrifugar a 1000 rcf durante 4 min.
- Ressuspender o sedimento de células em 1 ml de EBM-2 por poço e a placa. As células podem ser usadas para análises funcionais e morfológicas de 2-3 dias após o plaqueamento.
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Representative Results
Em nossos estudos geramos CMs de várias linhagens de células iPS. Estas linhas foram geradas inicialmente numa camada alimentadora MEF mas foram imediatamente colocadas em Matrigel utilizando um meio quimicamente definido (ou mTESR1 ou Nutristem). Vários ensaios foram usados para verificar a manutenção das propriedades morfológicas, a expressão de marcadores típicos de células pluripotentes (OCT-4, e SSEA4 TRA1-60) e à sua estabilidade do genoma (figura 1).
Indução na linhagem cardíaco foi provocado por agregação de células iPS em EB e da cultura, na presença de um tipo específico de soro e AA (Figuras 2A e 2B). Áreas contratantes representada 20-35% do total, dependendo da linha celular utilizada (Figura 2C e um filme). Contratante CMs isoladas dessas regiões por digestão enzimática (Movie 2) expressaram proteínas estruturais dos cardiomiócitos típicos (troponina, e alphum; sarcomérica actina, miosina cadeias pesadas α e β), proteínas de junções de hiato (conexina 43), sendo os grandes canais de iões (Figuras 2D-2F). Análise electrofisiológica dessas células revelaram uma população heterogénea compreendendo células com nodal, fibrilação, e perfis ventriculares (dados não mostrados, priori, SG et ai. J. Clin. Invest., In Press, 14,15,20).
Figura 1. Feeder livre de células iPS manutenção não afeta a pluripotência. AB) iPS colônias cultivadas em Matrigel manter a sua humano ESC-como morfologia, com bordas fase brilhantes e nucléolos proeminentes. CD) análises de imunofluorescência mostrando células iPS expressar corretamente o fator de transcrição OCT-4 (C)e o antigénio de superfície TRA1-60 (barras de escala: 50 mM). (D) (E) análise de citometria de fluxo confirmou que a expressão de antigénios de superfície de pluripotência típicas (SSEA-4 e TRA1-60). A estratégia de gating é mostrado pela dispersão esquerda. (F) análise do cariótipo Representante de células iPS cultivadas em Matrigel. Clique aqui para ver a figura maior .
Figura 2. Diferenciação funcional de CMs iPS derivadas. A) Representação esquemática do protocolo de diferenciação. B) corpos embrióides agregados de células iPS. C) Representação de uma área de contração. D) RT-PCR mostramção a expressão de alguns canais iônicos específicos cardíaca pelos iPS derivadas aglomerados batendo (CACNA1A - canal de cálcio, voltagem dependente, subunidade alfa 1A; SCN5A - canal de sódio voltagem-dependentes, tipo V, subunidade alfa; KCNQ1 - tensão de potássio canal fechado, como KQT subfamília, membro 1), e ambas as formas de cadeia pesada de miosina (MHC-um e MHC-b). Nenhuma expressão foi detectada em células iPS, enquanto que ADNc a partir de células de coração fetal foi utilizado como um controlo positivo. HGPRT foi utilizado como gene de arrumação. EF) imunofluorescência mostrando único iPS derivado MC que expressa a proteína estrutural de actina α-sarcomérica, troponina I cardíaca (TNNI), eo cardíacas específicas junção conexina 43 (CNX-43). Barras de escala: 50 ^ m. As imagens foram adquiridas utilizando um Axiovision Zeiss microscópio de fluorescência invertido e analisados com ImageJ. Clique aqui para ver a figura maior .
<strong> Filme 1. Área derivadas de células iPS Contratante. Clique aqui para ver filme.
Filme 2. Único contratação iPS derivadas CMs, obtido a partir da digestão enzimática de uma área de contratação. Clique aqui para ver filme.
Filme 3. Conjunto contratação Pequeno, obtida por dissecção mecânica parcial. Clique aqui para ver filme.
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Discussion
As células estaminais pluripotentes têm o potencial para se diferenciar espontaneamente em CMs, embora com eficiência baixa e alta variabilidade entre linhas. O desenvolvimento de novos métodos de indução tem, portanto, destinado a melhorar a eficiência do processo e movendo-se para mais protocolos definidos. No entanto, a maioria destes novos métodos de diferenciação são bastante complexas, exigindo condições de elaborar a cultura, um bom controle de tempo e concentração de reagentes e tratamento com citocinas caros e fatores de crescimento. Além disso, as diferenças em níveis endógenos de sinalização de citocina de várias linhas de células iPS tornar difícil para padronizar as concentrações de citoquinas, que muitas vezes tem de ser ajustado para níveis adequados para cada linha celular.
Maturação do obtido CMs iPS derivadas também representa um aspecto crítico a considerar quando se tenta cardíaca diferenciação de células iPS para a modelagem de doenças e aplicações de descoberta de drogas. A difeião de CES humanos e células iPS geralmente dá origem a MC com um fenótipo fetal ou seja, sem uma estrutura completamente madura. Isto é particularmente verdadeiro quando são usados métodos de monocamada, e como resultado, estes são mais apropriados para gerar, amplificar e isolar populações específicas progenitoras cardíacas 2,3.
Neste cenário, o método de agregação EBs "clássica", que ainda é amplamente utilizado para fins de modelagem de doenças, parece melhor se adequar às necessidades experimentais. Este método é simples, econômico, facilmente praticável e adequado para todas as linhas. Não há necessidade de factores de crescimento ou citocinas adicionais, ou para a digestão de uma única célula, o que muitas vezes não são muito bem toleradas pelas células iPS; também, eles exigem tratamentos adicionais com inibidores ROCHA 21. Além disso, a agregação em EBS assemelha ao processo natural de desenvolvimento de uma célula pluripotente, com o fornecimento de um ambiente de EBs 3-dimensional e nCrine sinais que são mais compatíveis com as condições fisiológicas. Além disso, a adição de AA tem sido demonstrado de forma consistente para melhorar a diferenciação de células iPS cardíaca, e também para melhorar a sua maturação estrutural e funcional 18,19. Escolhendo iPS linhas de células com base no seu potencial cardiogénico, juntamente com a selecção de um lote mais adequada de soro, pode melhorar a eficiência de geração de CM.
Finalmente, o método aqui proposto tem também a vantagem de não necessitar de células alimentadoras do mouse, o que elimina a possibilidade de contaminação com células de camundongo e também simplifica ainda mais os procedimentos técnicos para a célula iPS passaging e formação EBS. Este método confere inúmeras vantagens e constitui uma melhoria significativa em relação às técnicas anteriores, abrindo o caminho para futuras aplicações de medicina regenerativa cardiovasculares.
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Disclosures
Não há interesses financeiros para divulgar.
Acknowledgments
BS foi apoiado pela Universidade de Milão-Bicocca Verão Student programa de investigação, a investigação contou com o apoio de fundos do Ministério italiano da Saúde e Ministério da Educação italiano, Universidade e Pesquisa e Fondazione Humanitas para GC; que graças Michael VG Latronico para ler criticamente a manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and Reagents | |||
| Human ESC-qualified Matrix | BD Biosciences | 354277 | Thaw the 5 ml bottle at 4 °C on ice O/N, aliquot in pre-chilled cryo-tubes on ice, according to the data sheet dilution instructions and store at -20 °C . |
| Fibronectin, from human plasma, 0.1% solution | Sigma | F0896-2MG | Working concentration: 5 μg/cm2 |
| Laminin | Sigma | L2020-1MG | Working concentration: 5 μg/cm2 |
| PBS (no Mg and Ca), 10X | Lonza | BE17-515F | |
| PBS (with Mg and Ca), 10X | Bio Sera | XC-S2067/500 | |
| Dispase II, neutral protease, grade II | Roche | 4942078001 | Stock: 10 mg/ml in DMEM-F12 at -20 °C, working solution: 1 mg/ml in PBS (no Mg/Ca) |
| Trypsin/EDTA, 0.5% | Sigma | T3924 | |
| Collagenase type 2 | Worthington | 4176 | Dilute to 480 U/ml (e.g. 1.6 mg/ml) in PBS with Mg and Ca |
| DMEM-F12 | Life Technologies | 21331-020 | |
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828-028 | Thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C |
| F–tal Bovine Serum (origin South America) | Invitrogen | 10270-106 | Batches should be tested for their cardiogenic potential. Thaw at 4 °C, heat-inactivate at 56 °C for 30 min, aliquot and store at -20 °C |
| PenStrep, penicillin-Streptomycin, 100X | Life Technologies | 15140-122 | |
| GlutaMAX, 100X | Life Technologies | 35050-038 | |
| MEM NEAA, 100X | Invitrogen | 11140-135 | |
| N2 supplement, 100X | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 supplement, 50X | Life Technologies | 12587-010 | |
| 2-mercapt–thanol | Invitrogen | 31350-010 | |
| Gelatin, from porcine skin | Sigma | G1890-100G | Make stock at 1% in water, store at -20 °C. Dilute to 0.1% in PBS and keep at 4 °C |
| mTeSR1 | Stem Cell Technologies | 5850 | Combine Supplement 5X with the basic medium, aliquot and store at -20 °C. Do not keep complete medium at 4 °C for more than 1 week |
| Nutristem hESC XF | Stemgent from Biological Industries | 05-100-1A | Thaw at 4 °C O/N, aliquot and store at -20 °C until use. Aliquots may be kept at 4 °C for no more than a week. |
| mFreSR | Stem Cell Technologies | 5853 | |
| Ascorbic acid | Sigma | A4544-25G | Prepare stocks at 10 mg/ml in water. Store aliquots at -20 °C in the dark. Add to EBM at the final concentration (500X) |
| Plasticware | |||
| 35 mm culture dishes | Becton Dickinson | 353001 | |
| Cell scraper | Corning Incorporated | 3008 | |
| 12-well plates | Becton Dickinson | 353043 | |
| Permanox 2-well chamber slides | Thermo Fisher Scientific | 177437 | |
| Glass 2-well chamber slides | Thermo Fisher Scientific | 177380 | |
| 6-well plates, ultra-low-attachment surface | Corning Incorporated | 3471 | |
| 18G needle | Becton Dickinson | 304622 | |
| Glass pasteur pipettes, 230 mm | VWR International | 612-1702 | |
| 2.5 ml syringe | Becton Dickinson | 300188 | |
| Equipments | |||
| IVF Workstation | KSystem, by Nikon | ||
| Nikon SMZ1500 Stereomicroscope | Nikon | ||
References
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